于 濤，楊云峰，李 兵，陳 凱，朱 輝，張明珠，趙有光，俞光榮

同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院骨科，上海 200065

Fn14-shRNA慢病毒載體的制備

于 濤，楊云峰，李 兵，陳 凱，朱 輝，張明珠，趙有光，俞光榮

同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院骨科，上海 200065

目的 構(gòu)建Fn14-shRNA慢病毒載體，以進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，研究Fn14在骨肉瘤中的表達(dá)和作用。方法 使用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建Fn14干擾載體、病毒包裝、感染細(xì)胞，并進(jìn)行鑒定。結(jié)果 Fn14-shRNA干擾質(zhì)粒單酶切驗(yàn)證陽(yáng)性，測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)完全一致，干擾組Fn14在穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中表達(dá)下調(diào)。結(jié)論 成功構(gòu)建了Fn14-shRNA慢病毒載體，為進(jìn)一步從分子水平探討Fn14在骨肉瘤中的生物學(xué)作用奠定了基礎(chǔ)。

骨肉瘤；細(xì)胞表面受體成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)14；RNA干擾；慢病毒

細(xì)胞表面受體成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)14 （Fn14）是一種Ⅰ型跨膜蛋白，最初以腫瘤壞死因子樣細(xì)胞凋亡弱誘導(dǎo)劑（TWEAK）受體的身份被人們發(fā)現(xiàn)。經(jīng)證實(shí)，TWEAK與Fn14結(jié)合后可激活下游通路，進(jìn)而誘導(dǎo)某些腫瘤細(xì)胞凋亡[1]，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生存和增殖[2]，提高腫瘤細(xì)胞侵襲力[3]，誘導(dǎo)腫瘤血管的形成[4]，促炎性反應(yīng)并藉此通過(guò)炎性遞質(zhì)的調(diào)控促進(jìn)腫瘤播散和轉(zhuǎn)移[5-6]。Fn14在乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腸腺癌和肝癌等多種惡性腫瘤中異常表達(dá)[7-10]，且在其配體TWEAK表達(dá)量很低甚至不表達(dá)的情況下亦可激活下游通路[11]，發(fā)揮其生物學(xué)作用，故Fn14是一個(gè)與很多惡性腫瘤發(fā)生相關(guān)的關(guān)鍵分子。因此它可能也在骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，是一種潛在的治療骨肉瘤的新型分子靶向。然而，F(xiàn)n14在骨肉瘤中是否表達(dá)異常、具有何種生物學(xué)作用等卻未見(jiàn)報(bào)道。

本研究主要通過(guò)Fn14-shRNA干擾重組慢病毒載體的制備和慢病毒包裝，用慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法建立Fn14基因下調(diào)的穩(wěn)轉(zhuǎn)U-2OS細(xì)胞株，以對(duì)其進(jìn)行下一步骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的檢測(cè)。

1　材料與方法

1.1材料

①質(zhì)粒為慢病毒主質(zhì)粒pLKO.1-TRC；慢病毒載體系統(tǒng)，該病毒包裝系統(tǒng)為三質(zhì)粒系統(tǒng)，由pLKO.1-TRC、psPAX2和pMD2.G組成，其中，pLKO.1-TRC具有PURO抗性，用于穩(wěn)轉(zhuǎn)篩選，psPAX 2和pMD2.G含有病毒包裝所必須的元件；②菌株：大腸桿菌DH5a；③細(xì)胞系：293T為美國(guó)ATCC來(lái)源人胚腎細(xì)胞系，用含10%胎牛血清的DMEM于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)；④試劑和試劑盒：DMEM培養(yǎng)基[High glucose，4 500mg/LGlucose，4.0mmol/LL-Glutam ine，110mg/ L Sodium Pyruvate；1/100（v/v）Penicillin/strepen （Gibco 15140-122）]、10%胎牛血清均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，質(zhì)粒DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒均購(gòu)自天根生化科技有限公司，1st strand cDNA Synthesis Kit、限制性內(nèi)切酶BamHI、EcoRI和1kb plus DNAMarker均購(gòu)自TAKARA公司，DNA聚合酶PFU酶、T4 DNA連接酶均購(gòu)自天根生化科技有限公司，轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectam ineTM2000購(gòu)自Invitrogen公司；⑤ 實(shí)驗(yàn)儀器：熒光定量PCR儀（ABI 7500型），RNA/DNA calculator（Pharmacia公司），高速冷凍離心機(jī)（BECKMAN公司），Mastercycler 96孔 PCR儀（Eppendorf公司），DYY-6C型穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀（北京六一儀器廠），Gel Doc 1000凝膠成像系統(tǒng)（BIO RAD），CO2恒溫培養(yǎng)箱（Nuaire）。

