曾憲卓+陳帥+王一飛+舒輝萍+張捷+滕嬌+李德智+莫建華

摘要：本文研究了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（IPS）分化為造血干細(xì)胞的能力。用小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞OP9與人類IPS共培養(yǎng)，將IPS分化為造血干細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)檢測造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)水平，實(shí)時(shí)熒光定量檢測分化過程中IPS與造血干細(xì)胞的基因表達(dá)水平的變化，用免疫磁珠法分離CD34+造血干細(xì)胞檢測細(xì)胞的集落形成能力。結(jié)果顯示：IPS與OP9細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)造血分化第四天IPS發(fā)生了變化，分化得到造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志物CD34。分化過程中多能性標(biāo)志基因Oct4表達(dá)下降，造血轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)升高，CD34的表達(dá)量逐漸升高，集落培養(yǎng)14天后得到紅系集落、粒系集落、巨核系集落等。從而得到結(jié)論通過將IPS細(xì)胞與OP9細(xì)胞共培養(yǎng)，可誘導(dǎo)IPS細(xì)胞分化為造血干細(xì)胞。

關(guān)鍵詞：IPS細(xì)胞；分化；造血干細(xì)胞

0 引言

目前，臨床上普遍使用造血干細(xì)胞移植，用于白血病、非霍奇金淋巴瘤、地中海貧血等病的治療。造血干細(xì)胞的主要來源是臍帶血、骨髓。如果直接進(jìn)行骨髓移植，則需要進(jìn)行人體的白細(xì)胞抗原配型，否則發(fā)生免疫排異會危及患者生命。現(xiàn)有臍帶血庫儲存的造血干細(xì)胞免疫原性弱，但數(shù)量供不應(yīng)求，使其在疾病中的臨床應(yīng)用中受到限制。隨著誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（IPS）提取技術(shù)的出現(xiàn)，使分化自身細(xì)胞變?yōu)榱爽F(xiàn)實(shí)，不但避免了倫理問題，解決了免疫排斥問題，造血干細(xì)胞的數(shù)量也能滿足臨床需求。下面將分化研究過程報(bào)道如下：

1 材料和方法

1.1細(xì)胞株的來源

小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞OP9購于美國ATCC，誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞IPS由中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院提供。

1.2試劑和儀器

小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞OP9的培養(yǎng)基為α-MEM，內(nèi)含20%的胎牛血清，OP9細(xì)胞誘導(dǎo)干細(xì)胞分化培養(yǎng)基為α-MEM（15%的DFBS、0.25%胰酶、0.1%明膠），CD34來自MACS公司。抗體為APS-TRA-1-85，半固體培養(yǎng)基購于SCT公司。流式細(xì)胞儀為美國AccuriC6型，定量PCR儀為CFX96型。

1.3方法

在六孔板中先鋪好1%的metrigel進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，每三天添加0.5mmol/L的EDTA，以保持對照組細(xì)胞的未分化狀態(tài)，OP9用細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)放在大小為10cm且鋪有0.1%的明膠的盤里，，每隔四天用胰酶消化傳代。細(xì)胞培養(yǎng)溫度為37℃，CO2濃度為0.5，濕度飽和。

OP9細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)4天后，將OP9的培養(yǎng)液換成誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的培養(yǎng)液，將UC013細(xì)胞洗兩遍后，再對邊緣部位細(xì)胞進(jìn)行消化，將細(xì)胞吸出后加入Dispace，再用槍頭吹吸混勻細(xì)胞后，將其轉(zhuǎn)移到加有分化培養(yǎng)液的細(xì)胞盤中搖勻，在與上述培養(yǎng)的溫度、空氣CO2濃度和濕度相同的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)的第二天將培養(yǎng)液換為共培養(yǎng)液，第四天開始每隔一天半換一次培養(yǎng)液，第九天收樣品。

免疫磁珠法分選CD34+細(xì)胞，將細(xì)胞用PBS洗兩遍，接著用胰蛋白酶進(jìn)行消化，制備單細(xì)胞懸液，再將細(xì)胞收集到離心管中進(jìn)行離心，收集沉淀，再向其中加入2%血清吹打均勻。過濾后，向其中加入FCR和 CD34標(biāo)記細(xì)胞，30秒后加入流式細(xì)胞緩沖液，再離心，然后吸取上清，加入流式細(xì)胞緩沖液重懸。將制備好的細(xì)胞懸液加入流式細(xì)胞儀進(jìn)行分離，通過流式細(xì)胞儀分離柱的CD34-細(xì)胞被移出分離柱棄之，最終，通過加壓洗脫分離柱上黏附的細(xì)胞，即得到CD34+細(xì)胞。

用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測，將共培養(yǎng)9天后的細(xì)胞用PBS清洗、胰蛋白酶消化后，制備單細(xì)胞懸液，收集到離心管中，靜置五秒后，用加有2%血清的流式緩沖液重懸，細(xì)胞過濾后，加入FCR和抗體，孵育15min，再用流式緩沖液清洗，重懸，最后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

集落形成實(shí)驗(yàn)。將分選的CD34+細(xì)胞接種到半固體培養(yǎng)基中，放于培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，每孔接種1萬個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)14-16天。然后，在顯微鏡下根據(jù)集落成的血細(xì)胞形成特征，對集落細(xì)胞進(jìn)行分類和計(jì)數(shù)。同時(shí)，提取共培養(yǎng)2、4、6、8、10和12天的細(xì)胞的RNA，用RT-PCR法檢測各基因在細(xì)胞中的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞培養(yǎng)與觀察

