冀建偉，周宇雪，劉 蕾#，劉富崗（1.鄭州大學第二附屬醫(yī)院藥學部，鄭州 450014；.鄭州市兒童醫(yī)院藥學部，鄭州 45005；.河南中醫(yī)藥大學藥學院，鄭州 450046）

厚樸花低聚糖、多糖的分離純化及其體外抗氧化活性研究

冀建偉1＊，周宇雪2，劉 蕾2#，劉富崗（31.鄭州大學第二附屬醫(yī)院藥學部，鄭州 450014；2.鄭州市兒童醫(yī)院藥學部，鄭州 450053；3.河南中醫(yī)藥大學藥學院，鄭州 450046）

目的：從厚樸花中分離、純化其低聚糖、多糖組分并考察其體外抗氧化活性。方法：取厚樸花先以80%乙醇為提取溶劑，采用回流提取法及柱色譜分段純化得到厚樸花低聚糖組分；再以厚樸花低聚糖提取后的藥渣為原料，用熱水回流提取法及分段純化得到厚樸花多糖組分。以2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）為陽性對照，通過1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率、還原能力、總抗氧化能力試驗考察不同質量濃度（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/ml）厚樸花低聚糖及多糖組分的體外抗氧化活性。結果：厚樸花的低聚糖、多糖組分在質量濃度為0.1～1.0 mg/ml時其DPPH自由基清除作用、還原能力和總抗氧化能力均隨質量濃度的增加而增強；且在3個試驗中，低聚糖組分分別在0.8～1.0、0.2～1.0、0.1～1.0 mg/ml時各抗氧化指標與BHT相當（P＞0.05）；各試驗中低聚糖組分的指標數據略高于多糖組分，但二者間比較多數指標差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論：厚樸花中的低聚糖和多糖組分均具有較強的體外抗氧化活性，低聚糖組分的體外抗氧化活性略優(yōu)于多糖組分。

厚樸花；低聚糖；多糖；分離；純化；抗氧化活性

厚樸花為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalis Rehd.et Wils.或凹葉厚樸Magnolia officinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.的干燥花蕾，收載于2015年版《中國藥典》（一部）中，其味苦、微溫，具有芳香化濕、理氣寬中的功效[1]。厚樸花主要含有厚樸酚、和厚樸酚，還含有低聚糖及多糖類成分，但關于厚樸花中低聚糖及多糖類的研究尚未見文獻報道。本試驗通過對厚樸花的低聚糖和多糖類組分及其體外抗氧化活性進行研究，為其進一步開發(fā)和利用提供理論依據。

1 材料

1.1 儀器

EVO300PC紫外-可見分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Sartorius BT125D精密電子分析天平（德國Sartorius公司）；N-1100V-WD旋轉蒸發(fā)儀（日本東京理化器械株式會社）；LGJ-10壓蓋型真空冷凍干燥機（河南兄弟儀器設備有限公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

厚樸花（購于張仲景大藥房，批號：20150409，經河南中醫(yī)藥大學董誠明教授鑒定為木蘭科植物厚樸的干燥花蕾。將其粉碎并過20目篩，置于干燥器中存放，備用）；葡聚糖凝膠Sephadex G-100、Sephadex G-200（瑞典Pharmacia公司）；D-無水葡萄糖對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110833-200904，純度：≥98%）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，批號：STBB0510，純度：≥99%）、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT，批號：W218405-10KG-K，純度：≥99%）均來源于美國Sigma公司；其他試劑均為國產分析純。

2 方法與結果

2.1 厚樸花低聚糖、多糖樣品的制備

取厚樸花加80%乙醇回流提取2次，過濾，藥渣備用，合并濾液，減壓濃縮揮盡乙醇，得厚樸花粗低聚糖部位浸膏。浸膏冷凍干燥得厚樸花粗低聚糖，加少量蒸餾水復溶，過濾，濾液依次通過D101大孔吸附樹脂柱、活性炭柱、Sephadex G-100凝膠樹脂柱層析[2]。分別以蒸餾水洗脫，收集洗脫液每管5 ml，Molish反應[3]檢識。取洗脫液1 ml于490 nm波長處測定吸光度，將管數編號對吸光度作圖，見圖1A。

