周瑋婧，江小明

（武漢食品化妝品檢驗(yàn)所，湖北武漢430000）

頂空氣相色譜法測定葡萄酒中甲醇及市售葡萄酒質(zhì)量調(diào)查

周瑋婧，江小明

（武漢食品化妝品檢驗(yàn)所，湖北武漢430000）

建立了一種頂空-毛細(xì)管氣相色譜快速測定葡萄酒中甲醇的方法。在75℃下振蕩20m in后頂空進(jìn)樣，采用DB-wax毛細(xì)管柱(0.32μm，0.25mm，30m)和氫火焰檢測器測定，內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果表明，在16.4～821.0mg/L范圍內(nèi)，甲醇的峰面積與其含量呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999，平均回收率在99.85%～100.57%之間，樣品重現(xiàn)性RSD在0.98%～2.44%之間，檢出限為1.64mg/L。該方法與國標(biāo)GB/T 15038—2006方法相比更簡便、高效，測定結(jié)果用配對t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，在95%置信水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對100批次武漢市售葡萄酒進(jìn)行甲醇含量的調(diào)查分析，所有樣品均檢測出甲醇成分，其平均含量為157mg/L，所有樣品中甲醇含量均符合國家標(biāo)準(zhǔn)。

頂空進(jìn)樣； 氣相色譜； 葡萄酒； 甲醇

葡萄酒中甲醇主要來源于原料中果膠物質(zhì)發(fā)生水解，氨基酸脫氨和發(fā)酵原料的霉變，或是生產(chǎn)過程中浸漬發(fā)酵時(shí)間過長而產(chǎn)生的，一些企業(yè)為了獲得較高澄清度的葡萄酒和較高的出酒率，在發(fā)酵過程中添加果膠酶也會(huì)造成甲醇的大量產(chǎn)生[1]。葡萄酒中甲醇含量過高對人體中樞神經(jīng)有抑制作用，尤其對視網(wǎng)膜神經(jīng)系統(tǒng)的危害性更大，甲醇中毒的癥狀是出現(xiàn)眼球疼痛、瞳孔放大、視網(wǎng)膜水腫等，重者因?yàn)橐暽窠?jīng)萎縮而導(dǎo)致失明。因此甲醇含量是發(fā)酵酒生產(chǎn)過程中需嚴(yán)格控制的重要指標(biāo)[2-3]。

國標(biāo)GB/T 15038—2006[4]中利用氣相色譜法測定甲醇含量時(shí)，需先將樣品通過蒸餾法進(jìn)行預(yù)處理，去除樣品中不揮發(fā)性物質(zhì)以保護(hù)色譜柱，但該方法的檢測過程相對繁瑣，耗時(shí)較長，且蒸餾過程中由于甲醇容易揮發(fā)，會(huì)導(dǎo)致分析結(jié)果重現(xiàn)性差。針對葡萄酒中甲醇含量較低以及國標(biāo)方法的不足，本實(shí)驗(yàn)采用頂空氣相色譜法，內(nèi)標(biāo)法定量分析葡萄酒中甲醇含量。同時(shí)對武漢市出售葡萄酒進(jìn)行抽樣檢測，通過調(diào)查了解目前市場銷售葡萄酒的甲醇含量情況，為相關(guān)部門對葡萄酒的生產(chǎn)、儲(chǔ)存、銷售、運(yùn)輸進(jìn)行有效管理提供科學(xué)的依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料、試劑及儀器

無水乙醇，色譜純，99.8%，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；甲醇，99.0%，Dr.Ehrenstorfer；4-甲基-2戊醇，99.5%，Dr.Ehrenstorfer；葡萄酒樣品均為市場上銷售的不同品種。

儀器設(shè)備：Agilent7890B氣相色譜儀，配備毛細(xì)管柱分流/不分流進(jìn)樣系統(tǒng)，F(xiàn)ID檢測器；Agilent 7697A頂空進(jìn)樣器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，電子分析天平。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1色譜條件

