張金花，劉陶世，程建明，畢肖林，錢海峰，陳冬冬

南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210046

多指標(biāo)綜合評(píng)分法優(yōu)選三拗湯提取工藝研究

張金花，劉陶世，程建明，畢肖林，錢海峰，陳冬冬

南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210046

目的 采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定三拗湯提取液中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷和甘草酸4種有效成分的含量，優(yōu)選三拗湯最佳提取工藝條件。方法 采用正交試驗(yàn)，以加水量、煎煮時(shí)間和煎煮次數(shù)為考察因素，以鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷和甘草酸轉(zhuǎn)移率以及出膏率為考察指標(biāo)，進(jìn)行多指標(biāo)綜合評(píng)分。結(jié)果 三拗湯提取影響因素依次為煎煮次數(shù)＞煎煮時(shí)間＞加水量。最佳提取工藝條件為加10倍量水，煎煮3次，每次1 h。結(jié)論 本研究?jī)?yōu)選得到的提取工藝穩(wěn)定可行。

三拗湯；正交試驗(yàn)；提取工藝

三拗湯源于張仲景還魂湯，后被《太平惠民和劑局方》收錄，功效宣肺解表、止咳平喘[1]。為最大化提取方藥有效成分加以利用[2]，本研究建立高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測(cè)定三拗湯提取液中4種有效成分方法，并結(jié)合正交試驗(yàn)篩選最佳提取工藝條件，為三拗湯新劑型研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Waters e2695高效液相色譜儀（包括在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、2998紫外檢測(cè)器），十萬(wàn)分之一電子分析天平（METTLER TOLEDO），Anke TGL-16G型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

麻黃、苦杏仁、甘草購(gòu)自亳州市京皖中藥飲片廠，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)劉圣金教授檢測(cè)均符合2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）規(guī)定。對(duì)照品鹽酸麻黃堿（批號(hào)171241-201007）、鹽酸偽麻黃堿（批號(hào)171238-201207）、苦杏仁苷（批號(hào)820-200002）、甘草酸銨（批號(hào)110731-200511），中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，磷酸為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷和甘草酸含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈為流動(dòng)相A，0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷在208 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，甘草酸銨在250 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，柱溫30 ℃，色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件（%）

圖1 三拗湯提取液中4種有效成分HPLC圖

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷和甘草酸銨對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含43.7 μg鹽酸麻黃堿、42.9 μg鹽酸偽麻黃堿、202.1 μg苦杏仁苷和203 μg甘草酸銨的混合溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密量取提取液1 mL，加甲醇3 mL混勻，15 000 r/min離心10 min，上清液過(guò)0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 取上述混合對(duì)照品溶液，精密取混合照品溶液2、4、8、10、20 μL，注入液相色譜儀，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：鹽酸麻黃堿Y＝2.4×106X－9575，r＝0.999 5；鹽酸偽麻黃堿Y＝2.5×106X－21 735，r＝0.999 5；苦杏仁苷Y＝4.7×106X＋45 295，r＝0.999 6；甘草酸銨Y＝7.6×105X＋10 028，r＝0.999 8。結(jié)果表明，鹽酸麻黃堿在0.087 4～0.874 μg呈良好線性關(guān)系，鹽酸偽麻黃堿在0.085 8～0.858 μg呈良好線性關(guān)系，苦杏仁苷在0.404 2～4.042 μg呈良好線性關(guān)系，甘草酸銨在0.406～4.06 μg呈良好線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷和甘草酸銨峰面積，計(jì)算得鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷和甘草酸銨的RSD分別為1.13%、1.81%、1.73%、1.13 %，表明精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，在0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算得鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷和甘草酸銨的RSD分別為1.49%、1.58%、1.06%、1.35%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定，可供檢測(cè)。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 平行制備5份三拗湯提取液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算得鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷和甘草酸銨的RSD分別為0.92%、0.68%、0.60%、1.11%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密移取已知含量的三拗湯提取液0.5 mL，平行9份，各精密加入樣品含量80%、100%、120%的鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷和甘草酸銨對(duì)照品適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算得鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷和甘草酸銨的平均加樣回收率分別為101.15%、100.13%、99.98%、98.81%，RSD分別為1.12%、1.23%、1.56%、1.32%。

