黃宗健，肖旺釧，鄭可利

(三明學(xué)院資源與化工學(xué)院，福建三明365004)

仙草總皂苷的超聲波法提取工藝研究

黃宗健，肖旺釧，鄭可利

(三明學(xué)院資源與化工學(xué)院，福建三明365004)

目的：在不同的實(shí)驗(yàn)條件下提取仙草總皂苷，得到最佳提取條件。方法：采用乙醇浸泡的條件下，以超聲波輔助提取仙草總皂苷，通過單因素實(shí)驗(yàn)對仙草總皂苷的提取時(shí)間、溶劑濃度、提取溫度、料液比等因素的探究，正交試驗(yàn)優(yōu)選最佳提取工藝，利用分光光度法測定仙草中總皂苷的含量。結(jié)果：最優(yōu)提取條件經(jīng)過實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析確定為超聲時(shí)間40Min、乙醇濃度70%、提取溫度40℃、料液比1∶25，8．48%是在此條件下所達(dá)到的提取率。結(jié)論：實(shí)驗(yàn)所確定的最佳條件可以提高效率，節(jié)約成本，操作方便。

仙草；總皂苷；超聲波輔助；正交試驗(yàn)

仙草叫仙人草、涼粉草，目前在中國有3種Mesona chiensis Benth,Mesona paruifso ta(Benth) Brea,Mesona procumbens Hemsl，在福建、廣東、臺灣等東南沿海一帶均有種植，印度、印度尼西亞、馬來西亞也有少量分布。仙草莖方柱,有時(shí)對生分枝,表面灰竭色或棕黃色,被疏毛或剛毛,幼枝毛明顯,有溝槽,嫩莖常扭曲。質(zhì)韌,斷面白色,中空。葉對生,多皺縮或破碎,展平后呈卵狀長圓形,葉子上端鈍尖，下部成柄狀,頁面邊緣有鋸齒,兩面都長有稀疏的絨毛,紙質(zhì),稍柔韌[1]。仙草可以藥食兩用，《中藥大辭典》中有記載：仙草性寒，味甘、澀，有清熱解渴，解暑利尿的功效[2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)分析仙草成分后認(rèn)為仙草具有鎮(zhèn)靜、降溫、降血糖、抗氧化等作用[3]。仙草不宜直接食用，將植株曬干后煎汁與米漿一起煮，冷卻以后變成黑色膠狀物，拌上糖后是解暑勝品[4]。仙草中碳水化合物含量較高，同時(shí)還存在少量的維生素、色素等，還含有微量元素鐵、錳、鋅、鉀、鈣等，此外仙草中還含有對人體有益的黃酮、皂苷、多糖、酚類等成分。在抑菌、抗氧化、抗氧化損傷保護(hù)、抗缺氧等方面有一定的作用[5]。

提取皂苷類化合物有很多方法，如溫浸法、回流法[6]、超聲波法[7]、微波法、高效液相色譜法等[8]，超聲波法在提取皂苷上有較好的效果，可以較好的保證提取物的有效功能，并且節(jié)省提取時(shí)間，節(jié)約成本[9-13]。本實(shí)驗(yàn)以仙草為原料，在提取仙草總皂苷是使用超聲波作為輔助，進(jìn)行仙草中總皂苷的提取，尋找提取仙草總皂苷最優(yōu)條件。

本實(shí)驗(yàn)是建立在前人的經(jīng)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，提取仙草的總皂苷，并且對提取工藝進(jìn)行探究，確定最佳工藝。通過超聲波輔助提取的方法提取總皂苷，以紫外可見光分光光度法測定其含量[14-15]，然后分析仙草在不同因素下的提取結(jié)果，比較結(jié)果的不同點(diǎn)，最后選取出最好的提取條件，為開發(fā)利用仙草提供理論依據(jù)。

1實(shí)驗(yàn)操作

1.1材料、試劑、儀器

1.1.1材料、試劑

仙草（產(chǎn)地：福建三明）；95%乙醇；無水乙醇；冰醋酸；高氯酸（試劑均為分析純）；5%香草醛-冰醋酸溶液（現(xiàn)配）；熊果酸（上海源葉生物科技有限公司）。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器

