張麗靜，付 勱，張文會，陳 鋒，范 蓓，于翠翠，李淑英，盧 聰，張娜娜，王鳳忠

(1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193；2 西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)與食品科學(xué)研究所，西藏 拉薩 850000)

蕪菁(BrassicarapaL.)為十字花科蕓苔屬植物，是西藏地區(qū)的傳統(tǒng)食用蔬菜，因營養(yǎng)豐富而深受當(dāng)?shù)匕傩障矏郏⑶揖哂邢職鈱捴?、利濕解毒的功效[1-3]。蕪菁中含有多種營養(yǎng)功能成分，如黃酮、多糖及揮發(fā)油等[4-5]，具有抗氧化、抗缺氧、調(diào)節(jié)血脂等作用[6-10]，蕪菁膏(妞瑪堪扎)是由蕪菁干燥塊莖加工制成的膏狀飲品[11]，又名蔓菁膏，收錄在藏醫(yī)藥經(jīng)典著作《晶珠本草》中[12]。傳統(tǒng)藏醫(yī)藥理論認(rèn)為，蔓菁膏具有解毒滋補的功效，主治各種中毒癥。現(xiàn)代藥理研究表明，蔓菁膏具有抗高原缺氧、抗氧化、抗疲勞、抗輻射等作用[13-15]。

目前植物有機成分的提取方法主要有堿性稀醇或堿性水提取、超聲提取、微波提取、超臨界萃取、酶解提取等[16-18]。其中超聲波提取法能夠產(chǎn)生空化作用，從而有效破壞組織的細(xì)胞壁，促進(jìn)活性成分釋放，且對有效成分的破壞性小，與傳統(tǒng)方法相比，該法提取效率高、提取時間短且節(jié)能環(huán)保，因此廣泛應(yīng)用于植物活性成分的提取[19-23]。響應(yīng)面法通過建立連續(xù)變量模型，對各影響因素及交互作用進(jìn)行優(yōu)化及評價，分析結(jié)果更加直觀和精確，因此廣泛用于活性成分提取及食品加工過程中的工藝優(yōu)化研究[24-25]。目前對蕪菁膏制備工藝的研究較少，僅見王宇等[13]通過均勻設(shè)計法對蕪菁膏制備工藝進(jìn)行了優(yōu)化，尚無通過響應(yīng)面優(yōu)化超聲法制備蕪菁膏工藝的研究。因此，本試驗以出膏率為考察指標(biāo)，通過單因素試驗和Plackett-Burnman試驗，篩選對出膏率影響顯著的因素，并通過Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化蕪菁膏制備的最佳工藝，同時探究其抗氧化活性，旨在為蕪菁膏的高效制備和利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蕪菁樣品產(chǎn)自西藏昌都地區(qū)，由西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院提供，經(jīng)鑒定為十字花科蕓苔屬蕪菁種蕪菁的塊莖。DPPH，美國Sigma公司；抗氧化能力檢測試劑盒(ABTS+)，碧云天生物技術(shù)有限公司；乙醇等試劑(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；Raw 264.7細(xì)胞，國家實驗細(xì)胞資源共享平臺。

KQ-600V超聲波清洗器，昆山舒美超聲儀器有限公司；Spectra Max 190酶標(biāo)儀，美國Molecular Device公司；IKA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，美國IKA公司；AL204分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HH-1恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；DHG-9203A鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.2 蕪菁膏超聲提取條件的單因素試驗

針對超聲提取蕪菁膏的超聲功率、超聲時間、料(g)液(mL)比和提取次數(shù)4個影響因子，通過單因素試驗分析其對出膏率的影響。

1.2.1 超聲功率對出膏率的影響 將超聲時間固定為60 min，料液比固定為1∶10，提取次數(shù)為2次，考察超聲功率(400，500，600，700，800 W)對出膏率的影響。

1.2.2 超聲時間對出膏率的影響 將料液比固定為1∶10，提取次數(shù)2次，超聲功率600 W，考察超聲時間(40，50，60，70，80 min)對出膏率的影響。

1.2.3 料液比對出膏率的影響 固定提取次數(shù)為2次，超聲功率600 W，超聲時間60 min，考察料液比(1∶6，1∶8，1∶10，1∶12，1∶14)對出膏率的影響。

1.2.4 提取次數(shù)對出膏率的影響 固定超聲功率600 W，超聲時間60 min，料液比1∶10，考察提取次數(shù)(1，2，3，4，5次)對出膏率的影響。

1.2.5 出膏率的測定 參考文獻(xiàn)[13]中的方法，精密量取蕪菁超聲提取液25 mL，放于干燥至恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后于105 ℃條件下干燥3 h，隨后移至干燥器中，冷卻30 min后迅速精密稱量浸膏的質(zhì)量，計算出膏率。重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

