王子威　楊麗君

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院兒科，北京100050

TLR9、MyD88及NF-κB在過(guò)敏性紫癜中的表達(dá)及意義

王子威楊麗君

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院兒科，北京100050

目的探討免疫上游因子TLR9、MyD88、NF-κB及免疫下游細(xì)胞因子IL-6、TNF-α在HSP組與正常對(duì)照組間的差異及相關(guān)性。方法采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HSP患兒外周血單核細(xì)胞TLR9、MyD88及NF-κB mRNA表達(dá)量，ELISA法檢測(cè)血漿IL-6、TNF-α水平。結(jié)果①HSP患兒外周血單核細(xì)胞TLR9、MyD88及NF-κB mRNA表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照組；②HSP組血漿IL-6、TNF-α水平較對(duì)照組水平顯著增高；③HSP組中TLR9與MyD88、TLR9與NF-κB、MyD88與NF-κB、NF-κB與IL-6以及NF-κB與TNF-α均存在線(xiàn)性正相關(guān)關(guān)系。結(jié)論HSP患兒TLR9、MyD88、NF-κB、IL-6、TNF-α水平均較正常兒童顯著升高。TLR9-MyD88-NF-κB信號(hào)通路參與HSP發(fā)病，并在其中起重要作用。

過(guò)敏性紫癜；Toll樣受體9；髓樣分化因子88；核轉(zhuǎn)錄因子Kappa-B；白介素6；腫瘤壞死因子α

過(guò)敏性紫癜（henoch-schonlein purpura，HSP）是兒童時(shí)期最常見(jiàn)的免疫系統(tǒng)疾病，本病以小血管炎癥為主要病變，好發(fā)于3～10歲兒童，常累及皮膚、胃腸道、關(guān)節(jié)、腎臟等多個(gè)系統(tǒng)，其發(fā)病率呈逐年增多趨勢(shì)，臨床上無(wú)有效的治療措施及控制其進(jìn)展的有力手段，近年來(lái)，人們努力尋找HSP發(fā)生的上游機(jī)制，隨著Toll樣受體（Toll like receptors，TLRs）等模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR）深入研究，人們發(fā)現(xiàn)這種形式讓機(jī)體不但可以發(fā)現(xiàn)入侵的病原體，而且能夠識(shí)別其類(lèi)型，并通過(guò)一系列信號(hào)途徑活化效應(yīng)分子，從而控制并清除病原體。目前研究發(fā)現(xiàn)由Toll樣受體9（Toll like receptor 9，TLR9）-髓系分化因子（myeloid differentiation factors 88，MyD88）-核轉(zhuǎn)錄因子Kappa-B（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號(hào)通道介導(dǎo)下游細(xì)胞因子如血清白介素6（Interleukin 6，IL-6）、腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF-α）釋放發(fā)揮免疫應(yīng)答，因此信號(hào)通道TLR9-MyD88-NF-κB在免疫識(shí)別、激活、效應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

1　資料與方法

1.1一般資料

選取2015年3月～2016年3月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院門(mén)診及住院急性期HSP患兒40例作為研究對(duì)象，另選取我院兒童保健科健康體檢兒童35例作為正常對(duì)照組。研究對(duì)象入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡＜14歲；②均為初診初次發(fā)病，病程在3 d內(nèi)且未接受治療者；③HSP的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照諸福棠《實(shí)用兒科學(xué)》第7版[1]；④近1個(gè)月內(nèi)無(wú)感染及過(guò)敏性疾病史，未使用過(guò)激素及免疫抑制劑。對(duì)照組：選取同期在本院體檢的正常健康兒童。本研究取得入選對(duì)象監(jiān)護(hù)人知情同意并獲我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。HSP組男21例，女19例，年齡3～12歲，平均（7.4±2.9）歲，對(duì)照組男18例，女17例，年齡3～11歲，平均（7.6±2.7）歲。兩組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2方法

