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(1.南華大學附屬第二醫(yī)院心血管內科 湖南衡陽 421001；2.解放軍第一六九醫(yī)院普外科；3.南華大學附屬第二醫(yī)院泌尿外科；4.衡陽市中心醫(yī)院急診科)

·基礎醫(yī)學·

Apelin-13通過AMPK通路抑制同型半胱氨酸誘導的內皮細胞損傷

王波1,周潔2,張濤3,李國術4,曾高峰1*

(1.南華大學附屬第二醫(yī)院心血管內科 湖南衡陽 421001；2.解放軍第一六九醫(yī)院普外科；3.南華大學附屬第二醫(yī)院泌尿外科；4.衡陽市中心醫(yī)院急診科)

目的觀察Apelin-13對同型半胱氨酸(Hcy)誘導的血管內皮細胞損傷的保護作用并探討其可能的作用機制。方法采用10 mmol/L Hcy處理人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)24 h，誘導內皮細胞的損傷。采用不同濃度(0.1 μmol/L、1.0 μmol/L和10.0 μmol/L)的Apelin-13預處理1 h，再加入含Hcy的培養(yǎng)基中繼續(xù)孵育24 h，觀察細胞的損傷情況。采用MTT法測定細胞活力，比色法測定細胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)的活性。采用Western Blot檢測HUVECs中磷酸化的腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)蛋白表達。結果與對照組比較，Hcy組細胞的存活率顯著降低，細胞培養(yǎng)液中LDH活力顯著性升高(均P<0.05)。與Hcy組組比較，Apelin-13(1.0和10.0 μmol/L)預處理組細胞的存活率均顯著升高，細胞培養(yǎng)液中LDH活力顯著性降低(均P<0.05)。Hcy組HUVECs細胞中p-AMPK蛋白的表達與對照組比較沒有顯著性差異(均P>0.05)。與Hcy組比較，Apelin-13(1.0和10.0 μmol/L)預處理組HUVECs細胞中p-AMPK蛋白的表達顯著性下調(均P<0.05)。AMPK抑制劑Compound C部分取消了Apelin-13的內皮細胞保護作用。結論Apelin-13抑制了同型半胱氨酸誘導的內皮細胞損傷，其機制與可能與上調AMPK的磷酸化有關。

Apelin-13； 腺苷酸活化蛋白激酶； 同型半胱氨酸； 內皮細胞

心腦血管疾病是導致人類死亡的三大疾病之一，目前在我國心血管疾病患者高達 2.3億，嚴重威脅著人們的身心健康。動脈粥樣硬化(arteriosclerosis,AS)是心腦血管疾病重要的病理生理學基礎，近年來的研究顯示高同型半胱氨酸血癥(homocysteine,Hcy)是AS獨立的危險因素[1]。血管內皮細胞的損傷是AS重要的始動環(huán)節(jié)，Hcy可導致血管內皮細胞的損傷，從而導致AS的發(fā)生[2]。因此保護血管內皮細胞是防治心腦血管疾病的重要途徑。 Apelin是1998年由Tatemoto等從牛胃的分泌物中分離提取出的G蛋白耦聯(lián)受體血管緊張素受體ATl相關的受體蛋白(putative receptor protein related to the angiotensin receptor ATl,APJ)的內源性配體[3]。Apelin/APJ在心血管系統(tǒng)有大量的分布，Apelin具有擴張血管、降低系統(tǒng)血壓、促進血管內皮細胞有絲分裂、對內皮細胞功能的維護發(fā)揮重要的作用[4]。但是Apelin對Hcy誘導的內皮細胞損傷是否具有保護作用以及作用機制尚不清楚。因此本研究擬觀察Apelin對Hcy所致的內皮細胞損傷的抑制作用，并從AMPK通路的角度探討其內皮保護作用的可能機制，為以AS為基礎的心腦血管疾病的防治提供理論依據(jù)和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1材料杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco modified Eagle medium,DMEM)和胎牛血清為Introgen公司產品；青霉素、鏈霉素和噻唑藍(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT) 為Sigma公司產品。Apelin-13多肽為美國Phoenix Biotech公司產品。AMPK抑制劑Compound C為美國Sigma公式產品。乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)為南京建成生物工程公司產品。兔抗人腺苷酸活化蛋白激酶(Amp activated protein kinase,AMPK)和β-actin的單克隆抗體以及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗均為美國Santa Cruz公司產品。CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Krownus公司)、多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司)。垂直電泳儀與轉膜系統(tǒng)(美國BioRad公司)和凝膠成像分析系統(tǒng)(美國UVP公司)和圖像分析系統(tǒng)(武漢華海公司)。

1.2細胞培養(yǎng)和分組人臍靜脈內皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)株由中南大學湘雅醫(yī)學院細胞中心提供。HUVECs解凍復蘇后，用含10%滅活胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，細胞置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育，隔天傳代，處于對數(shù)生長期的融合生長至80%左右的細胞用于實驗。實驗共分為以下各組：對照組(細胞在普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h)、Hcy組(細胞在含10 mmol/L Hcy 的培養(yǎng)基中孵育24 h[5])、Apelin-13預處理組(先分別加入0.1 μmol/L、1.0 μmol/L和10.0 μmol/L的Apelin-13預處理1 h[6]，再加入含Hcy 的培養(yǎng)基中繼續(xù)孵育24 h)及AMPK抑制劑Compound C組(先加入15 μmol/L Compound C預處理細胞0.5h，再加入10.0 μmol/L Apelin-13處理細胞1 h，再加入含Hcy 的培養(yǎng)基中繼續(xù)孵育24 h)。

