張艷麗，容維中，徐建峰，任茂源，郭彬彬

(1.平?jīng)鍪修r(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測檢驗中心,甘肅 平?jīng)?74400;2.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅 平?jīng)?744000;3.華池縣草畜產(chǎn)業(yè)示范園區(qū)管理辦公室，甘肅 華池 745600)

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早勝牛GH基因多態(tài)性與其生長發(fā)育性狀的相關(guān)性分析

張艷麗1，容維中2*，徐建峰2，任茂源3，郭彬彬3

(1.平?jīng)鍪修r(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測檢驗中心,甘肅 平?jīng)?74400;2.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅 平?jīng)?744000;3.華池縣草畜產(chǎn)業(yè)示范園區(qū)管理辦公室，甘肅 華池 745600)

[目的]為研究GH基因多態(tài)性對早勝牛生長發(fā)育性狀的影響，確定可用于肉牛新品種選育的優(yōu)勢基因型。[方法]采用PCR-SSCP方法和DNA測序技術(shù)檢測了GH基因第2外顯子及第5外顯子的遺傳多態(tài)性，應(yīng)用最小二乘線性模型分析了不同基因型與不同生長階段體重、體尺及肉用指數(shù)的相關(guān)性。[結(jié)果]GH基因第2外顯子存在2處SNPs，產(chǎn)生了2個等位基因和3種基因型，多態(tài)信息含量為0.21，屬于低度多態(tài)；第5外顯子存在3處SNPs，產(chǎn)生2個等位基因了和2種基因型，多態(tài)信息含量為0.32，屬于中度多態(tài)。相關(guān)性分析表明，第2外顯子，初生重和6月齡重，BB型與AB顯著高于AA型(\%P\%<0.05)；周歲重，BB型顯著高于AA型與AB型(\%P\%<0.05)；第5外顯子，初生重、6月齡重、周歲重及肉用指數(shù)，CD型都顯著高于CC型(\%P\%<0.05)。[結(jié)論]GH基因第5外顯子多態(tài)性更為豐富，選擇潛力較大，可以作為早勝牛肉用方向選育的有效分子標記。

早勝牛；GH基因；PCR-SSCP；生長發(fā)育性狀；選育

畜禽遺傳資源對促進畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展和豐富生物多樣性具有重要的科學(xué)意義與應(yīng)用價值。早勝牛是甘肅省隴東地區(qū)經(jīng)過30多年的實踐選育而成的優(yōu)良地方類群，具有較高的秦川牛血統(tǒng)，在生產(chǎn)性能和體型外貌上更加接近秦川牛，是甘肅省黃牛改良的當家品種，于2009年列入甘肅省25個畜禽遺傳資源保護品種之一[1]。

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，應(yīng)用分子標記技術(shù)研究影響畜禽經(jīng)濟性狀表達的功能基因及其多態(tài)性，并以此挖掘和利用地方品種的優(yōu)良特性，已成為動物遺傳育種研究的熱點之一。生長激素(GH)是由腦垂體分泌的一種具有廣泛生理功能的多肽類激素，對脊椎動物的骨骼生長及分化，糖類、蛋白質(zhì)及脂肪代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用[2-3]，研究表明[4-6]，GH基因多態(tài)性對畜禽生長發(fā)育性狀及肉用性狀具有顯著影響。

本研究以挖掘早勝牛品質(zhì)內(nèi)涵和豐富遺傳多樣性為宗旨，采用PCR—SSCP檢測技術(shù)和DNA測序技術(shù)對早勝牛GH基因第2外顯子及第5外顯子多態(tài)性進行研究，并運用最小二乘線性模型對不同基因型與生長發(fā)育性狀的相關(guān)性進行分析，以期確定可用于早期肉用性狀選育的優(yōu)勢基因型，并結(jié)合體型外貌選留優(yōu)秀個體組建核心群，加快甘肅肉牛新品種選育進程，促進優(yōu)良種質(zhì)資源的保護和集成創(chuàng)新。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及血樣采集

186頭體質(zhì)健康、發(fā)育良好的早勝牛(公牛63頭、母牛123頭)均來自慶陽市寧縣興旺牧業(yè)有限責(zé)任公司，采用靜脈采血法每頭牛采集血樣6 mL，加入檸檬酸葡萄糖抗凝后低溫條件下帶回實驗室，于-20 ℃保存待用。