圖1 洗脫曲線圖Fig 1 Elution curves

合并單一峰區(qū)的洗脫液（管數編號44～82），冷凍干燥，得到干燥的厚樸花低聚糖樣品（MOFO）。

將提取厚樸花低聚糖后的藥渣加蒸餾水，于80℃水浴提取2次，合并提取液，減壓濃縮。濃縮液加入4倍量95%乙醇，靜置，棄去上清液，收集下層沉淀冷凍干燥，加少量蒸餾水復溶，Sevage法[4]脫蛋白，冷凍干燥，加水復溶，過濾。濾液過Sephadex G-200凝膠柱層析，蒸餾水洗脫，按每管5 ml收集洗脫液。以苯酚-硫酸法于490 nm波長處測定吸光度，將管數編號對吸光度作圖，見圖1B。合并單一峰區(qū)洗脫液（管數編號20～50），真空冷凍干燥，得灰白色疏松粉末狀的厚樸花多糖樣品（MOFP）。

2.2 MOFO、MOFP的化學成分分析

利用Molish反應、茚三酮反應、FeCl3反應、硫酸-咔唑反應、碘-碘化鉀反應和雙縮脲反應對MOFO、MOFP進行化學成分分析[5]?；瘜W分析結果顯示，MOFO、MOFP的Molish反應均呈陽性，表明樣品為糖類化合物；茚三酮反應、碘-碘化鉀反應、FeCl3反應、硫酸-咔唑反應、雙縮脲反應均呈陰性，表明樣品中不含蛋白質、淀粉、酚類物質、糖醛酸或多肽。

2.3 MOFO、MOFP中糖含量的測定

參照苯酚-硫酸法[1，6]，取恒質量的D-無水葡萄糖對照品約50 mg，精密稱定，加蒸餾水溶解定容至50 ml量瓶中；分別精密吸取對照品溶液各1、2、3、4、5、6 ml，加蒸餾水定容至50 ml量瓶中。準確吸取系列質量濃度的對照品溶液各2 ml置于具塞試管中，以蒸餾水為空白，然后依次加入5%苯酚溶液1.0 ml、濃硫酸5.0 ml，以冰水混合物冷卻，490 nm波長處測定各溶液的吸光度。以吸光度為縱坐標（y）、葡萄糖的質量濃度為橫坐標（x，μg/ml），計算葡萄糖回歸方程為y＝0.006 9x+0.000 3（r＝0.999 9），其檢測質量濃度線性范圍為20.05～120.31 μg/ml。在相關的方法學考察中，MOFO、MOFP的精密度試驗吸光度的RSD均小于1.89%（n＝6）；加樣回收率分別為96.82%～100.47%（RSD＝1.46%，n＝9）、97.23%～101.14%（RSD＝1.51%，n＝9）。

準確稱取“2.1”項下MOFO、MOFP各3 mg，分別加蒸餾水定容至50 ml，測定樣品吸光度，根據回歸方程計算出MOFO、MOFP中糖含量分別為93.34%、94.51%。

2.4 MOFO、MOFP的體外抗氧化活性研究

2.4.1 DPPH自由基清除率的測定 根據經典的DPPH法[7-8]考察MOFO、MOFP的體外抗氧化能力。精密稱取MOFO、MOFP，分別加蒸餾水溶解，制備成不同質量濃度的MOFO、MOFP水溶液（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/ml）。取各溶液2.0 ml，分別加入2.0 mol/L的DPPH溶液2.0 ml，搖勻，室溫下于暗處放置3 min。以2.0 ml蒸餾水為空白對照，在517 nm波長處測定樣品溶液的吸光度，平行測定3次；以BHT為陽性對照。DPPH自由基的清除率計算公式為[A0－（A－Ab）/A0]× 100%。其中，A0為517 nm波長處DPPH溶液的吸光度，A為樣品與DPPH混合溶液的吸光度，Ab為不加DPPH的樣品溶液的吸光度。不同質量濃度MOFO、MOFP、BHT對DPPH自由基的清除率結果見表1。

表1 不同質量濃度MOFO、MOFP、BHT對DPPH自由基的清除率（±s，n＝3，%%）Tab 1 Clearance rate of MOFO，MOFP and BHT with different concentrations to DPPH free radica（l±s，n＝3，%%）