1.2方法

1.2.1 Fn14干擾載體的構(gòu)建

根據(jù)Genebank報(bào)道的FN14的mRNA序列和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，從基因起始密碼子下游尋找符合設(shè)計(jì)特征的靶序列。其美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）號(hào)為NM_016639.2。經(jīng)BLAST Search檢索確認(rèn)與其他的人類已知基因序列無(wú)同源性。然后針對(duì)靶點(diǎn)序列，將轉(zhuǎn)錄出shRNA的DNA雙鏈從莖環(huán)處設(shè)計(jì)為兩段。根據(jù)siRNA序列，設(shè)計(jì)成針對(duì)其編碼區(qū)核苷酸堿基序列的1對(duì)寡核苷酸鏈。其順序依次為21nt的正義序列、9nt的loop插入序列、21nt的反義序列和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。FN14-shRNA片段1：ACCGGTCGGACCTGGACAAGTGCATTTCAAGAGAATGCACTTGTCCAGGTCCGTTTTTTGAAT TC；FN14-shRNA片段2：AATTCAAAAAACGGACCTGGACAAGTGCATTTCAAGAGAATGCACT TGTCCAGGTCCGA；NC-shRNA片段1：CCGGAGCGACTGTGCCAATTCCATTCTC GAGAATGGAATTGGCACAGTCGCTTTTTTG；NC-shRNA片段2：AATTCAAAAAAAGCGACTGTGCCAATTCCATTCTCGAGAATGGAATTGGCACAGTCGC。

shRNA雙鏈的制備。合成單鏈DNA oligo，把片段1、片段2干粉溶解于退火緩沖液中，90℃水浴15 m in，然后自然冷卻至室溫，使其復(fù)性成雙鏈。plko.1-TRC載體雙酶切及回收、連接轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒抽提，步驟如上。單酶切鑒定：利用該內(nèi)切酶EcoRI對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行單酶切反應(yīng)。酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，如果電泳條帶單一，且大小適當(dāng)，表明該質(zhì)粒克隆為陽(yáng)性，否則為陰性。測(cè)序鑒定：此抽提質(zhì)粒測(cè)序由上海博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。測(cè)序引物為：CACGCTGTTTTGACCTCCATAGAA。

1.2.2 Fn14干擾病毒包裝

慢病毒包裝細(xì)胞轉(zhuǎn)染用胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞，重新接種于10m L的10 cm2細(xì)胞培養(yǎng)皿，在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)90%～95%時(shí)轉(zhuǎn)染。先吸去培養(yǎng)基，然后用無(wú)菌的PBS洗1次，然后加入5m L無(wú)血清培養(yǎng)基。制備慢病毒包裝系統(tǒng)中三種質(zhì)粒DNA溶液：加入DMEM至500μL，室溫放置5m in；另外取一無(wú)菌EP管，加入450μL的DMEM，然后加入50μL脂質(zhì)體Lipofectam ineTM2000，室溫放置5 m in。然后將脂質(zhì)體緩慢的加入質(zhì)粒DNA中，混勻，室溫放置20m in。將DNA和脂質(zhì)體混合液轉(zhuǎn)移至含單層細(xì)胞的培養(yǎng)液中，混勻，培養(yǎng)6 h后棄去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)液，加入10m L的PBS，輕搖后棄去，重復(fù)該步驟3次；每瓶細(xì)胞中加入含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液10m L，繼續(xù)培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)基變黃時(shí)，收集轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞上清液；重新加入新鮮含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)收集病毒。在48和72 h時(shí)收集2次。將收集的上清液于4℃，4 000×g離心10m in，收集上清液；將上清液以0.45μm濾器過(guò)濾上清液于40m L超速離心管中。50 000×g超離心1.5 h。收集離心所得沉淀即為慢病毒粒子，用1m L的PBS液稀釋慢病毒備用。使用實(shí) 時(shí) 定 量 PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）法測(cè)定滴度。