出膏率=W1/W2×100%，其中，W1為浸膏的質(zhì)量，W2為蕪菁原料樣品的質(zhì)量。

1.3 蕪菁膏超聲提取條件的Plackett-Burman正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，通過Plackett-BurmanL12(24)試驗設(shè)計對4個影響因素進(jìn)行評估。以出膏率為響應(yīng)值，對每個因素取高水平和低水平值，篩選影響顯著的因子用于后續(xù)響應(yīng)面試驗，重復(fù)3次。Plackett-Burman 試驗的因素及水平見表1。

表1 蕪菁膏超聲提取條件 Plackett-Burman L12(24)正交試驗的因素及水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman L12(24) orthogonal experiment for ultrasonic extraction conditions of Brassica radix

1.4 蕪菁膏超聲提取條件的Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素試驗及Plackett-Burman試驗基礎(chǔ)上，以超聲功率、超聲時間和料液比3個對出膏率影響顯著的因素為自變量，以出膏率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳工藝條件。試驗設(shè)計見表2。

表2 蕪菁膏超聲提取條件Box-Behnken響應(yīng)面試驗的因素及水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken response surface experiment for ultrasonic extraction conditions of Brassica radix

1.5 蕪菁膏最佳提取工藝驗證

基于響應(yīng)面優(yōu)化試驗得到的最佳工藝條件，重復(fù)進(jìn)行3次提取試驗，計算出膏率的平均值。

1.6 蕪菁膏的抗氧化活性研究

1.6.1 DPPH自由基清除試驗 DPPH自由基清除試驗參照何蘭香等[26]的方法但稍作修改。取不同質(zhì)量濃度(100,200,400,800,1 600 μg/mL)的蕪菁膏水溶液，加入0.5 mg/mL的DPPH溶液，同時設(shè)水加DPPH溶液處理，搖勻后放置在避光處靜置30 min，在515 nm處檢測蕪菁膏水溶液、蕪菁膏水溶液加DPPH溶液、水加DPPH溶液的吸光值，根據(jù)吸光值計算DPPH自由基清除率，并計算蕪菁膏對DPPH自由基的半數(shù)清除率(IC50)。試驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

DPPH自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%。

式中：Ai為蕪菁膏水溶液加DPPH溶液的吸光值；Aj為蕪菁膏水溶液的吸光值；Ac為水加DPPH溶液的吸光值。

1.6.2 ABTS+自由基清除試驗 根據(jù)ABTS+檢測試劑盒的操作步驟檢測蕪菁膏對ABTS+自由基的清除活性，蕪菁膏水溶液質(zhì)量濃度設(shè)置100,200,400,800,1 600 μg/mL，用量為10 μL。根據(jù)結(jié)果計算蕪菁膏對ABTS+自由基的IC50。

1.6.3 MTT細(xì)胞增殖檢測試驗 參考文獻(xiàn)[4]的方法進(jìn)行試驗。取處于對數(shù)生長期的Raw 264.7細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后，棄掉培養(yǎng)基；分別加入不同質(zhì)量濃度(0(模型組)，400，800，1 600 μg/mL)的蕪菁膏，繼續(xù)培養(yǎng)6 h；加入400 μmol/L H2O2，培養(yǎng)12 h，加入MTT孵育4 h后，棄掉培養(yǎng)基，加入200 μL的DMSO，用酶標(biāo)儀檢測吸光值，檢測波長為570 nm。試驗同時設(shè)置正常培養(yǎng)的細(xì)胞為對照組(不加蕪菁膏和H2O2)。計算細(xì)胞的存活率：細(xì)胞存活率 =1-(對照組吸光值-試驗組吸光值)/對照組吸光值×100%。

1.7 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復(fù)3次，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”表示。采用Graphpad prism 6對單因素及抗氧化試驗結(jié)果進(jìn)行處理，用Minitab 17對Plackett-Burman試驗結(jié)果進(jìn)行分析，采用Design Expert 8對響應(yīng)面試驗進(jìn)行設(shè)計與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對蕪菁膏出膏率的影響

2.1.1 超聲功率 由圖1可知，隨著超聲功率的提高，蕪菁出膏率呈先增加后降低趨勢，這是因為當(dāng)超聲功率過大時，提取劑流動加快，在物體表面停留時間減少，使得溶出度減小，出膏率也逐漸降低[27]。當(dāng)超聲功率達(dá)到600 W時，出膏率達(dá)到最大值，為57.1%，因此超聲功率以600 W為宜。

