熊業(yè)城，曹修凱，賀 花,2，宋林霏，黃 橙，黨李蘋，張晉媛，雷初朝，陳 宏，祁興磊，黃永震*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3.河南泌陽(yáng)縣畜牧局，河南 泌陽(yáng) 463700)

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科學(xué)試驗(yàn)

黃牛GBP4基因拷貝數(shù)變異檢測(cè)及其對(duì)5個(gè)生長(zhǎng)性狀的影響

熊業(yè)城1，曹修凱1，賀 花1,2，宋林霏1，黃 橙1，黨李蘋1，張晉媛1，雷初朝1，陳 宏1，祁興磊2,3，黃永震1*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3.河南泌陽(yáng)縣畜牧局，河南 泌陽(yáng) 463700)

[目的] 研究黃牛GBP4基因拷貝數(shù)變異檢測(cè)及其對(duì)5個(gè)生長(zhǎng)性狀的影響。[方法] 本實(shí)驗(yàn)以200頭秦川牛和100頭夏南牛為研究對(duì)象，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)GBP4基因拷貝數(shù)變異。[結(jié)果] 分析發(fā)現(xiàn)，GBP4基因拷貝數(shù)變異的分布在2個(gè)品種之間存在顯著差異(\%P\%<0.05)。秦川牛群體存在Gain和Normal兩種類型；夏南牛群體存在Gain，Normal和Loss三種類型；其中Gain為拷貝數(shù)增加型，Normal為拷貝數(shù)不變型，Loss為拷貝數(shù)減少型。該基因拷貝數(shù)變異類型與秦川牛和夏南牛5個(gè)生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析顯示，GBP4基因拷貝數(shù)變異與秦川牛體高顯著相關(guān)(Normal>Gain P=0.046)。[結(jié)論] 本研究結(jié)果表明,GBP4基因拷貝數(shù)變異可以作為秦川牛選育的候選分子標(biāo)記。

GBP4基因；拷貝數(shù)變異；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；效應(yīng)分析

黃牛品種資源在我國(guó)十分豐富，并且黃牛對(duì)于畜牧業(yè)有著重要的影響力，是世界黃牛遺傳資源的重要組成部分。有些品種(如秦川牛和夏南牛)具有適應(yīng)性強(qiáng)、肉用性能良好的特點(diǎn)，且品種間差異顯著，是研究基因組遺傳變異和品種間進(jìn)化關(guān)系的寶貴材料。

隨著對(duì)基因組研究的逐漸深入，基因組上的一種亞顯微水平的結(jié)構(gòu)變異——拷貝數(shù)變異(Copy number variations,CNVs)被廣泛報(bào)道[1-3]，現(xiàn)已從“基因組變異”發(fā)展為“表型變化”的另一研究熱點(diǎn)。由于CNV涉及到基因序列范圍較廣，甚至可能包含整個(gè)功能基因，因此，可以通過(guò)基因劑量效應(yīng)的改變影響該基因控制的表型。在近期的《Genome Research》和 《BMC Genomics》雜志上，利用全基因組測(cè)序技術(shù)，檢測(cè)到了包括GBP4基因在內(nèi)的多個(gè)與牛生長(zhǎng)、肉質(zhì)相關(guān)的QTLs位于CNVs區(qū)域內(nèi)，表明影響個(gè)體表型差異的CNVs廣泛存在于基因組中[4]。

鳥苷酸結(jié)合蛋白4(GBP4)可以通過(guò)促進(jìn)Caspase-II的轉(zhuǎn)錄，來(lái)推動(dòng)Caspase-II介導(dǎo)的天然免疫[5]。本課題組前期研究結(jié)果表明，GBP4基因位于牛3號(hào)染色體的57554999到58293641的CNVs區(qū)域內(nèi)(Btau 4.0)。已有的研究表明，該區(qū)域是牛的生長(zhǎng)發(fā)育、肉質(zhì)、胴體和泌乳和健康等性狀的重要數(shù)量性狀基因座(Quantitative trait loci,QTLs)[6]。

目前關(guān)于中國(guó)黃牛GBP4基因序列變異方面的分析尚未見報(bào)道。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，從DNA水平檢測(cè)GBP4基因CNV在不同牛品種(秦川牛和夏南牛)中及同一品種內(nèi)的分布差異基因組變異，確定群體中存在的不同CNV類型(如缺失、單拷貝、多拷貝)，并將其與黃牛的重要生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。最終，期望找到?jīng)Q定牛生長(zhǎng)發(fā)育的特異位點(diǎn)或者M(jìn)arker基因，為我國(guó)黃牛的遺傳改良和分子育種提供可靠的遺傳學(xué)基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源與數(shù)據(jù)收集