感染細(xì)胞：接種目的細(xì)胞于6 cm培養(yǎng)皿中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到30%～45%左右時(shí)，加入2m L的病毒上清，同時(shí)加入3m L含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，加入polybrene至終濃度6μg/m L，24 h后更換為正常培養(yǎng)基。若48 h能長(zhǎng)到80%～90%視為穩(wěn)定生長(zhǎng)，熒光顯微鏡觀察慢病毒感染效率。3 d后觀測(cè)GFP表達(dá)情況，然后做流式篩選GFP陽(yáng)性細(xì)胞為穩(wěn)轉(zhuǎn)株，將細(xì)胞移至96孔板進(jìn)行培養(yǎng)，然后進(jìn)行放大培養(yǎng)，依次為96孔板、24孔板、6孔板，6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，凍存細(xì)胞。制備不攜帶干擾基因的空載組細(xì)胞，未進(jìn)行任何處理的骨肉瘤細(xì)胞為對(duì)照組。

穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的鑒定：使用Western blot和qRT-PCR技術(shù)對(duì)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株、空載組和對(duì)照組中Fn14的表達(dá)含量進(jìn)行檢測(cè)，具體方法同前。

2　結(jié)果

2.1測(cè)序結(jié)果

Fn14-shRNA干擾質(zhì)粒單酶切驗(yàn)證陽(yáng)性，測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)完全一致，質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖1、2）。

圖1　Fn14-shRNA單酶切驗(yàn)證結(jié)果Fig.1 Resu ltsof single restriction enzym e verification

圖2　Fn14-shRNA測(cè)序結(jié)果Fig.2 Fn14-shRNA sequencing resu lts

2.2無(wú)關(guān)對(duì)照慢病毒載體NC-shRNA插入序列

無(wú)關(guān)對(duì)照慢病毒載體NC-shRNA插入序列為CCGGAGCGACTGTGCCAATTCCATTCTCGAGA ATGGAATTGGCACAGTCGCTTTTTTGAATTC，NC-shRNA測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)完全一致，表明對(duì)照干擾載體已經(jīng)構(gòu)建成功（圖3）。

圖3　NC-shRNA對(duì)照載體測(cè)序結(jié)果Fig.3 NC-shRNA sequencing results

2.3滴度檢測(cè)結(jié)果

加入不同病毒量的細(xì)胞樣品，通過(guò)提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，通過(guò)比較對(duì)照組和試驗(yàn)組的Ct值差異判斷滴度值（表1）。繪制的Puro的溶解曲線如下（圖4）。繪制的Actin的溶解曲線如下（圖5）。

圖4　抗生素抗性基因Puro溶解曲線Fig.4 Solubility curve of antibiotic resistance gene Puro

圖5　內(nèi)參Actin熔解曲線Fig.5 Solubility curve of internal reference Action

表1　抗生素抗性基因Puro及內(nèi)參檢測(cè)的Ct值Tab.1 Ctvaluesof antibiotic resistance gene Puro and internal reference

2.4穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的鑒定結(jié)果

通過(guò)Western blot技術(shù)對(duì)干擾組、空載組和對(duì)照組三組細(xì)胞株中Fn14的含量進(jìn)行檢測(cè)，比較三組間的數(shù)值差異，使用SPSS 17.0，經(jīng)方差分析（三組間方差檢驗(yàn)齊性），三組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=69.48，P＜0.000 1）兩兩比較發(fā)現(xiàn)干擾組與對(duì)照組和空載組均差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而空載組和對(duì)照組間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。干擾組Fn14表達(dá)量較其他兩組低（圖6、7，表2）。

圖6　Western blot電泳結(jié)果Fig.6 ResultsofWestern blot

圖7　根據(jù)W estern b lot統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)繪制的Fn14相對(duì)表達(dá)量統(tǒng)計(jì)圖Fig.7 The relative expression of Fn14 according to Western blot results

表2　對(duì)照組、空載組及干擾組的化學(xué)發(fā)光與內(nèi)參的灰度系數(shù)比Tab.2 Gamm a ratio of controlgroup，no-load group and interference group com pared w ith internal reference