表1 不同質量濃度MOFO、MOFP、BHT對DPPH自由基的清除率（±s，n＝3，%%）Tab 1 Clearance rate of MOFO，MOFP and BHT with different concentrations to DPPH free radica（l±s，n＝3，%%）

注：與同質量濃度BHT比較，＊P＞0.05Note：vs.BHT with same concentration，＊P＞0.05

質量濃度，mg/ml 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 MOFO 18.5±0.34 26.2±0.51 56.3±0.82 75.6±1.13 87.6±1.66＊92.8±1.87＊84.4±1.71 MOFP 15.4±0.26 23.6±0.37 47.8±0.95 68.2±1.31 81.9±1.96 88.3±1.83＊80.3±1.22 BHT 52.7±0.52 69.2±0.77 78.4±0.93 84.3±1.15 91.2±1.46 94.7±1.71 95.6±1.84

由表1可知，MOFO、MOFP對DPPH自由基具有比較強的清除作用，且在樣品質量濃度0.1～1.0 mg/ml范圍內，清除作用隨質量濃度的升高而逐漸增強；當質量濃度為1.0 mg/ml時，MOFP、MOFO對DPPH自由基的清除率分別為（88.3± 1.83）%、（92.8±1.87）%；當質量濃度達到1.2 mg/ml時，MOFO、MOFP對DPPH自由基的清除作用不再繼續(xù)增強，而是呈現減弱趨勢。MOFO、MOFP、BHT對DPPH自由基的清除作用的半數抑制濃度（IC50）分別為0.395、0.459、0.206 mg/ml。當MOFO、MOFP、BHT的質量濃度較低時，2種樣品與BHT對DPPH自由基的清除率差異較大；當質量濃度較高（0.8、1.0 mg/ml）時，2種樣品與BHT對DPPH自由基的清除率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），且MOFO與BHT的清除率更接近。

2.4.2 還原能力的測定 參照還原能力測定的經典方法[9-10]測定MOFO、MOFP的還原能力。將不同質量濃度（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/ml）的MOFO、MOFP樣品溶液1.0 ml，加入0.2 mol/L的磷酸緩沖鹽溶液（pH 6.6）2.5 ml、1%的鐵氰化鉀溶液2.5 ml，混合；50℃水浴30 min，再加入10%三氯乙酸溶液2.5 ml。將所得混合液3 500 r/min離心（離心半徑15.5 cm）10 min，精密吸取上清液2.5 ml，加入蒸餾水2.5 ml和0.1%的三氯化鐵溶液0.5 ml，以BHT為陽性對照，在700 nm波長處測吸光度。吸光度值越大表明樣品的還原能力越強，則其抗氧化能力也越強。在質量濃度為0.1～1.0 mg/ml時，三者的吸光度均隨質量濃度增加而增大。不同質量濃度MOFO、MOFP、BHT的還原能力（吸光度）測定結果見表2。

表2 不同質量濃度MOFO、MOFP、BHT的還原能力（±s，n＝3）Tab 2 Reducing capacity of MOFO，MOFP and BHT with different concentration（s±s，n＝3）

表2 不同質量濃度MOFO、MOFP、BHT的還原能力（±s，n＝3）Tab 2 Reducing capacity of MOFO，MOFP and BHT with different concentration（s±s，n＝3）

注：與同質量濃度BHT比較，＊P＞0.05Note：vs.BHT with same concentration，＊P＞0.05

質量濃度，mg/ml 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 MOFO 0.322±0.005 0.413±0.004＊0.536±0.005＊0.628±0.005＊0.815±0.006＊0.972±0.007＊0.802±0.005 MOFP 0.231±0.003 0.324±0.005 0.375±0.007 0.486±0.005 0.617±0.006 0.726±0.007 0.585±0.005 BHT 0.423±0.004 0.506±0.005 0.591±0.004 0.715±0.006 0.892±0.006 1.124±0.011 1.128±0.012