Uv-722型紫外-可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器）；KQ2200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；RE-52B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海博經(jīng)經(jīng)貿(mào)）；FA/JA型電子天平（上海精密科學(xué)儀器）；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)）；SYP智能型玻璃恒溫水浴鍋（鞏義市子華儀器）；高速中藥粉碎機(jī)VF-111(瑞安市永歷制薬機(jī)械有限公司)；玻璃儀器氣流烘干器KQ-C（鞏義市子華儀器）。

1.2總皂苷的測定方法

皂苷與5%香草醛-冰醋酸溶液、高氯酸可以反應(yīng)生成有色物，在特定波長下測定吸光度值可以得到含量[16]，本實(shí)驗(yàn)采用此種方法作為測定仙草總皂苷的方法。熊果酸為植物中存在的一種天然皂苷，而仙草中也含有類似熊果酸結(jié)構(gòu)的皂苷[17]，所以本實(shí)驗(yàn)選擇熊果酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，最大吸收波長測處定樣品溶液的吸光度，計(jì)算得出仙草總皂苷的含量。

1.3實(shí)驗(yàn)流程

將仙草進(jìn)行粉碎烘干后過420μm篩，之后用乙醇溶液浸泡，在不用的條件下進(jìn)行提取，提取液減壓抽濾，經(jīng)過蒸發(fā)濃縮、脫色、定容、顯色后進(jìn)行吸光度的測定，最后計(jì)算仙草中總皂苷的含量。

1.4前期準(zhǔn)備工作

1.4.1樣品預(yù)處理

將購買的仙草用中藥粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，之后過420μm篩，至于烘箱中烘干，最后倒入干燥的碘量瓶備用。

1.4.2配置實(shí)驗(yàn)溶液

熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液：準(zhǔn)確稱取5 mg熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品，加入少量無水乙醇，完全溶解后轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，定容，備用，標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為50μg/mL；5%香草醛-冰醋酸溶液[18]（現(xiàn)配現(xiàn)用）：10 mL冰醋酸中加入0.5 g香草醛搖勻溶解，完全溶解后備用；一系列梯度濃度的乙醇溶液。

1.4.3制備供試品

在干燥的碘量瓶中稱取2.0000 g仙草粉末，加入乙醇溶液，浸泡30 min后進(jìn)行超聲提取，趁熱過濾，待溶液冷卻后轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，60℃蒸發(fā)干溶劑。往燒瓶中倒入20 mL無水乙醇溶解，完全溶解后將溶液倒入50 mL燒杯中，60℃水浴加熱，溶液中加入0.5 g活性炭于脫色，脫色完成后立即過濾，之后將濾液倒入25 mL容量瓶內(nèi)，定容搖勻后備用。

1.4.4測定最大吸收波長

在3個(gè)干燥的容量瓶中，分別移取標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液以及空白溶液5 mL，60℃水浴加熱揮干溶劑，加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液，0.8 mL高氯酸搖勻，60℃水浴加熱15 min，用冰水冷卻[18]，冰醋酸定容，搖勻。以空白溶液作為對照，標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液用紫外可見分光光度計(jì)在390～650 nm范圍內(nèi)測定其吸光度值，標(biāo)準(zhǔn)品最大吸收波長為545 nm，供試品最大吸收波長為540 nm，二者較為接近，因此將測定波長定為540 nm。

1.4.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

分別移取0.00、0.40、0.80、1.20、1.60、2.0 mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入6只干燥的25 mL容量瓶中，編號1～6號，60℃水浴揮干溶劑，加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液，0.8 mL高氯酸搖勻，60℃水浴加熱15 min，立即用冰水冷卻[18]，冰醋酸定容，搖勻。在540 nm波長下，以1號溶液作為空白對照，測定2～6號的吸光度。以熊果酸含量為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)，制作熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，如圖1所示，線性回歸方程：

1.4.6總皂苷的計(jì)算公式

總皂苷提取率（%）=提取液總皂苷含量÷仙草質(zhì)量×100%

其中C為由提取液吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程得出的總皂苷質(zhì)量（μg），m為仙草粉末質(zhì)量（g），V為樣液定容后體積（mL），V0為測定所用樣液體積（mL）。

圖1熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.5影響仙草總皂苷提取的4個(gè)因素

（1）料液比：1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35；

（2）乙醇濃度：40%、50%、60%、70%、80%、90%；

（3）超聲波時(shí)間：20、30、40、50、60、70 min；

（4）溫度：20、30、40、50、60、70℃。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1不同料液比對提取率的影響