本研究所用300份黃牛血樣包括：200份秦川?；A(chǔ)母牛(陜西省秦川牛良種繁育中心，陜西扶風(fēng))和100份夏南?；A(chǔ)母牛(夏南?？萍奸_發(fā)有限公司，河南泌陽(yáng))，測(cè)定的主要性狀包括：體重、體高、體長(zhǎng)、胸圍和坐骨端寬；測(cè)定時(shí)間為24月齡。

DNA樣品采集時(shí)采用的是ACD抗凝，冰盒迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存?zhèn)溆?。用苯?氯仿抽提法[7]提取基因組DNA，分光光度計(jì)測(cè)定濃度后，用滅菌蒸餾水稀釋至標(biāo)準(zhǔn)濃度25 ng·μL-1，4℃保存待用。

1.2 引物的設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank上公布的黃牛GBP4基因的DNA序列(登錄號(hào)：NC_007301.6)，再結(jié)合利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer5.0設(shè)計(jì)引物(F:5'-TGGGAATAACAACTGACACTG-3'；R:5'-ATTGGGCTGAATCCTCTACTT-3')；內(nèi)參基因選擇RPP30,引物序列(F：TGCTTCCATTGTTTCCTGATGA；R：TGGGACCAGGTTCCATGATC)。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

Realtime-PCR反應(yīng)體系：2×TaqTMII 5μL，F(xiàn)p 0.5 μL，Rp 0.5μL，DNA 1μL，加ddH2O至12.5μL。

總之，黨的十九大首提的鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略下的“建立健全城鄉(xiāng)融合發(fā)展體制機(jī)制和政策體系”，就是要通過(guò)改革、轉(zhuǎn)型、創(chuàng)新去推動(dòng)城鄉(xiāng)地位平等、要素互動(dòng)、共生共融。建構(gòu)鄉(xiāng)村振興的“融”機(jī)制與敢為人先的小崗精神高度契合，鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略“融”機(jī)制的建構(gòu)既明確了鄉(xiāng)村在中國(guó)特色社會(huì)主義現(xiàn)代化建設(shè)中的突出地位和在城鄉(xiāng)關(guān)系中的平等地位，又為實(shí)現(xiàn)2018年中央一號(hào)文件提出的“讓農(nóng)業(yè)成為有奔頭的產(chǎn)業(yè)，讓農(nóng)民成為有吸引力的職業(yè)，讓農(nóng)村成為安居樂(lè)業(yè)的美麗家園”的美好愿景奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

Realtime-PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸16 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。

1.3 建立DNA池和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

在所有DNA樣品中隨機(jī)地提取的選出1/3的樣品，各取5 μL，將所有提取的樣品放入一根離心管中，充分混勻，調(diào)整終濃度為50～60 ng·μL-1，以建立黃牛?；旌螪NA池。

將DNA池中的所提取濃度適宜的樣品為模板進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：隨機(jī)抽取10 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性酶EaeI消化處理，選用2%(w/v)的瓊脂糖凝膠，電泳50～60 min，采用EB染色，分析。[8]

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

記錄通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)所得黃牛GBP4基因拷貝數(shù)與引物拷貝數(shù)的值，并歸納統(tǒng)計(jì)出GBP4基因CNV在秦川牛和夏南牛中的分布情況。采用SPSS軟件(Version 16.0)對(duì)GBP4基因CNV類型與黃牛生長(zhǎng)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果

2.1 牛GBP4基因CNV在不同牛品種中的分布差異

受自然選擇和人工選擇的影響，同一物種的不同品種間基因組遺傳變異存在差異。為了檢測(cè)GBP4基因CNV在中國(guó)不同黃牛品種內(nèi)的分布情況，我們分別選取了夏南牛和秦川牛進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖1。從圖中可以看出，在秦川和夏南牛中，GBP4相對(duì)拷貝數(shù)分布較離散，都表現(xiàn)出拷貝數(shù)增加、正常和減少三種類型。夏南牛相對(duì)于秦川牛表現(xiàn)為拷貝數(shù)減少；同時(shí)，在夏南牛中，GBP4拷貝數(shù)相對(duì)于秦川牛分布較離散。

圖1 GBP4基因在兩個(gè)牛群中的拷貝數(shù)分布圖

2.2 牛GBP4基因拷貝數(shù)變化對(duì)于牛的重要生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

根據(jù)拷貝數(shù)目的差異，將CNV分為三種類型，分別是拷貝數(shù)增加(Log22-ΔΔCt> 0.5 Gain)、拷貝數(shù)減少(Log2 2-ΔΔCt< -0.5 Loss)和拷貝數(shù)不變(-0.50.05)(表2)。

3 討論

3.1 牛GBP4基因CNV在不同牛品種中的分布差異

從圖1中可以看出，GBP4基因CNV分布在2個(gè)品種中的差異較大，其中，在夏南牛中，該基因拷貝數(shù)變異分布比較離散，說(shuō)明在夏南牛群體內(nèi)不同個(gè)體間GBP4基因CNV也存在差異?？傮w來(lái)看，夏南牛與秦川牛之間存在顯著差異(\%P\%<0.05)。