色譜柱：DB-wax毛細(xì)管色譜柱（0.32μm，0.25mm，30m），載氣：氮?dú)?99.999%)，流速：2.0m L/m in，進(jìn)樣口溫度：260℃，分流比：1∶20；檢測器溫度（FID）：250℃，氫氣流速：45m L/m in，空氣流速：450m L/m in；進(jìn)樣體積：1m L。柱溫箱程序升溫：初始溫度40℃，保持5m in，升溫速率25℃/min，升到100℃，保持2m in，再以30℃/m in升至210℃，保持5m in。

1.2.2頂空條件

載氣氮?dú)?，頂空瓶口充氣?25 kPa，頂空瓶口加熱溫度75℃，定量管溫度95℃，傳輸氣路溫度100℃，平衡時(shí)間20m in；頂空瓶口充氣增壓時(shí)間0.13m in，頂空瓶口向定量管充氣時(shí)間0.15 m in，定量管平衡時(shí)間0.15m in，六通進(jìn)樣閥進(jìn)樣時(shí)間1m in。

1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.3.1內(nèi)標(biāo)溶液的制備

量取4-甲基-2戊醇標(biāo)準(zhǔn)品2.0m L，加10%乙醇溶液定容至100m L容量瓶中，濃度為158.2mg/L。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

量取甲醇標(biāo)準(zhǔn)品2.0m L，加10%乙醇溶液定容至100m L容量瓶中，濃度為16.4g/L。

1.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液在20℃室溫中平衡1 h，用微量注射器分別注入10μL、25μL、50μL、100μL、200μL、500μL甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液至10m L容量瓶中，準(zhǔn)確記錄稱取質(zhì)量，再分別加入內(nèi)標(biāo)液100μL，用10%乙醇溶液定容至刻度，得到濃度分別為16.4mg/L、41.0mg/L、82.1mg/L、164.2mg/L、328.4mg/L、821.0mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，壓蓋，密封，待頂空進(jìn)樣。

1.4供試溶液的制備

樣品搖勻后，吸取4-甲基-2-戊醇內(nèi)標(biāo)液100μL于10m L容量瓶，用酒樣定容至刻度，為待測試樣。吸取5m L試樣至頂空瓶，待頂空進(jìn)樣。

2　結(jié)果與分析

2.1頂空法測定葡萄酒中甲醇方法驗(yàn)證

2.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍的測定

按1.2方法中色譜條件測定，以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，甲醇濃度(C)為橫坐標(biāo)，計(jì)算甲醇的回歸方程為：A= 0.15046088C+0.0030056，相關(guān)系數(shù)r=0.999，本法線性濃度在16.4～821.0mg/L之間，線性范圍寬，線性關(guān)系好。

2.1.2檢測限的測定

配制一個(gè)低濃度的甲醇溶液并逐級(jí)稀釋測定，當(dāng)甲醇色譜峰信噪比為3.2時(shí)，檢出限為1.64mg/L，優(yōu)于國標(biāo)GB/T 15038—2006氣相色譜法最低檢出限4.0mg/L，因此所建立的頂空氣相色譜法檢出限可以滿足檢測要求。

2.1.3精密度與準(zhǔn)確度的測定

選定1份葡萄酒樣品測得甲醇含量為149mg/L（市售成品葡萄酒中均含有一定量甲醇，無法獲得無甲醇樣品）作為本底，分別加入10μL、50μL、200μL 3種不同濃度的甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入內(nèi)標(biāo)溶液后用酒樣定容至10.0m L，每組含量做6次平行試驗(yàn)，按1.4處理方法處理，進(jìn)樣檢測，測定結(jié)果見表1，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線、樣品本底及加標(biāo)量，計(jì)算平均回收率在99.85%～100.57%之間，樣品回收率良好。RSD在0.98%～2.44%之間，符合JJG 700—1999《氣相色譜儀檢定規(guī)程》[5]規(guī)定值≤3.00%的要求，該方法重復(fù)性良好。

表1　加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2頂空氣相色譜法與國標(biāo)方法測定結(jié)果的比較