2.4.3 總抗氧化能力的測定及與質量濃度的相關性分析 參照總抗氧化能力的經典測定方法[11]，以蒸餾水為溶劑制備不同質量濃度（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/ml）的MOFO、MOFP溶液。精密吸取各溶液1.0 ml置于10 ml的具塞試管中，加入試劑溶液3.0 ml[包括0.6 mol/L的濃硫酸、28 mmol/L的無水磷酸鈉、4 mmol/L的鉬酸銨]?；旌弦悍謩e于95℃水浴120 min，冷卻至室溫，695 nm波長處測定溶液的吸光度，以蒸餾水為空白對照。另取0.2 mg/ml的MOFO、MOFP溶液按上述操作，于95℃水浴反應不同時間（30、60、90、120、150 min）后測定吸光度。試驗均以BHT為陽性對照，平行測定3次。吸光度越大表明樣品的總抗氧化能力越強，即樣品所具有的抗氧化能力也越強。不同質量濃度及不同反應時間時各樣品的總抗氧化能力測定結果分別見表3、表4。

表3 不同質量濃度MOFO、MOFP、BHT的總抗氧化能力（±s，n＝3）Tab 3 Total antioxidant activity of MOFO，MOFP and BHT with different concentration（s±s，n＝3）

表3 不同質量濃度MOFO、MOFP、BHT的總抗氧化能力（±s，n＝3）Tab 3 Total antioxidant activity of MOFO，MOFP and BHT with different concentration（s±s，n＝3）

注：與同質量濃度BHT比較，＊P＞0.05Note：vs.BHT with same concentration，＊P＞0.05

質量濃度，mg/ml 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 MOFO 0.234±0.006＊0.379±0.006＊0.512±0.008＊0.727±0.011＊0.866±0.010＊0.952±0.012＊0.832±0.009＊MOFP 0.217±0.007＊0.362±0.008＊0.465±0.006＊0.682±0.010＊0.817±0.009＊0.886±0.012＊0.776±0.011 BHT 0.225±0.007 0.369±0.008 0.484±0.007 0.693±0.009 0.829±0.008 0.904±0.011 0.912±0.011

表4 不同反應時間下MOFO、MOFP、BHT的總抗氧化能力（±s，n＝3）Tab 4 Total antioxidant activity of MOFO，MOFP and BHT under different reaction tim（e±s，n＝3）

表4 不同反應時間下MOFO、MOFP、BHT的總抗氧化能力（±s，n＝3）Tab 4 Total antioxidant activity of MOFO，MOFP and BHT under different reaction tim（e±s，n＝3）

注：與同質量濃度BHT比較，＊P＞0.05Note：vs.BHT with same concentration，＊P＞0.05

反應時間，min 30 60 90 120 150 MOFO 0.412±0.007＊0.524±0.006＊0.638±0.009＊0.744±0.011＊0.861±0.015＊MOFP 0.317±0.008 0.428±0.009 0.591±0.011＊0.652±0.013＊0.784±0.017＊BHT 0.391±0.009 0.502±0.011 0.607±0.012 0.712±0.015 0.823±0.018

表3、表4結果表明，MOFO、MOFP具有較強的總抗氧化能力，質量濃度為0.1～1.0 mg/ml時，二者的吸光度均隨質量濃度增加而增大；質量濃度為0.2 mg/ml時，吸光度隨反應時間的延長而增大；與BHT比較，MOFO具有更強的抗氧化能力，MOFP的總抗氧化能力略低，但三者兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義。

將質量濃度與吸光度進行相關性分析，結果表明，在質量濃度0.1～1.0 mg/ml范圍內，MOFO、MOFP的總抗氧化能力（y）與質量濃度（x）呈顯著正相關，相關回歸方程分別為y＝0.803 6x+0.196 5（R2＝0.980 8）、y＝0.751 6x+0.183 2（R2＝0.975 6）；而在質量濃度0.1～1.2 mg/ml范圍內，MOFO、MOFP的相關回歸方程分別為y＝0.572 1x+0.249 3（R2＝0.850 6）、y＝0.612 6x+0.266 8（R2＝0.856 2）。

3 討論

自由基具有強氧化性，在正常情況下，人體內的自由基處于不斷產生與清除的動態(tài)平衡過程中，以確保機體生命活動的正常運行，當體內自由基的動態(tài)平衡被破壞，自由基可損害機體的組織和細胞而導致多種疾病的發(fā)生。低聚糖及多糖抗氧化作用的機制除了淬滅自由基的途徑外，還可能通過參與調動或激活機體的內源性抗氧化劑，使其數量增加和活性增強至機體需要的水平，從而發(fā)揮避免或減輕自由基對機體的損傷的作用。