通過(guò)Realtime qPCR技術(shù)對(duì)干擾組、空載組和對(duì)照組三組細(xì)胞株中Fn14的含量進(jìn)行檢測(cè)，比較三組間的數(shù)值差異，使用SPSS 17.0，經(jīng)方差分析（三組間方差檢驗(yàn)齊性），三組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 27.22，P=0.001）兩兩比較發(fā)現(xiàn)干擾組與對(duì)照組和空載組均差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而空載組和對(duì)照組間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。干擾組Fn14表達(dá)量較其他兩組低（表3、圖8）。

表3　標(biāo)準(zhǔn)化后的CT值Tab.3 Standardized CT values

3　討論

RNA干擾（RNA interference，RNAi）指在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的、雙鏈RNA誘發(fā)的同源mRNA特異性降解，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型[12]。此技術(shù)可以此阻礙特定基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄，高效特異地抑制某特定基因表達(dá)，達(dá)到基因敲除的效果，故被廣泛應(yīng)用于基因功能和惡性腫瘤治療研究，具有高效、特異等特點(diǎn)。

RNAi是通過(guò)一些穩(wěn)定的中間遞質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，首先雙鏈RNA降解為較小的RNA分子，爾后他們序列互補(bǔ)與mRNA結(jié)合，從而使得mRNA降解。長(zhǎng)度21～23 nt的小RNA分子正是引起RNA干擾的直接原因，被稱為小干擾RNA（siRNA）[13-14]。siRNA的制備有多種方法，包括體外制備和體內(nèi)表達(dá)兩大類。體外制備需要專門的RNA轉(zhuǎn)染試劑將siRNA轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi)，而體內(nèi)表達(dá)則是轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的DNA模板在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄得到siRNA。體外制備方法主要包括化學(xué)合成、體外轉(zhuǎn)錄和長(zhǎng)片段dsRNAs經(jīng)RNaseⅢ類降解。體內(nèi)表達(dá)主要有siRNA表達(dá)載體或病毒載體在細(xì)胞中表達(dá)siRNA和PCR制備的siRNA表達(dá)框在細(xì)胞中表達(dá)。其中除長(zhǎng)片段dsRNAs經(jīng)RNaseⅢ類降解法外，均需要單獨(dú)設(shè)計(jì)siRNA序列?；瘜W(xué)合成方法相對(duì)價(jià)格較為昂貴，對(duì)細(xì)胞和動(dòng)物都存在一定毒性，定制周期長(zhǎng)，無(wú)法長(zhǎng)期產(chǎn)生基因沉默的效果，故本實(shí)驗(yàn)未采用。體外轉(zhuǎn)錄以DNA Oligo為模板，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄合成siRNA，其成本相對(duì)于化學(xué)合成較低，而且獲得siRNA更快，但是反應(yīng)的規(guī)模和量受到限制，最適合用于篩選siRNA，特別是需要制備多種siRNA時(shí)，故本實(shí)驗(yàn)也沒(méi)用使用此方法。用RNaseⅢ消化長(zhǎng)片段雙鏈RNA制備siRNA，無(wú)需設(shè)計(jì)和檢驗(yàn)多個(gè)siRNA序列以找到有效的siRNA，但是本方法有可能引發(fā)非特異性的基因沉默，特別是同源或者是密切相關(guān)的基因，本方法不適用于需要一個(gè)特定siRNA進(jìn)行的研究，在本研究中也沒(méi)有采納。siRNA表達(dá)框架由PCR得到siRNA表達(dá)模板，能夠直接導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)而無(wú)需事前克隆到載體中，但是PCR產(chǎn)物很難轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染效率有待于進(jìn)一步提高，更適合于篩選siRNA序列，所以本研究也未使用此方法。而siRNA表達(dá)載體可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)更多的siRNA，適合已知一個(gè)有效的siRNA序列，需要維持較長(zhǎng)時(shí)間基因沉默的研究，故本實(shí)驗(yàn)采納此方法。

慢病毒載體是以人類免疫缺陷病毒-1為來(lái)源的一類病毒載體，屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科，其包含了包裝、轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定整合所需的遺傳信息。攜帶有外源性基因的慢病毒載體在包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系的輔助下，經(jīng)過(guò)病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒，通過(guò)感染細(xì)胞或活體組織，實(shí)現(xiàn)外源基因在細(xì)胞或活體組織中表達(dá)。慢病毒載體可以感染非分裂期的細(xì)胞，在非有絲分裂細(xì)胞中復(fù)制，且能夠穩(wěn)定長(zhǎng)期表達(dá)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于RNA干擾中。