稱取6份質(zhì)量2 g仙草粉末置于碘量瓶中，采用1.5（1）的不同料液比為基礎(chǔ)，設(shè)定相同的乙醇濃度，超聲時(shí)間，溫度，在此條件下進(jìn)行總皂苷提取，空白溶液作為對照，測定樣品的吸光度，并計(jì)算提取率，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)3次，取3次實(shí)驗(yàn)提取率平均值做料液比對提取率影響曲線，其結(jié)果如圖2所示。

在圖2中可以看到，在料液比為1∶20提取率為最大值，在此之前提取率是在增大，之后的變化不大，可能是由于皂苷在乙醇溶劑中溶解度趨于飽和而造成的，為避免浪費(fèi)，所以選擇1∶20作為最佳的料液比，計(jì)算得到提取率的標(biāo)準(zhǔn)差為1.29，數(shù)據(jù)較為分散。

2.1.2不同乙醇濃度對提取率的影響

稱取6份質(zhì)量為2g仙草粉末，相同的條件下選定1.5（2）中作為唯一變量，進(jìn)行總皂苷提取，測定樣品的吸光度，計(jì)算提取率，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)3次，取提取率平均值，提取率和不同乙醇濃度的關(guān)系，如圖3所示。

圖2不同料液比對提取率的影響

圖3不同乙醇濃度對提取率的影響

從圖3可以明顯看出，乙醇濃度在增大的同時(shí)提取率也在增大，最高提取率是在80%乙醇濃度時(shí)出現(xiàn)，然后有所下降。皂苷容易溶解在較高濃度的乙醇溶液中，但在乙醇濃度過高時(shí)，仙草中的其他物質(zhì)析出，溶解在溶液內(nèi)，對于提取測定總皂苷會造成影響，所以選擇乙醇濃度為80%，計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)差為1.18，數(shù)據(jù)也較為分散。

2.1.3不同超聲時(shí)間對提取率的影響

稱取6份2 g仙草粉末，1.5（3）作為不同條件，在其他條件相同的情況下，對仙草總皂苷進(jìn)行提取，對樣品溶液進(jìn)行吸光度的測定，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)3次后計(jì)算提取率平均值，得到超聲時(shí)間對提取率的影響關(guān)系，如圖4所示。

由圖4可以看出在超聲時(shí)間30 min時(shí)仙草總皂苷有最大提取率，時(shí)間超過30 min后提取率開始減小，皂苷從仙草中提取出來需要時(shí)間，并且溶解在乙醇中也有最大溶解度，在超聲波的作用下以及水浴加熱乙醇揮發(fā)減少了皂苷的溶解，或者被氧化造成皂苷減少，30 min作為實(shí)驗(yàn)超聲時(shí)間，而標(biāo)準(zhǔn)差為0.74，由此可以看出數(shù)據(jù)還是較為集中的。

2.1.4超聲溫度對仙草總皂苷提取率的影響

稱取6份2 g仙草粉末，不同的條件決定為1.5（4），然后在其他的相同條件下提取仙草的總皂苷，之后以空白溶液作為照，對提取液的吸光度進(jìn)行測定，再計(jì)算出結(jié)果，進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算提取率的平均值，最后得到溫度和提取率的關(guān)系，如圖5所示。

圖5上得出在溫度為50℃時(shí)有最高提取率，在此之前溫度上升，提取率也隨溫度的升高在增大，后隨著溫度的提高提取率下降。因?yàn)闇囟仍礁呷芙舛仍酱螅碥赵饺菀兹苡谝掖?，但是溫度過高會使乙醇溶劑揮發(fā)過快，造成皂苷溶解減少，提取率降低。所以選定超聲溫度50℃，計(jì)算得到的標(biāo)準(zhǔn)差為0.86。

2.2超聲波提取仙草總皂苷的正交試驗(yàn)

2.2.1實(shí)驗(yàn)因素和水平

正交試驗(yàn)是為選出提取仙草總皂苷的最好條件，確定4個(gè)影響因素：料液比（A）、乙醇濃度（B）、超聲時(shí)間（C）、超聲溫度（D），每個(gè)因素取3個(gè)水平。評定以仙草中總皂苷含量為準(zhǔn)，運(yùn)用L934進(jìn)行正交試驗(yàn)。超聲輔助提取仙草中總皂苷正交因素表如表1所示。