2.2.1色譜圖比較

圖1(A)是頂空氣相色譜法測定葡萄酒中甲醇的色譜圖，圖1(B)則是按照國標(biāo)蒸餾法的氣相色譜圖，2種方法的甲醇色譜峰理論塔板數(shù)分別為52750和8662；甲醇-乙酸乙酯峰間的分離度分別為2.92和1.76，結(jié)果顯示，頂空氣相色譜法分離效果更好，且在頂空氣相色譜法分析時(shí)，目標(biāo)物質(zhì)附近沒有雜峰干擾，且甲醇峰型尖銳，對稱因子為0.95；而在液體進(jìn)樣情況下甲醇峰型有拖尾，對稱因子為0.43；由此可知使用頂空氣相色譜法分析葡萄酒中甲醇含量效果更為理想。

圖1　葡萄酒中甲醇測定的氣相分析色譜圖

2.2.2檢測結(jié)果比較

選7個(gè)不同市售葡萄酒樣品，分別使用頂空法和國標(biāo)使用的蒸餾法測定其甲醇含量，結(jié)果見表2。2種方法檢測結(jié)果的相對偏差范圍為1.84%～4.59%，經(jīng)2個(gè)配對樣品t檢驗(yàn)（T-Ttest）的統(tǒng)計(jì)分析，按α=0.05水平，P＞0.05，即在95%置信水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明2種方法檢測結(jié)果無差異。但是頂空氣相色譜儀法測定的平均值略高于國標(biāo)蒸餾測定法，這是由于葡萄酒在蒸餾時(shí)甲醇會(huì)有一定的損失，因而影響了測定結(jié)果[6]。

表2　葡萄酒中甲醇含量測定方法的結(jié)果比較

2.3市售紅酒甲醇含量調(diào)查

本實(shí)驗(yàn)于2015年6—10月在武漢地區(qū)對有正規(guī)品牌（指含有注冊商標(biāo)、批號(hào)、廠家廠址、生產(chǎn)日期、保質(zhì)期、質(zhì)量標(biāo)簽）的葡萄酒樣品進(jìn)行隨機(jī)采樣，采樣地點(diǎn)包括超市、煙酒專賣店和零售商店，樣品以顧客購買形式進(jìn)行采樣，以樣品不重復(fù)且盡可能覆蓋所售全部品種規(guī)格為原則，且樣品均在標(biāo)示的保質(zhì)期內(nèi),共計(jì)100批次，采用頂空氣相色譜法分別進(jìn)行甲醇含量的測定，結(jié)果見表3。

目前我國葡萄酒行業(yè)的市場集中度較高，有報(bào)道稱，張?jiān)Ｆ咸丫乒?、中法合營王朝葡萄釀酒有限公司和長城葡萄釀酒有限公司占領(lǐng)了全國近50%的葡萄酒市場，本實(shí)驗(yàn)對23家不同企業(yè)、共100種不同批號(hào)的葡萄酒中甲醇含量進(jìn)行了測定，結(jié)果表明，目前武漢葡萄酒市場上主要以張?jiān)！⑼醭?、長城這幾個(gè)品牌為主，甲醇測定結(jié)果最高值是257mg/L，最低值是5mg/L，平均值為156.87mg/L，所有樣品甲醇含量均低于國標(biāo)設(shè)定的限量標(biāo)準(zhǔn)（國標(biāo)GB 15037—2006要求白、桃紅葡萄酒甲醇限值小于等于250mg/L，紅葡萄酒甲醇限值小于等于400mg/L），符合國家標(biāo)準(zhǔn)，可以安全飲用。但所有樣品均能檢測出甲醇，這是因?yàn)榧状际瞧咸丫漆勗熘胁豢杀苊獾母碑a(chǎn)物[7]。