實(shí)時(shí)熒光定量（real-time quantitative RT-PCR）檢測(cè)：采集研究對(duì)象的組織，采用Trizol抽提法提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA公司）說(shuō)明書(shū)合成cDNA。引物的設(shè)計(jì)使用Oligo 6.0設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)，由上海生物工程有限公司合成，引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度詳見(jiàn)下圖。RT-PCR使用TAKARA公司的SybergreenIMix試劑盒，反應(yīng)條件為：94℃5 min，94℃15 s，58℃15 s，72℃15 s，共35個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增反應(yīng)完成后又進(jìn)行了溶解曲線(xiàn)的制作，確保擴(kuò)增的特異性。

引物序列如下：

TRL9引物序列：

上游：5’-GGGACCTCGAGTGTGAAGCA-3’199

下游：5’-CTGGAGCTCACAGGGTAGGAA-3’

MyD88引物序列：

上游：5’-GCACATGGGCACATACAGAC-3’239

下游：5’-TGGGTCCTTTCCAGAGTTTG-3’

NF-κB引物序列：

上游：5’-CTGAACCAGGGCATACCTGT-3’197

下游：5’-GAGAAGTCCATGTCCGCAAT-3’

β-actin引物序列：

上游：5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’111

下游：5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’

血清IL-6、TNF-α由第四軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)教研室提供ELISA試劑盒測(cè)定。敏感度為100μg/L，酶標(biāo)儀MicroplateReader為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品，在450 nm處讀出吸光度（A）值，操作嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)分布檢驗(yàn)后，滿(mǎn)足正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)，直線(xiàn)相關(guān)性分析應(yīng)用Pearson分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1HSP組與正常對(duì)照組血漿IL-6與TNF-α表達(dá)水平比較

HSP組血漿IL-6、TNF-α水平較對(duì)照組水平顯著增高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.11、9.26，P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1　HSP組與正常對(duì)照組血漿IL-6與TNF-α水平比較（±s）

表1　HSP組與正常對(duì)照組血漿IL-6與TNF-α水平比較（±s）

組別n IL-6（ng/mL）TNF-α（pg/mL）HSP組正常對(duì)照組t值P值40 35 41.85±7.59 33.90±5.53 5.11 0.00 0.83±0.16 0.49±0.15 9.26 0.00

2.2HSP組與正常對(duì)照組人外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheralblood mononuclearcell，PBMC）TLR9、MyD88、NF-κB-mRNA表達(dá)量比較

HSP患兒外周血單核細(xì)胞TLR9、MyD88及NF-κB mRNA表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.68、5.42、112.95，P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2　HSP組與正常對(duì)照組PBMC TLR9、MyD88、NF-κB-mRNA表達(dá)量比較（s）

表2　HSP組與正常對(duì)照組PBMC TLR9、MyD88、NF-κB-mRNA表達(dá)量比較（s）

?

2.3HSP組中TLR9與MyD88，TLR9與NF-κB，MyD88與NF-κB，NF-κB與IL-6以及NF-κB與TNF-α的相關(guān)關(guān)系

HSP組中TLR9與MyD88，TLR9與NF-κB，MyD88與NF-κB，NF-κB與IL-6以及NF-κB與TNF-α均存在線(xiàn)性正相關(guān)關(guān)系。TLR9與MyD88呈正相關(guān)（r=1.00，P＜0.01）；TLR9與NF-κB呈正相關(guān)（r= 0.98，P＜0.01）；MyD88與NF-κB呈正相關(guān)（r=0.98，P＜0.01）；NF-κB與IL-6呈正相關(guān)（r=0.98，P＜0.01）；NF-κB與TNF-α呈正相關(guān)（r=0.97，P＜0.01）。