圖4超聲時(shí)間對提取率的影響

圖5溫度對提取率的影響

表1超聲波提取仙草總皂苷正交因素表

2.2.2正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2超聲波法提取仙草總皂苷的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果L934

2.2.3結(jié)果分析

影響仙草提取總皂苷的因素優(yōu)先順序可以根據(jù)表2中極差大小來得出，比較之后得出影響仙草總皂苷的提取影響因素的優(yōu)先順序是B＞C＞A＞D，也就是乙醇濃度最容易影響仙草總皂苷的提取，超聲時(shí)間對提取率造成的影響稍小，料液比次之，而影響最小的因素是超聲溫度。對正交試驗(yàn)的結(jié)果分析料液比1∶25，乙醇濃度70%，超聲時(shí)間40 min，超聲溫度40℃為提取仙草總皂苷的最佳條件。因?yàn)樽罴压に嚱M合不在正交實(shí)驗(yàn)內(nèi)，所以要進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)。

2.2.4最佳工藝條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

稱取3份2 g仙草粉末，在2.2.3中確定的最佳條件組合進(jìn)行提取總皂苷平行實(shí)驗(yàn)，得出3份仙草的提取率分別為8.48%、8.49%、8.48%，取平均提取率8.48%，8.48%的提取率比正交試驗(yàn)中的較優(yōu)組合7的提取率8.45%高，可以證明經(jīng)過正交試驗(yàn)，分析結(jié)果后選出的最佳提取條件是符合實(shí)際情況的。

3結(jié)論

（1）分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，作為仙草總皂苷提取劑，效果最好的是濃度為70%的乙醇溶液。皂苷作為植物中的一種有機(jī)物，根據(jù)相似相容原理，乙醇和皂苷的極性接近，所以皂苷在乙醇中的溶解度較大，作為提取劑的乙醇溶液可以進(jìn)行回收，回收操作簡便，所以用濃度為70%的乙醇溶液作為提取劑。

（2）仙草總皂苷提取的影響因素大小進(jìn)過對正交試驗(yàn)的結(jié)果分析，各個(gè)因素中乙醇濃度影響最大，超聲時(shí)間次之，料液比稍小，超聲溫度是影響最小的；以及超聲波法提取仙草苷的最佳工藝條件為料液比1∶25，乙醇濃度70%，超聲時(shí)間40 min，超聲溫度40℃，提取率達(dá)8.48%，目前對于仙草中總皂苷提取和含量測定的研究還較少，所以本文有一定的參考價(jià)值。

（3）本實(shí)驗(yàn)所采用的超聲波法提取仙草總皂苷較其他方法相比，提取率高，提取時(shí)間短，可以有效的保護(hù)提取成分，操作簡便，可以做到降低成本，高效、節(jié)能，為仙草的開發(fā)和利用提供部分參考。

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（責(zé)任編輯：朱聯(lián)九）

Ultrasonic Assisted Extraction of Total Saponins in Mesona Chinensis

HUANG Zong-jian,XIAOWang-chuan,ZHENG Ke-li
(College of Resource and Chemistry Engineering,Sanming University,Sanming 365004,China)

Objective:To obtain the optimuMconditions of ultrasonic assisted extraction of total saponins in Mesona chinensis.Method:The ultrasonic assisted extraction of total saponins in Mesona chinensis was accomplished by using ethanol as solvent.Single factor experimentswere used for investigating the influences of extraction time,solvent concentration,extraction temperature,solid to liquid on extraction rate.The total saponins was measured by spectrophotometric method.The optimuMextraction process was deterMined by orthogonal test.Results:The optimuMparameters are as follows:ultrasonic time 40min,70%ethanol,extraction temperature 40℃,solid-liquid ratio 1∶25,extraction rate of 8.48%. Conclusion：this process is simpleand low costly aswellas of high effeciency.

Mesona chinensis;total saponin;ultrasonic;orthogonal test

R 284．2

A

1673－4343（2016）06－0072－06

10．14098／j．cn35－1288／z．2016．06．012

2016－09－25

大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（ZL1222/CS(sj),SD1111，STS0801）

鄭可利，男，福建永泰人，教授。主要研究方向：天然產(chǎn)物提取與分離。