2.2 提取工藝考察

2.2.1 提取溶劑的考察 三拗湯中的有效成分主要為苷類和生物堿等，均易溶于有機(jī)溶劑，故選用水及95%、70%、50%、30%乙醇溶液作為提取溶劑進(jìn)行考察，篩選出最合適的提取溶劑。采取加熱回流提取方式，以鹽酸麻黃堿、鹽偽麻黃堿、苦杏仁苷和甘草酸轉(zhuǎn)移率以及出膏率（精密移取濾液50 mL，放入干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴鍋上蒸干，再移至105 ℃烘箱中干燥3 h，取出，放置干燥器中冷卻，迅速精密稱定質(zhì)量，計(jì)算，即得）為指標(biāo)進(jìn)行考察[3-4]。

稱取5倍處方量飲片（麻黃9 g，苦杏仁9 g，甘草9 g），平行5份，第1次分別加10倍量水及95%、70%、50%、30%乙醇270 mL，回流提取1 h，過(guò)濾；第2次分別加8倍量水及95%、70%、50%、30%乙醇216 mL，回流提取1 h，過(guò)濾，合并2次濾液，測(cè)定4種有效成分含量及出膏率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同提取溶劑4種有效成分轉(zhuǎn)移率和出膏率比較（%）

從表2可以得出，95%乙醇提取后，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草酸轉(zhuǎn)移率均低于其他溶劑，尤其是甘草酸的轉(zhuǎn)移率只有7.15%；但是30%乙醇和50%乙醇提取后，苦杏仁苷的轉(zhuǎn)移率超過(guò)了100%，可能是因?yàn)樵诤幸掖嫉娜軇┲蠰-苦杏仁苷轉(zhuǎn)化成D-苦杏仁苷，而通?？嘈尤受罩窪-苦杏仁苷，因此轉(zhuǎn)移率超過(guò)100%；70%乙醇提取后，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷、甘草酸轉(zhuǎn)移率比較高；水提取的轉(zhuǎn)移率比70%乙醇提取的轉(zhuǎn)移率稍低，無(wú)顯著差異，考慮到工業(yè)生產(chǎn)成本以及操作中安全問(wèn)題，本試驗(yàn)選擇水為最佳提取溶劑。

2.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析 對(duì)三拗湯的水提取工藝進(jìn)行考察，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)加水量、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)3個(gè)因素進(jìn)行考察。稱取5倍處方量飲片（麻黃9 g，苦杏仁9 g，甘草9 g），按表4試驗(yàn)安排，以鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷和甘草酸轉(zhuǎn)移率以及出膏率為考察指標(biāo)，按下式計(jì)算綜合評(píng)分（式中I為試驗(yàn)號(hào)），篩選最佳水提取工藝[5-6]。結(jié)果見(jiàn)表3～表5。

根據(jù)綜合方差分析得出，煎煮次數(shù)對(duì)鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷和甘草酸轉(zhuǎn)移率以及出膏率有顯著影響，加水量與煎煮時(shí)間對(duì)鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷和甘草酸轉(zhuǎn)移率以及出膏率影響不顯著，可能是因?yàn)檫@4種有效成分均為易溶解成分，很容易從水中提取出來(lái)；各因素對(duì)鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷和甘草酸轉(zhuǎn)移率以及出膏率影響因素大小為C＞B＞A，C有顯著影響，A和B無(wú)顯著影響。根據(jù)直觀分析可以得出最佳工藝條件為A3B3C3，由于煎煮時(shí)間和加水量對(duì)轉(zhuǎn)移率的影響不顯著，為了縮短時(shí)間及提高效率，選擇煎煮時(shí)間為1 h，加水量為10倍量，故最佳提取工藝條件為A2B1C3，即加水量為10倍量，煎煮時(shí)間為1 h，煎煮3次。