觀察培養(yǎng)的細(xì)胞，結(jié)果顯示，對照組未分化的人體細(xì)胞集落狀生長，呈扁平狀，排列緊密，沒有分化的跡象。實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)2天后的細(xì)胞，表面布滿細(xì)胞集落，已進(jìn)行造血干細(xì)胞分化。OP9細(xì)胞貼著細(xì)胞壁生長，細(xì)胞為三角形，周圍向外出伸出像纖維狀的偽足，細(xì)胞排列規(guī)則，生長迅速，培養(yǎng)4天后細(xì)胞鋪滿了培養(yǎng)皿底。

2.2誘導(dǎo)造血干細(xì)胞分化

通過在本實(shí)驗(yàn)組的誘導(dǎo)分化條件下，對實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞的培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分化到一定程度后，便開始大量克隆，細(xì)胞的形態(tài)也發(fā)生了分化，接著，OP9細(xì)胞開始出現(xiàn)老化跡象。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測

共培養(yǎng)9天后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞造血表面標(biāo)志物表達(dá)情況，用流式細(xì)胞儀分析培養(yǎng)細(xì)胞的CD34、CD43、CD31的表達(dá)情況，結(jié)果顯示表達(dá)上述表面標(biāo)志物的細(xì)胞分別占有比例為20%、2%和7.1%。

2.4 4RT-PCR檢測

運(yùn)用RT-PCR對共培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)檢測，結(jié)果顯示，IPS細(xì)胞發(fā)生造血分化時(shí)，Oct-4基因的表達(dá)慢慢消失；造血轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)緩慢升高；Runx-1基因在造血干細(xì)胞分化12天當(dāng)中的表達(dá)呈波浪式變化，其中分化第二天表達(dá)量最高，第四天開始下降，第八天開始升高；CD34在造血分化過程中的基因表達(dá)量逐漸增高。

2.5 CD34+細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)

CD34+細(xì)胞在半固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)造血干細(xì)胞的形態(tài)特征，對細(xì)胞集落進(jìn)行分類和計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，紅系集落（CFU-E）、粒系集落（CFU-G）、巨核系集落（CFU-M）、粒—巨核系集落（CFU-GM）集落數(shù)量持續(xù)升高，混合系集落（CFU-GEMM）的集落數(shù)量逐漸降至最低。

3 討論

隨著干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，通過誘導(dǎo)分化得到造血干細(xì)胞已經(jīng)成為事實(shí)。相對于多能干細(xì)胞而言，IPS通過導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄因子以及重編程進(jìn)行定向分化的比例較低，，但是IPS的獲得方法比較簡單穩(wěn)定，避免了胚胎干細(xì)胞面臨的倫理和法律等問題，使IPS可以應(yīng)用于細(xì)胞替代性治療，并可以進(jìn)行疾病的機(jī)理研究和腫瘤治療藥物的篩選。IPS細(xì)胞分化得到的造血干細(xì)胞免疫原性較低，解決了移植排斥的問題。

在本文的研究中，沒有外加細(xì)胞因子，直接將IPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化為造血干細(xì)胞，結(jié)果獲得了20%的CD34+細(xì)胞，即造血干細(xì)胞，CD34是表達(dá)于造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志物，表明IPS可以分化為造血干細(xì)胞，但是轉(zhuǎn)化率比較低。Runx1是調(diào)控造血干細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子，期基因的表達(dá)量在分化過程中呈現(xiàn)波浪式的變化，Gata-2的表達(dá)則逐漸升高。體外分化得到的造血干細(xì)胞在半固體培養(yǎng)基中成集落狀態(tài)，說明IPS可以向各細(xì)胞系進(jìn)行分化。

現(xiàn)在多能干細(xì)胞分化為造血干細(xì)胞的方法主要有：一是形成胚狀體后再進(jìn)行誘導(dǎo)生成造血干細(xì)胞；二是基質(zhì)細(xì)胞與多能干細(xì)胞共培養(yǎng)；三是形成EB后與OP9進(jìn)行共培養(yǎng)；四是單層誘導(dǎo)ESC生成造血干細(xì)胞。利用OP9細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞共培養(yǎng)，可以模擬體內(nèi)的造血微環(huán)境，為研究細(xì)胞定向分化為造血干細(xì)胞創(chuàng)造了可能性，OP9細(xì)胞主要支持早期的造血干細(xì)胞分化，并協(xié)助B淋巴細(xì)胞增殖?；|(zhì)細(xì)胞通過釋放的細(xì)胞因子支持造血干細(xì)胞的分化。這種誘導(dǎo)方法分化時(shí)間短，為臨床造血干細(xì)胞的移植提供了便利。誘導(dǎo)分化過程中不用添加細(xì)胞因子，比較經(jīng)濟(jì)。但該誘導(dǎo)方法也存在著一定的缺點(diǎn)，即存在鼠源性污染細(xì)胞的可能性，加之所用血清的成分的不明確性，限制了其在臨床應(yīng)用。

目前臨床上移植造血干細(xì)胞主要是用臍血和骨髓來源的造血干細(xì)胞，而體外分化和擴(kuò)增得到造血干細(xì)胞只能通過動(dòng)物試驗(yàn)來獲得。將造血干細(xì)胞植入重建小鼠體內(nèi)，可以評價(jià)造血干細(xì)胞的功能。體外分化獲得的造血干細(xì)胞和臍血中的造血干細(xì)胞與重建小鼠體內(nèi)造血系統(tǒng)差異較大，需要進(jìn)一步優(yōu)化體外誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為造血干細(xì)胞的過程，才能滿足該實(shí)驗(yàn)需求

4 小結(jié)

通過將IPS定向分化為造血干細(xì)胞的研究，成功誘導(dǎo)了造血干細(xì)胞，分化得到的細(xì)胞在體外培養(yǎng)中形成了所需的各系集落，本文的研究所采用的技術(shù)方法希望可以為IPS細(xì)胞在造血疾病中的應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

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