1.2 DNA提取及檢測

采用Omegabiotek公司生產(chǎn)的D3471型血液DNA提取試劑盒對基因組DNA進行提取，經(jīng)濃度為10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度，檢測合格的DNA樣品，用于PCR反應(yīng)。

1.3 引物設(shè)計及PCR擴增

采用Prime 5.0 軟件在GH基因第2外顯子及第5外顯子區(qū)域設(shè)計2對特異性引物，由北京三博遠志生物技術(shù)有限責(zé)任公司進行合成。其中，第2外顯子引物序列(命名為GH-1)：上游5′-TTGGGCTTTAGGGCTTCCGAA-3′，下游5′- TGAACTCCTCAGTTTCCTCCC-3′；第5外顯子引物序列(命名為GH-2)：上游5′-TCTCCAAGCCTGTAG-3′，下游5′-GCTGGCAACTAGAAG-3′。

參考《分子克隆實驗指南》(第三版)[7]，優(yōu)化確定PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件(表1、表2)，PCR 產(chǎn)物經(jīng)濃度為10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。

表1 PCR反應(yīng)體系

表2 PCR反應(yīng)程序

1.4 SSCP檢測及基因測序

取2 μL PCR產(chǎn)物與6 μL變性緩沖液(φ=98 %的甲酰胺、10 mmol/L EDTA、0.25 g/L的溴酚藍、0.25 g/L的二甲苯青)混勻，98 ℃變性10 min，冰浴5 min，然后上樣于φ=12 %和交聯(lián)度=29:1的非變性聚丙烯酰胺凝膠)，220 v 電壓4 ℃恒溫恒壓電泳16 h。根據(jù)銀染結(jié)果進行判型，將不同基因型送至北京三博遠志生物技術(shù)有限公司進行純化和測序。

1.5 測定指標及數(shù)據(jù)處理

采用BioEdit軟件分析堿基突變情況，采用PopGen 32、PIC CALC V0.6軟件計算等位基因頻率、基因型頻率、群體純合度(Ho)、雜合度(He)和多態(tài)性信息含量(PIC)。

根據(jù)不同生長階段，測定試驗牛初生、1月齡、6月齡、周歲體重及周歲體高、體長、胸圍、肉用指數(shù)等指標，建立最小二乘線性模型，采用SPSS 13.0 軟件對GH基因不同基因型與生長發(fā)育性狀進行關(guān)聯(lián)分析。

最小二乘線性模型：

\%yijkmn=\%μ+\%Farmi+Breedj+Agek+Sexm+Markern+eijkmn\%

其中：yijkm 為個體表型記錄；μ為群體均值；Farmi為場別效應(yīng)；Breedj為品種效應(yīng)；Agek 為年齡效應(yīng)；Sexm為性別效應(yīng)；Markern為標記基因型效應(yīng)；eijkm為隨機誤差。

2 結(jié)果

2.1 PCR-SSCP檢測

GH基因第2外顯子及第5外顯子擴增結(jié)果顯示，PCR擴增產(chǎn)物條帶清晰，無非特異性片段，且片段長度與目的條帶大小基本一致(圖1、圖2)，可以進行SSCP檢測。

圖1 GH第2外顯子PCR擴增

經(jīng)SSCP檢測和DNA測序后發(fā)現(xiàn)，與Genebank公布的GH基因核苷酸序列相比(登錄號：M57764)，第2外顯子及第5外顯子均存在多態(tài)性。其中：在第2外顯子發(fā)現(xiàn)了2處SNPs，產(chǎn)生了2個等位基因(A、B)和3種基因型(AA、BB、AB)；第5外顯子發(fā)現(xiàn)了3處SNPs，產(chǎn)生2個等位基因了(C、D)和2種基因型(CC、CD)。堿基突變情況見圖3、圖4，確定的基因型見圖5、圖6。

2.2 分子遺傳特性分析

從表3可以看出，GH基因第2外顯子，早勝牛群體中等位基因A和基因型AA的基因頻率和基因型頻率最高，分別為優(yōu)勢等位基因和優(yōu)勢等位基因型。群體純合度較高，多態(tài)信息含量為0.21，屬于低度多態(tài)。