2.1.2 超聲時間 由圖2可知，隨著超聲時間的延長，出膏率表現(xiàn)出先增加后趨于平穩(wěn)的趨勢。當(dāng)超聲時間達(dá)到60 min時，出膏率達(dá)到最大值，為55.9%；隨著超聲時間的繼續(xù)增加，出膏率基本不變?？紤]到繼續(xù)增加超聲時間會提高經(jīng)濟(jì)成本，出膏率卻基本保持不變，而提取物中的功能因子的穩(wěn)定性反而有所降低[28]，因此選擇超聲時間為60 min。

圖1 超聲功率對蕪菁膏出膏率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on yield rate ofBrassica radix

2.1.3 料液比 由圖3可知，出膏率隨料液比的增加呈先增加后趨于平穩(wěn)的趨勢。當(dāng)料液比為1∶10時出膏率達(dá)到最大，為56.1%；繼續(xù)增加料液比，出膏率保持穩(wěn)定[28]。因此，考慮到提取效果及成本，選擇料液比為1∶10。

圖3 料(g)液(mL)比對蕪菁膏出膏率的影響Fig.3 Effect of material to liquid ratio on yield rate ofBrassica radix

2.1.4 提取次數(shù) 由圖4可知，隨著提取次數(shù)的增加，蕪菁膏出膏率逐漸增加，提取次數(shù)為2次時出膏率達(dá)到最大(53.8%)，繼續(xù)增加提取次數(shù)，出膏率略有增大，但總體保持平穩(wěn)。因此將提取次數(shù)確定為2次。

2.2 蕪菁膏出膏率影響因素的Plackett-Burman正交試驗結(jié)果

Plackett-Burman試驗結(jié)果如表3所示，通過Minitab軟件進(jìn)行回歸分析和顯著性檢驗，結(jié)果見表4。表4表明，因素A(超聲功率)、B(超聲時間)、C(料液比)對蕪菁膏出膏率影響顯著，因此選擇這3個因素進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面優(yōu)化試驗。提取次數(shù)對出膏率的影響不顯著，因此將后續(xù)試驗的提取次數(shù)設(shè)定為2次。

表3 蕪菁膏超聲提取條件 Plackett-Burman L12(24)正交試驗結(jié)果Table 3 Levels of various factors and response results of Plackett-Burman L12(24) for ultrasonic extraction conditions of Brassica radix

表4 蕪菁膏超聲提取條件Plackett-Burman L12(24)正交試驗結(jié)果的顯著性檢驗Table 4 Significance test of factors of Plackett-Burman L12(24) for ultrasonic extraction conditions of Brassica radix

2.3 蕪菁膏制備工藝的Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化

Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗方案及結(jié)果見表5。根據(jù)表5結(jié)果，利用Design Expert 軟件對出膏率與A(超聲功率)、B(超聲時間)、C(料液比)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到出膏率的回歸方程為：

式中：x1、x2、x3分別代表A、B、C因素。

表5 蕪菁膏超聲提取條件Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 5 Design and results of Box-Behnken response surface analysis for ultrasonic extraction conditions of Brassica radix

回歸方程的方差分析結(jié)果如表6所示。由表6可知，影響蕪菁膏出膏率的3個因素依次為：超聲功率(A)、超聲時間(B)、料液比(C)，可以看出，超聲功率(A)對出膏率的影響極顯著(P<0.01)、超聲時間(B)對出膏率的影響顯著(P<0.05)。根據(jù)回歸模型預(yù)測蕪菁膏制備的最佳工藝為：超聲功率614 W、超聲時間62.74 min、料液比1∶9.45，提取次數(shù)根據(jù)單因素試驗結(jié)果設(shè)定為2次，在此條件下出膏率為59.47%。

表6 蕪菁膏超聲提取出膏率對超聲功率(A)、超聲時間(B)、料液比(C)回歸方程的方差分析結(jié)果Table 6 Analysis of variance for regression equations of extraction rate of Brassica radix to ultrasonic power (A),ultrasonic time (B),and material-liquid ratio (C)

2.4 蕪菁膏提取工藝的驗證

根據(jù)預(yù)測值，在實際操作中將提取條件設(shè)定為：超聲功率614 W，提取時間63 min，料液比1∶9.5，重復(fù)提取3次,在此條件下蕪菁膏出膏率的平均值為59.02%，與預(yù)測值僅相差0.76%，在試驗允許的誤差范圍內(nèi)，因此該條件可用于蕪菁膏的制備。本試驗出膏率與王宇等[13]通過均勻設(shè)計法優(yōu)化蕪菁膏提取工藝得到的結(jié)果(51.93%)相比，有明顯的提高。