3　討論

過(guò)敏性紫癜是兒童好發(fā)的自身免疫系統(tǒng)疾病，目前發(fā)病率逐年上升，發(fā)病率約為萬(wàn)分之一[2]。臨床上以非血小板減少性皮疹、腹痛、關(guān)節(jié)痛、血尿和蛋白尿?yàn)橹饕憩F(xiàn)，可分為單純皮膚型、關(guān)節(jié)型、腹型、腎型、混合型[3]。

Toll樣受體是目前研究較多的一種模式識(shí)別受體，至少包括13個(gè)成員（TRL1-13），其中TRL1-9在人類(lèi)及小鼠中均有表達(dá)，在天然免疫和獲得性免疫中都發(fā)揮著重要的作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)入侵病原體的早期識(shí)別，激活天然免疫，是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁[4，5]。TLR9是TLRs家族中的一員，能識(shí)別細(xì)菌和病毒DNA中非甲基化的胞嘧啶-磷酸-鳥(niǎo)嘌呤基序（CpG-DNA），在微生物、空氣傳播的細(xì)菌、真菌、病毒病原菌感染的先天免疫中起作用。啟動(dòng)炎性應(yīng)答信號(hào)通路，成為近兩年HSP研究的熱點(diǎn)[6]。TLR9信號(hào)通道是MyD88依賴(lài)通道[7]。

MyD88通過(guò)一系列信號(hào)分子如：Toll/IL-1受體同源區(qū)（Toll/IL-1 receptorhomologous region，TIR）、白介素1受體相關(guān)蛋白激酶（IL-1 Rassociated kinase，IRAK）4、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TNFR-associatedfactor 6，TRAF6）、TGF-β激酶（TGF-βactivated kinase 1，TAK1）和TAK1結(jié)合蛋白（TAK1 binding protein，TAB），最終激活NF-κB[8]，促進(jìn)下游炎性因子如白介素1（Interleukin 1，IL-1）、白介素6（Interlenkin 6，IL-6）、白介素8（Interleukin 8，IL-8）、白介素12（Interleukin 12，IL-12）和TNF-α等表達(dá)。