圖3 GH基因第2外顯子不同基因型測序

圖4 GH基因第5外顯子不同基因型測序

圖5 GH基因第2外顯子SSCP檢測

圖6 GH基因第5外顯子SSCP檢測

表3 GH基因第2外顯子遺傳多態(tài)分析

由表4可見，GH基因第5外顯子，早勝牛群體中優(yōu)勢等位基因和優(yōu)勢等位基因型分別為C和CD，多態(tài)信息含量為0.32，屬于中度多態(tài)。

表4 GH基因第5外顯子遺傳多態(tài)分析

2.3 不同基因型與生長發(fā)育性狀的相關(guān)性

從表5可以看出，GH基因第2外顯子，不同基因型與不同生長階段體重、體尺及肉用指數(shù)呈相關(guān)性。其中：1月齡重、周歲體高、周歲體長、肉用指數(shù)，3個基因型間差異不顯著(\%P\%>0.05)，但從平均數(shù)來看，以BB型最高；初生重和6月齡重，BB型與AB型間無顯著性差異(\%P\%>0.05)，但都顯著高于AA型(\%P\%<0.05)；周歲重，BB型顯著高于AA型與AB型(\%P\%<0.05)，且后者間差異不顯著(\%P\%>0.05)。

表5 GH基因第2外顯子不同基因型與生長發(fā)育性狀關(guān)聯(lián)分析

由表6可見，GH基因第5外顯子，初生重、6月齡重、周歲重、肉用指數(shù)，CD型都顯著高于CC型(\%P\%<0.05)；1月齡重、周歲體高、周歲體長、周歲胸圍，兩者間無顯著性差異(\%P\%>0.05)，但以CD型較高。

表6 GH基因第5外顯子不同基因型與生長發(fā)育性狀關(guān)聯(lián)分析

3 分析與討論

畜禽遺傳資源是保護生物多樣性和培育新品種的重要生物資源。根據(jù)農(nóng)業(yè)部2004～2008年全國畜禽遺傳資源調(diào)查結(jié)果，我國現(xiàn)有牛種120個，其中地方品種94個，有38個品種的種群數(shù)量開始下降，10個品種處于瀕危狀態(tài)和瀕臨滅絕，保種形勢不容樂觀。早勝牛作為甘肅省特有的地方類群，通過多年選育提高，形成了適應(yīng)隴東黃土高原自然環(huán)境的典型地域性，繼承了秦川牛的外貌特征和脂肪沉積好的優(yōu)良特性，具有培育現(xiàn)代肉牛的基礎(chǔ)和潛力。因此，在基因組水平上開展早勝牛的肉用性能研究，充分挖掘其品質(zhì)內(nèi)涵，對地方牛種的遺傳改良和種質(zhì)資源創(chuàng)新是非常必要的。

本研究采用生子生物學(xué)技術(shù)檢測了早勝牛GH基因不同位點的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)第2外顯子存在2處SNPs和3種基因型，第5外顯子存在3處SNPs和2種基因型，這與耿榮慶[8]、李永紅[9]、高雪[10]等在其他牛種中的檢測結(jié)果類似，此外，也有GH基因在其它位點存在多態(tài)性的報道[11～12]，上述研究都表明GH基因具有豐富的多態(tài)性，可以作為研究畜禽遺傳多樣性的候選基因。

雜合度 (He)、多態(tài)信息含量(PIC) 的大小可以用來反映群體遺傳變異水平的高低，其數(shù)值越大，表明群體遺傳多樣性越豐富，選擇潛力更大。本研究表明， GH基因第2外顯子，早勝牛群體雜合度和多態(tài)信息含量分別為0.18和0.21，屬于低度多態(tài)；第5外顯子，群體雜合度和多態(tài)信息含量分別為0.13和0.32，屬于中度多態(tài)。這表明第5外顯子，早勝牛群體遺傳變異程度更高，多態(tài)性更為豐富，更適合作為經(jīng)濟性狀與基因型間連鎖分析的候選標記。