2.5 蕪菁膏的抗氧化活性

2.5.1 對DPPH自由基清除能力 DPPH自由基在515 nm處有最大吸收峰，其乙醇溶液呈深紫色，當(dāng)存在有自由基清除能力的抗氧化劑時，抗氧化劑可與DPPH自由基的單電子配對，繼而使其吸收逐漸消失，且其褪色程度與接受的電子數(shù)成定量關(guān)系，因而可用比色法進(jìn)行定量分析，以檢測自由基的清除情況，從而評價樣品的抗氧化能力[29]。由圖5可知，隨著質(zhì)量濃度的增加，蕪菁膏對DPPH自由基的清除能力逐漸增強，表明蕪菁膏與DPPH自由基清除率之間存在量效關(guān)系。根據(jù)試驗結(jié)果，計算出蕪菁膏清除DPPH自由基的IC50為277.54 μg/mL，表明蕪菁膏能夠有效清除DPPH自由基。

*，**分別表示與100 μg /mL組相比差異顯著和極顯著。圖6同 * and ** mean significant and extremely significant difference compared with the 100 μg/mL group,respectively.The same below圖5 蕪菁膏的DPPH自由基清除活性Fig.5 DPPH free radical scavenging capacity ofBrassica radix

2.5.2 對ABTS+自由基清除能力 ABTS+自由基清除能力常用于評價各種混合物或均一物質(zhì)的總抗氧化能力，樣品在波長734 nm 處的吸光值可反映其抗氧化活性[30]。由圖6可見，隨著質(zhì)量濃度的增加，蕪菁膏對ABTS+自由基的清除率逐漸增大，表明蕪菁膏與ABTS+自由基清除率之間存在著量效關(guān)系。經(jīng)計算，蕪菁膏清除ABTS+自由基的IC50為381.26 μg/mL，表明蕪菁膏能夠有效清除ABTS+自由基。

圖6 蕪菁膏的ABTS+自由基清除能力Fig.6 ABTS+ free radical scavenging capacity of Brassica radix

2.5.3 對氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用 細(xì)胞存活率是反映外界環(huán)境對細(xì)胞損傷程度的最直觀指標(biāo)。氧化應(yīng)激損傷會導(dǎo)致胞內(nèi)活性氧水平升高，進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為細(xì)胞存活率降低。H2O2常用做體外氧化應(yīng)激損傷的造模藥物，其中超氧陰離子自由基能使細(xì)胞膜上的脂質(zhì)物質(zhì)和蛋白發(fā)生氧化反應(yīng)[31]。蕪菁膏對H2O2誘導(dǎo)Raw 264.7細(xì)胞存活率的影響如圖7所示。

a表示與對照組(不加蕪菁膏和H2O2)相比差異顯著(P<0.05)；*表示與模型組(0 μg/mL)相比差異顯著(P<0.05)a means significant difference (P<0.05)compared with the control group(0 μg /mL Brassica radix and H2O2)；* means significant difference(P<0.05)compared with the model group(0 μg/mL)圖7 蕪菁膏對H2O2誘導(dǎo)Raw 264.7細(xì)胞存活率的影響Fig.7 Effect of Brassica radix extract on viability of Raw 264.7 cells induced by H2O2

由圖7可見，與對照組(CK)細(xì)胞相比，模型組(0 μmol/L)細(xì)胞存活率顯著下降。與模型組相比，不同質(zhì)量濃度的蕪菁膏均能有效提高受損細(xì)胞的存活率，其中高質(zhì)量濃度(1 600 μg/mL)的蕪菁膏能夠顯著提高細(xì)胞的存活率至82.57%。結(jié)果表明，蕪菁膏對H2O2誘導(dǎo)的Raw 264.7細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用。

3 結(jié) 論

本研究將超聲輔助法應(yīng)用于蕪菁膏的制備中，通過單因素試驗和Plackett-Burman正交試驗，確定蕪菁膏制備過程中各個因素對提取率的影響力大小依次為超聲功率>超聲時間>料液比。利用Box-Behnken響應(yīng)面法進(jìn)行分析，得到的最優(yōu)制備工藝為：超聲功率614 W，提取時間63 min，料液比1∶9.5，對應(yīng)的出膏率為59.02%。與其他制備方法相比，超聲輔助法提取率高，制備時間短。對蕪菁膏抗氧化活性的研究表明，蕪菁膏具有一定的抗氧化活性，對DPPH和ABTS+自由基的IC50分別為277.54和381.26 μg/mL；可改善H2O2誘導(dǎo)的Raw 264.7細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，提高細(xì)胞的存活率至82.57%。