表1 牛GBP4基因CNV與秦川牛生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

表2 牛GBP4基因CNV與夏南牛生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

3.2 牛GBP4基因拷貝數(shù)變化對(duì)于牛的重要生長(zhǎng)性狀的關(guān)系

牛的健康、生長(zhǎng)發(fā)育、泌乳、胴體和肉質(zhì)等性狀均由多基因座位控制。而通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定影響生長(zhǎng)性狀的主基因?qū)ξ覈?guó)地方黃牛品種培育為肉用方向有重要意義。已有研究表明，在動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育和泌乳過(guò)程中GBP4基因發(fā)揮著重要的作用。因此，我們能夠?qū)⑵渥鳛楹蜻x基因之一與數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)來(lái)進(jìn)行連鎖分析，并作出數(shù)量性狀的輔助標(biāo)記選擇。

[1] Khaja R,Zhang JJ,MacDonald JR,\%et al.\%Genome assembly comparison identifies structural variants in the human genome.Nature Genetics,2006,38(12):1413-1418.

[2] Redon R,Ishikawa S,Fitch KR,\%et al.\% Global variation in copy number in the human genome.Nature,2006,444(7118):444-454.

[3] Conrad DF,Bird C,Blackburne B, \%et al.\% Mutation spectrum revealed by breakpoint sequencing of human germline CNVs.Nature Genetics,2010,42(5):385-391.

[4] Bickhart DM,Hou Y,Schroeder SG,\%et al.\% Copy number variation of individual cattle genomes using next-generation sequencing[J].Genome Res.2012;22(4):778-790.

[5] Shi J,Zhao Y,Wang Y,\%et al.\% .Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS[J]. Nature.2014,514(7521):187-192.

[6] Zhang L,Jia S,Yang M,\%et al.\%.Detection of copy number variations and their effects in Chinese bulls.BMC Genomics.2014(17):15:480.

[7] [美]薩姆布魯克，D w拉塞爾．分子克隆實(shí)指南[M]．北京：科學(xué)出版社，2002.468-469．

[8] 婁佑武，吳志勇，王榮民等.吉安西雜母牛DGAT1基因K232A遺傳多態(tài)性及其對(duì)乳成分影響的分析[J].中國(guó)牛業(yè)科學(xué)，2015，41(3)：18-21.

The Detection of GBP4 Gene Copy Number Variation and Its Effect on Five Bovine Growth Traits

XIONG Ye-cheng1,CAO Xiu-kai1,HE Hua1，2,SONG Lin-fei1,HUANG Cheng1,DANG Li-ping1,ZHANG Jin-yuan1,LEI Chu-zhao1,CHEN Hong1,Qi Xing-lei3，HUANG Yong-zhen1*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,ShaanxiKeyLaboratoryofMolecularBiologyforAgriculture,Yangling,Shaanxi, 712100,China;2.CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi, 712100,China；3.BureauofAnimalHusbandryofBiyangCounty,Biyang,Henan, 463700,China)

【Objective】 This study investigated the detection of GBP4 gene copy number variation and its effect on five growth traits for cattle. 【Method】 A total of 300 individuals, including 200 Qinchuan cattle individuals and 100 Xianan cattle individuals, were selected as the experimental animals to detect the copy number variation of GBP4 gene by real-time fluorescent quantitative PCR ( RT-qPCR ).【Results】The result showed there were significant differences in the distribution of the copy number variation of GBP4 gene between the two varieties (\%P\%< 0.05 ). Qinchuan cattle group included two types: Gain and Normal, Xianan cattle group included three types: Gain, Normal and Loss. Gain is a copy number increased type; Normal is a copy number constant type; Loss is a copy number decreased type. According to the associated analysis between the copy number variation types and five growth character of Qinchuan cattle and Xianan cattle, it was found that the copy number variation had a significant relationship with body height of Qinchuan cattle (Normal > Gain P = 0.046). 【Conclusion】 These findings indicated that the copy number variation of GBP4 gene can be used as candidate molecular markers for Qinchuan cattle breeding.

GBP4 gene; copy number variation; real-time quantification PCR; effect analysis

2016-05-11

2016-05-13

本項(xiàng)目由國(guó)家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)(CARS-38)資助，中國(guó)博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2015M570857,2015M570856)，陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃項(xiàng)目(2015KTCL02-08，2014KTZB02-02-02-02)，國(guó)家發(fā)改委生物育種能力建設(shè)與產(chǎn)業(yè)化專項(xiàng)(2014-2573)， 西北農(nóng)林科技大學(xué)2015年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目資助完成。

熊業(yè)城(1996-)，男，江西省九江人，本科生，主要從事動(dòng)物遺傳與育種研究。

*通訊作者：黃永震(1982-)，男，河南南陽(yáng)人，博士，主要從事牛分子遺傳與育種研究。

S823

A

1001-9111(2016)04-0009-04