表3 正交試驗(yàn)因素與水平

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果與直觀分析（%）

表5 綜合評(píng)價(jià)方差分析

2.2.3 優(yōu)選提取工藝的驗(yàn)證 為進(jìn)一步考察上述優(yōu)選提取工藝的穩(wěn)定性，稱取5倍處方量飲片（麻黃9 g，苦杏仁9 g，甘草9 g），按最佳條件重復(fù)提取3次，按上述制備方法和檢測(cè)方法分析優(yōu)選工藝的穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表6。按照最佳工藝條件對(duì)三拗湯進(jìn)行提取后，有效成分的轉(zhuǎn)移率均較高，且穩(wěn)定性好，說(shuō)明該工藝條件合理可行。

表6 提取工藝驗(yàn)證結(jié)果（%）

3 討論

本研究采用HPLC同時(shí)測(cè)定三拗湯中4種有效成分鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷和甘草酸銨，方便快捷。試驗(yàn)曾考察乙腈-磷酸緩沖鹽溶液、乙腈-磷酸二氫鉀溶液、甲醇-磷酸二氫鉀溶液、甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水等體系，均不能使4種有效成分得到較好分離；而使用乙腈-0.1%磷酸體系進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，4種有效成分得到良好分離，且分離度＞1.5，符合要求。在考察乙腈-0.1%磷酸體系時(shí)發(fā)現(xiàn)，兩者比例微調(diào)對(duì)有效成分分離效果有顯著影響；在190～400 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿與苦杏仁苷在208 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，甘草酸銨在250 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。

本研究對(duì)三拗湯提取溶劑進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)水提時(shí)有效成分的轉(zhuǎn)移率比較高，可作為最佳提取溶劑。用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出的最佳提取工藝條件為：加水量為10倍，煎煮時(shí)間為1 h，煎煮3次。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，該工藝穩(wěn)定可行。

[1] 劉景源.太平惠民和劑局方[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2007：60.

[2] 畢云生,潘函清,趙普軍,等.HPLC測(cè)定麻杏石甘湯中麻黃堿的含量[J].中成藥,2004,26(9)：附7.

[3] 張新勇,徐中南,張勇耀,等.三子養(yǎng)親湯提取工藝研究[J].中成藥, 2004,26(6)：500-501.

[4] 董明綱,郭春燕,張力,等.赤芍中芍藥苷提取溶劑的選擇[J].四川中醫(yī),2006,4(6)：35-37.

[5] 馬建紅,聶繼紅,邢建國(guó).黃芩提取工藝的優(yōu)化[J].新疆中醫(yī)藥,2006, 24(2)：8-9.

[6] 李瑩,張慧敏,何瑤,等.四逆湯制備工藝參數(shù)優(yōu)化[J].中成藥,2013, 35(6)：1175-1179.

Study on Extracting Process of San Ao Decoction by Multi-indexes Grading Method

ZHANG Jin-hua, LIU Tao-shi, CHENG Jian-ming, BI Xiao-lin, QIAN Hai-feng, CHEN Dong-dong (College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210046, China)

Objective To simultaneously determinate the contents of four active ingredients (Ephedrine Hydrochloride, Pseudoephedrine Hydrochloride, Amygdalin and Glycyrrhizinate) of San Ao Decoction by HPLC; To optimize the extracting process of San Ao Decoction. Methods The orthogonal test was employed. Volume of water, time of extraction and times of extraction were set as investigation factors; the transport rates of Ephedrine Hydrochloride, Pseudoephedrine Hydrochloride, Amygdalin and Glycyrrhizinate and the extraction rates were set as investigation indexes to conduct multi-indexes grading. Results The influence factors of the extraction of Sao Ao Decoction were the times of extraction > decoction time > the volume of water. The best extraction condition was: ten fold water; extract for three times; 1 h for each time. Conclusion The optimized extraction process is stable and feasible.

San Ao Decoction; orthogonal test; extracting process

R283.5

A

1005-5304(2016)04-0091-04

2015-06-17）

（

2015-12-03；編輯：陳靜）

國(guó)家自然科學(xué)基金（81403114）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目（2014年）

劉陶世，E-mail：tsliur4111@sina.com

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.024