Fn14是TWEAK的受體，是一種Ⅰ型跨膜蛋白，TWEAK與其結(jié)合后會(huì)激活下游通路，從而引發(fā)一系列的生物學(xué)效應(yīng)。Fn14已被證實(shí)在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，且被激活后有可能刺激腫瘤細(xì)胞增殖、分化和遷移[1-3]，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤血管生成的作用[4]，是多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子[5-6]。而對(duì)于惡性程度較高且發(fā)病機(jī)制尚不清楚的骨肉瘤中，F(xiàn)n14的表達(dá)情況和生物學(xué)意義未有報(bào)道。在Pubmed公開(kāi)的基因芯片數(shù)據(jù)中顯示，F(xiàn)n14在骨肉瘤中表達(dá)較正常骨組織顯著增高，這說(shuō)明Fn14有可能在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定作用。本研究我們使用RNA干擾技術(shù)下調(diào)Fn14基因在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)，并經(jīng)鑒定病毒包裝和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建成功。這為進(jìn)一步通過(guò)侵襲實(shí)驗(yàn)、增殖實(shí)驗(yàn)或凋亡實(shí)驗(yàn)等研究Fn14在骨肉瘤細(xì)胞中發(fā)揮的具體作用奠定了基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)首先根據(jù)既往文獻(xiàn)報(bào)道的mRNA序列，從基因起始密碼子下游尋找合適的符合設(shè)計(jì)特征的靶序列，合成shRNA雙鏈，并進(jìn)行單酶切鑒定和測(cè)序鑒定。Fn14-shRNA干擾質(zhì)粒單酶切電泳驗(yàn)證為陽(yáng)性，測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)一致，質(zhì)粒構(gòu)建成功；而NC-shRNA測(cè)序結(jié)果也與設(shè)計(jì)完全一致，說(shuō)明對(duì)照的干擾載體也已經(jīng)構(gòu)建成功。

進(jìn)而下一步加入不同病毒量的細(xì)胞樣品，提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，再進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，得出滴度值＞3.00×109TU/m L。本研究中的溶解曲線做圖沒(méi)有出現(xiàn)雜峰，也未出現(xiàn)主峰的異常增寬，表明實(shí)驗(yàn)中未出現(xiàn)污染、引物二聚體和非特異性擴(kuò)增。

在對(duì)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建的鑒定中，我們使用qRT-PCR和Western blot技術(shù)，經(jīng)檢測(cè)Fn14在穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中表達(dá)下調(diào)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)n14-shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建成功。

本研究成功構(gòu)建了Fn14-shRNA慢病毒載體，攜帶的干擾序列可以通過(guò)病毒感染整合到細(xì)胞基因組中，可以使用該方法得到的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株進(jìn)行Fn14的功能研究，對(duì)進(jìn)一步開(kāi)展增殖、凋亡、侵襲及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有重要意義。

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Construction and identification of Fn14-shRNA lentiviralvector

YU Tao，YANG Yunfeng，LIBing，CHEN Kai，ZHU Hui，ZHANGM ingzhu，ZHAO Youguang，YU Guangrong
DepartmentofOrthopaedics，TongjiHospital，TongjiUniversity School ofMedicine，Shanghai 200065，China

ObjectiveTo construct Fn14-shRNA lentiviral vector to further investigate the expression and biological significance of Fn14 in osteosarcomaw ith animal experiment.M ethods Fn14-shRNA vectorwas constructed by RNA interference technique，and viral packaging，cell co-transfection，and indentification were conducted.Results The single enzyme detection was positive，and the sequencing result was consistent w ith design.Fn14 was downregulated in stably transfected cell lines.Conclusion Fn14-sh RNA lentivirus recombinant vectors are successfully constructed，which lays the foundation for further study of the biologicalsignificance of Fn14 in osteosarcoma.

Osteosarcoma；Fibroblastgrow th factor-inducible14；RNA interference；Lentiviral

R681

A

2095-378X（2016）02-0096-06

10.3969/j.issn.2095-378X.2016.02.008

于濤（1985—），男，住院醫(yī)師，博士，研究足踝外科、骨科創(chuàng)傷、骨腫瘤

俞光榮，電子信箱：yuguangrong@hotmail.com

（2016-01-18）