3　結(jié)論

本方法在現(xiàn)有國標(biāo)的基礎(chǔ)上做出了改進(jìn)，采用DB-wax毛細(xì)管色譜柱，氣相色譜-火焰離子化檢測器進(jìn)行分析，靜態(tài)頂空設(shè)備進(jìn)樣，對樣品處理過程中的平衡溫度和平衡時(shí)間優(yōu)化后進(jìn)行方法學(xué)分析，建立了頂空-氣相色譜法測定葡萄酒中甲醇含量的測定方法，該法具有樣品前處理時(shí)間短、回收率和精密度高、檢出限低以及色譜峰形好等優(yōu)點(diǎn)，而且檢測結(jié)果與國標(biāo)方法一致。可以用來快速檢測大批量葡萄酒中甲醇含量。對市售葡萄酒中甲醇的含量進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)目前武漢各大流通領(lǐng)域的葡萄酒中甲醇含量均符合《中華人民共和國葡萄酒標(biāo)準(zhǔn)》中甲醇的檢測限量標(biāo)準(zhǔn)。但由于我國的酒文化及飲酒習(xí)慣與國外存在明顯差異，過量飲酒的情況普遍存在，因此仍有必要對甲醇含量進(jìn)行控制[8]。

表3　市售葡萄酒中甲醇含量測定結(jié)果

[1]曾游,丁怡.頂空-毛細(xì)管氣相色譜法測定葡萄酒中的甲醇[J].現(xiàn)代食品科技,2013(29)：405-408.

[2]葉建晨,楊佳佩.頂空毛細(xì)管氣相色譜法測定葡萄酒中甲醇?xì)埩袅縖J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2011(6)：1359-1360.

[3]劉國平,黃誠,薛榮旋.頂空氣相色譜內(nèi)標(biāo)法快速測定葡萄酒中甲醇[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué),2015(4)：497-498.

[4]中國輕工業(yè)聯(lián)合會(huì).葡萄酒、果酒通用分析方法：GB/T 15038—2006[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2008.

[5] 全國物理化學(xué)技術(shù)委員會(huì).氣相色譜儀：JJG 700—1999[S].北京：中國計(jì)量出版社,2004.

[6]李旭升,潘振東,吳碧玉.四川家庭自釀葡萄酒質(zhì)量現(xiàn)狀的初步調(diào)查[J].中國釀造,2015(8)：115-117.

[7] 中國輕工業(yè)聯(lián)合會(huì).葡萄酒：GB 15037—2006[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2008.

[8]李艷,文良娟.果膠酶對葡萄酒釀制過程中甲醇含量的影響[J].食品工業(yè),2012(9)：17-20.

Determ ination ofM ethanolContent in W ine by HeadspaceGasChromatography and Survey on theQuality of Commercially AvailableW ine

ZHOUWeijing and JIANG Xiaom ing
（Wuhan Food and Cosmetic Testing Institute,Wuhan,Hubei430000,China）

An analyticalmethod for fast determ ination ofmethanol content in w ine by headspacegas chromatography had been developed. Headspace sampling was performed after 20m in shaking at75℃,then themeasurementwas carried out by FID detector after separation by DB-wax chromatographic column(0.32μm,0.25mm,30m)w ith internalstandardmethod.The resultssuggested that,the linear rangewasbetween 16.4mg/L and 821.0mg/L,the linear correlation coefficientwas 0.999,the average recovery ratewas between 99.85%and 100.57%, RSD was between 0.98%and 2.44%,and the detection lim itwas 1.64mg/L.Compared w ith themethod ingB/T 15038—2006,thismethod wasmore simple and efficient.The determination resultswere analyzed statistically by coupled t and there was no significant difference between the twomethods at the 95%confidence level.Finally,themethanol content of 100 batches of commercially available w ine in Wuhan were detected and analyzed,andmethanolwas detected in allw ine productsand the averagemethanol contentwas157mg/L,whichmetnationalstandards.

headspace sampling;gas chromatography;w ine;methanol

TS262.6；TS261.7；TS261.4

A

1001-9286(2016)11-0116-04

10.13746/j.njkj.2016166

2016-05-17

周瑋婧(1985-)，女，工程師，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩?/p>

江小明(1970-)，女,本科，高級(jí)工程師,主要從事食品分析方面的研究工作，E-mail：944703609@qq.cm。

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