TLR9-MyD88-NF-κB信號(hào)通道激活后能啟動(dòng)下游多種炎癥因子的轉(zhuǎn)錄和合成[9]。大量研究發(fā)現(xiàn)，包括細(xì)菌、病毒以及其他病原體的感染與HSP的發(fā)病最為密切，機(jī)體受到病原微生物感染后，激活上游TLR9-MyD88-NF-κB信號(hào)通道后，活化的NF-κB誘導(dǎo)下游多種炎癥因子和酶等基因的表達(dá)，介導(dǎo)瀑鏈?zhǔn)窖装Y反應(yīng)的形成、發(fā)展及惡化。國(guó)外Maria E等[10]通過(guò)研究63例HSP患兒與50例正常兒童外周血單核細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在HSP患兒外周血中TLR9 mRNA表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常組。Coppo R等[11]研究發(fā)現(xiàn)HSP患兒中TLR9基因和蛋白表達(dá)較正常組均顯著升高，故推測(cè)TLR9信號(hào)通路介導(dǎo)HAP異常免疫反應(yīng)。Alper S等[12]發(fā)現(xiàn)TLRs通過(guò)IL-1和NF-κB途徑引起炎癥反應(yīng)。TLR信號(hào)通路的上調(diào)還與腎臟疾病有關(guān)，在國(guó)外一項(xiàng)HSP研究中，野生型C57BL/6實(shí)驗(yàn)鼠和TLR缺失型實(shí)驗(yàn)鼠同時(shí)接種同等劑量的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），野生型C57BL/6實(shí)驗(yàn)鼠發(fā)生嚴(yán)重過(guò)敏性紫癜腎炎，表現(xiàn)為腎小球血栓，新月體形成和腎小球巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，而TLR缺失型實(shí)驗(yàn)鼠卻未發(fā)生過(guò)敏性紫癜腎炎，研究表明TLR信號(hào)通路在過(guò)敏性紫癜腎炎發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中起到重要作用[13]。Hong C等[14]2011～2013年將105名HSP患兒按照24 h尿蛋白量分成3組，A組診斷為HSP，但未見(jiàn)腎臟損傷，B組HSP伴有腎臟損傷，但無(wú)大量蛋白尿，C組HSP伴有腎臟損傷，合并大量蛋白尿，同時(shí)以35例健康兒童作為健康組，研究發(fā)現(xiàn)C組患兒TLR9 mRNA和蛋白表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照組，同時(shí)比A、B組均高，研究還發(fā)現(xiàn)TLR9表達(dá)與24 h尿蛋白定量呈線(xiàn)性相關(guān)關(guān)系。這個(gè)結(jié)論與Maria E[10]得出在成人中，TLRs表達(dá)與蛋白尿的量有很明顯的相關(guān)性的結(jié)論，高度一致。故本研究推測(cè)TLR4異常激活與HSPN發(fā)生有密切相關(guān)。目前越來(lái)越多的研究表明TLR信號(hào)通路參與了HSP發(fā)病的過(guò)程[15-18]。因此HSP的發(fā)病與TLR9-MyD88-NF-κB信號(hào)通道密切相關(guān)。TNF-α和IL-6均屬于免疫下游細(xì)胞因子，研究表明NF-κB是其上游的調(diào)控點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HSP組患兒TLR9、MyD88、NF-κB均比正常對(duì)照組患兒明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，三者間經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析具有線(xiàn)性正相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明HSP患兒因內(nèi)源性或外源性因素機(jī)體免疫上游的TLR9、MyD88、NF-κB被激活，同時(shí)我們也檢測(cè)到免疫下游細(xì)胞因子IL-6、TNF-α在HSP組比正常對(duì)照組明顯升高，且與上游的TLR9、MyD88、NF-κB存在線(xiàn)性正相關(guān)關(guān)系。因此在HSP發(fā)病過(guò)程中，TLR9-MyD88-NF-κB信號(hào)通道作為上游信號(hào)受到外界刺激被活化后，繼而引起下游炎癥介質(zhì)，包括自由基，細(xì)胞因子，前列腺素類(lèi)和補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)，打破機(jī)體的免疫耐受，導(dǎo)致HSP的發(fā)病。

因此如果對(duì)免疫反應(yīng)上游的TLR9或MyD88進(jìn)行干預(yù)，是否可減輕HSP癥狀或進(jìn)行早期預(yù)防，這將是我們下一步研究的重點(diǎn)。

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Expression and significance of TLR9,MyD88 and NF-κB in HSP

WANG Ziwei YANG Lijun
Department of Pediatrics,Beijing Friendship Hospital Affiliated to Beijing Capital University,Beijing 100050,China

Objective To investigate the differences and correlations of immunological upstream factors of TLR9, MyD88,NF-κB and immunological downstream factors of IL-6 and TNF-αin the HSP group and normal control group.Methods The expression of TLR9,MyD88 and NF-κB in peripheral blood mononuclear cells(PBMC)of HSP were detected by real-time PCR.The levels of IL-6 and TNF-αwere measured by ELISA.Results①The expression of TLR9,MyD88 and NF-κB mRNA in peripheral blood mononuclear cells of children with HSP was significantly higher than that of normalcontrols；②The levels of IL-6 and TNF-αin plasma of HSP group were significantly higher than those in the control group；③There was a positive linear correlation between TLR9 and MyD88,TLR9 and NF-κB, MyD88 and NF-κB,NF-κB and IL-6,NF-κB and TNF-αin HSP group.Conclusion The levels of TLR9,MyD88, NF-κB,IL-6 and TNF-αin children with HSP are significantly higher than those in normal children.TLR9-MyD88-NF-κB signal pathways play an important role in the pathogenesis of HSP.

HSP；TLR9；MyD88；NF-κB；IL-6；TNF-α

R554.6

A

1673-9701（2016）29-0009-04

（2016-08-07）