低聚糖和多糖由于單糖聚合度的不同而產生巨大的分子質量差異，由于這一差異造成了二者在溶解性等理化性質上的差異顯著，如低聚糖溶于80%乙醇而多糖在80%乙醇中不溶。因此，利用此性質可先以80%乙醇為溶劑從藥材中提出低聚糖，再以水為溶劑從提取低聚糖的藥渣中提取多糖。本試驗即根據二者這一溶解性質的差異，分別采用不同的提取溶劑對厚樸花藥材中的低聚糖、多糖依次進行提??；然后再根據多糖和低聚糖分子質量大小和理化性質的差異，利用分子篩分離的原理選用不同孔徑的葡聚糖凝膠柱色譜對厚樸花低聚糖、多糖進行純化與分離，從而得到高純度的厚樸花低聚糖與多糖組分樣品即MOFO、MOFP。

本試驗通過對自由基清除作用、還原能力及總抗氧化能力的考察證實厚樸花低聚糖、多糖組分均是有效的自由基清除劑，并具有較強的還原能力、抗氧化能力，而且在質量濃度為0.1～1.0 mg/ml時各活性作用均與樣品質量濃度呈良好的正相關性。

厚樸花低聚糖及多糖組分的體外抗氧化作用機制可能是二者可直接淬滅自由基所致，而厚樸花低聚糖的體外抗氧化活性優(yōu)于多糖組分，可能與厚樸花低聚糖與多糖的結構差異有關，故有待深入研究。

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（編輯：劉 萍）

Study on the Separation and Purification of Oligosaccharide and Polysaccharide from the Flowers of Magnolia officinalis and Their in vitro Antioxidant Activity

JI Jianwei1，ZHOU Yuxue2，LIU Lei2，LIU Fugang3（1.Dept.of Pharmacy，the Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450014，China；2.Dept.of Pharmacy，Zhengzhou Children’s Hospital，Zhengzhou 450053，China；3.College of Pharmacy，Henan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450046，China）

OBJECTIVE：To separate and purify oligosaccharide and polysaccharide from the flowers of Magnolia officinalis，and to investigate their in vitro antioxidant capacity.METHODS：Using 80%ethanol as extraction solvent，the flowers of M.officinalis were extracted by reflux extraction and purified by column chromatogram to obtain oligosaccharide.The dregs of oligosaccharide extraction was used as raw material，and were extracted by hot water reflux extraction and purified by segmentation purification to obtain polysaccharide.Using 2，6-di-tert-butyl-4-methylphenol（BHT）as positive control，in vitro antioxidant capacity of different concentrations of oligosaccharide and polysaccharide from the flowers of M.officinalis（0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mg/ml）were investigated through clearance rate test，reducing capacity test，total antioxidant activity test of 1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine（DPPH）free radical.RESULTS：DPPH free radical clearance，reducing capacity and total antioxidant activity were enhanced as the increase of oligosaccharide and polysaccharide concentration，when the concentration of oligosaccharide and polysaccharide ranged 0.1-1.0 mg/ml.In 3 tests，antioxidant activity index of oligosaccharide were similar to those of BHT（P＞0.05）when the concentrations were 0.8-1.0，0.2-1.0，0.1-1.0 mg/ml.In 3 tests，most of antioxidant activity index of oligosaccharide were slightly higher than those of polysaccharide，without statistical significance（P＞0.05）.CONCLUSIONS：The oligosaccharide and polysaccharide from the flowers of M.officinalis show good in vitro antioxidant capacity，and in vitro antioxidant capacity of oligosaccharide is better than that of polysaccharide.

Flowers of Magnolia officinalis；Oligosaccharide；Polysaccharide；Separation；Purification；Antioxidant activity

R284.2；R285.5

A

1001-0408（2016）34-4848-04

2016-02-25

2016-06-12）

＊藥師，碩士。研究方向：藥物活性成分研究及應用。電話：0371-63974693。E-mail：jiwei_2002@163.com

#通信作者：藥師，碩士。研究方向：藥物活性成分研究及應用。E-mail：liulei2006@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.34.30