關(guān)于GH基因多態(tài)性與生長發(fā)育性狀的相關(guān)性報道較多，高雪等研究發(fā)現(xiàn)[5]，GH基因5′端，BB基因型對南陽牛6～18月齡的體長及體高呈顯著的正效應(yīng)。胡怡菲等[13]發(fā)現(xiàn)GH基因第5外顯子存在2處SNPs和3種基因型，且不同基因型個體在秦川牛體高、胸圍、體斜長和尻長上差異顯著(\%P\%<0.05)。谷朝勇報道[14]，魯西黃牛GH基因3′末端存在多態(tài)位點，且產(chǎn)生了3種基因型，AB基因型個體的體重、體高、體長、胸圍和肉用指數(shù)顯著高于AA型和BB型(\%P\%<0.05)。本研究再次證實了上述觀點，相關(guān)性分析結(jié)果表明，GH基因第2外顯子和第5外顯子均存在多態(tài)性，且不同基因型與不同生長階段體重、體尺及肉用指數(shù)具有相關(guān)性(\%P\%<0.05)，從早期選種的角度考慮，6月齡斷奶重和肉用指數(shù)，以BB型和CD型最高，在生產(chǎn)實踐中具有一定的參考價值。因此，在早勝牛肉用方向選育過程中，建議進一步加大人工選擇強度，結(jié)合體型外貌線性評分，堅決選留含有BB型和CD型的優(yōu)秀個體，淘汰其它基因型個體，通過導(dǎo)入外血、橫交固定、閉鎖繁育等手段，以穩(wěn)定遺傳其優(yōu)勢基因和優(yōu)良特性，提高群體同質(zhì)性和生產(chǎn)水平，加快培育具有甘肅地方特色的肉牛新品種，促進當?shù)厝馀．a(chǎn)業(yè)提質(zhì)增效。

[1] 徐建峰,容維中,茍想珍,等.早勝牛種質(zhì)資源現(xiàn)狀調(diào)查與分析[J].中國牛業(yè)科學(xué),2015,41(6):69-72.

[2] Malveiro E,Pereira M,Marques P X,et al.Polymorphisms at the five exons of the growth hormone gene in the Algarvia goat:possible association with milk traits[J].Small Ruminant Research,2001,41(2):163-170.

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[4] 王靖,劉穎,董文華,等.長白豬和大白豬生長激素基因多態(tài)性及其對部分經(jīng)濟性狀的影響[J].中國畜牧雜志,2014,50(11): 1-4.

[5] 高雪,徐秀容,任紅艷,等.不同基因型對南陽牛生長發(fā)育性狀的影響[J].遺傳, 2006,28(8):927-932.

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Association Analysis Between Polymorphism of GH Gene and Growth and Development Traits in Zaosheng cattle

ZHANG Yan-li1,RONG Wei-zhong2*,XU Jian-feng2,REN Mao-yuan3,GUO bin-bin3

(1.ExamingandInspectionCenterforAgriculturalProductsSafetyandQualityinPingLiangCity,PingLiang,Gansu, 744000;2.AnimalHusbandryandVeterinaryResearchInstituteinGansuProvince,PingLiang,Gansu, 744000;3.ManagementofficewithForagelivestockindustrydemonstrationzoneinHuachicounty,Huachi,Gansu, 745600 )

[Objective] In order to study the polymorphism of GH gene and its influence with growth and development traits of Zaosheng cattle. [Method] PCR-SSCP and DNA sequencing technologies were conducted to detect heredity polymorphism of GH gene in exon 2 and exon 5 with Zaosheng cattle, and analyzed the correlation of different genotypes with growth and development traits by Least squares linear model. [Result] There were two base mutations of exon 2 which lead to two alleles and three genotypes with achieving low polymorphism, and three base mutations of exon 5 which lead to two alleles and two genotypes with achieving intermediate plymorphism. Birth weight and body weight of six months old with BB genotype and AB genotype were significantly higher than that of AA genotype(\%P\%<0.05), and yearling weight with BB genotype was significantly higher than that of AA genotype and AB genotype(\%P\%<0.05)in exon 2, and Birth weight, body weight of six months old, yearling weight and Beef production index with CD genotype was significantly higher than that of CC genotype(\%P\%<0.05)in exon 5.[Conclusion] Polymorphism of GH gene within exon 5 was more abundant than that of exon 2, and it could be considered as maker to beef performance breeding with Zaosheng cattle.

Zaosheng cattle; GH gene; RCP-SSCP; growth and development traits; Breeding

2016-03-20

2016-03-25

甘肅省技術(shù)研究與開發(fā)專項計劃(項目編號：1207TCYL016)。

張艷麗(1983-)，女，漢，甘肅靜寧人，農(nóng)藝師，研究方向為生物技術(shù)。

*通訊作者：容維中(1965-)，男，漢，甘肅平?jīng)鋈?，副研究員，研究方向為動物營養(yǎng)及牛羊繁殖技術(shù)。

S823

A

1001-9111(2016)04-0013-05