1.3 MTT法檢測細胞活力用胰酶消化后將 HUVECs細胞制成細胞懸液，計數(shù)細胞的密度，以1×104個細胞/孔接種到96孔培養(yǎng)板內。實驗結束后每孔加入100 μL MTT，確保MTT的終濃度為0.5 mg /mL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)液。每孔加入100 μL DMSO，振蕩10 min，使結晶完全溶解。在酶標儀上測定570 nm波長的吸光度值(OD值)，每組設重復孔3個。計算各組細胞的存活率，以對照組為參照(細胞存活率為100%)，計算其它各組細胞存活率=[處理組OD值/對照組OD值]×100%。

1.4 LDH活力的檢測乳酸脫氫酶(LDH)可將乳酸催化生成為丙酮酸，而產生的丙酮酸可與2，4-硝基苯肼反應生成丙酮酸二硝基苯腙，丙酮酸二硝基苯腙在堿性環(huán)境中呈現(xiàn)出棕紅色，丙酮酸二硝基苯腙的水平與LDH的活力呈正相關，因此通過比色法可測量出LDH的活力。各組實驗結束后，分別收集每組細胞培養(yǎng)液的上清液，測量各組細胞上清液中LDH活性，操作按LDH試劑盒說明書的要求進行。用酶標儀測定波長為450 nm的吸光度，每組設3個重復孔。

1.5 Western Blot分析按試劑盒說明進行操作提取各組HUVECs細胞的總蛋白，BAC法測定蛋白濃度。取100 μL蛋白樣本加入到2×SDS凝膠加樣緩沖液中煮沸充分變性蛋白。進行SDS-PAGE 電泳1 h分離蛋白，分離的蛋白通過半干法轉膜至聚偏氟乙稀膜上。10%脫脂牛奶封閉2 h，加入兔抗人磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(Phosphorylation amp activated protein kinase,p-AMPK)(1∶200)和總的腺苷酸活化蛋白激酶(total amp activated protein kinase,t-AMPK)(1∶400)的一抗，4 ℃下過夜。加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶300)，室溫孵育6 h。洗膜后，蛋白印跡熒光檢測試劑盒顯示于X線片，經顯影、定影后，Labworks圖像分析系統(tǒng)對結果進行灰度掃描，采用目的基因與內參灰度值的比值進行半定量分析。

1.6統(tǒng)計學分析計量資料以用表示，多組間差異分析比較采用單因素方差分析；組間差異的兩兩比較采用LSD-t檢驗。采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件處理實驗數(shù)據(jù)，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 Hcy和Apelin-13對HUVECs細胞存活率的影響采用MTT法檢測HUVECs細胞活力，結果如圖1所示：與對照組比較，Hcy組細胞的存活率顯著降低(P<0.05)；與Hcy組組比較，Apelin-13(1.0和10.0 μmol/L)預處理組細胞的存活率均顯著升高(均P<0.05)；而Apelin-13(0.1 μmol/L)預處理組與Hcy組比較細胞的存活率沒有顯著性差異(P>0.05)。

圖1 Hcy和Apelin-13對HUVECs細胞存活率的影響 與對照組比較，a:P<0.05；與Hcy組比較，b:P<0.05

2.2 Hcy和Apelin-13對HUVECs細胞培養(yǎng)液中LDH活力的影響結果如圖2所示：與對照組比較，Hcy組細胞培養(yǎng)液中LDH活力顯著性升高(P<0.05)。與Hcy組比較，Apelin-13(1.0和10.0 μmol/L)預處理組細胞培養(yǎng)液中LDH活力顯著性降低(均P<0.05)。而Apelin-13(0.1 μmol/L)預處理組與Hcy組比較細胞培養(yǎng)液中LDH活力沒有顯著性差異(P>0.05)。

圖2 Hcy和Apelin-13對HUVECs細胞培養(yǎng)液中LDH活力的影響 與對照組比較，a:P<0.05；與Hcy組比較，b:P<0.05

2.3 Hcy和Apelin-13對HUVECs細胞中AMPK磷酸化程度的影響結果如圖3所示：對照組、Hcy組和Apelin-13(0.1、1.0和10.0 μmol/L)預處理組HUVECs細胞中t-AMPK蛋白的表達在各組間沒有顯著性差異(均P>0.05)。Hcy組HUVECs細胞中p-AMPK蛋白的表達與對照組比較沒有顯著性差異(均P>0.05)。與Hcy組比較，Apelin-13(1.0和10.0 μmol/L)預處理組HUVECs細胞中p-AMPK蛋白的表達顯著性上調(均P<0.05)，而Apelin-13(0.1 μmol/L)預處理組HUVECs細胞中p-AMPK蛋白的表達與Hcy組比較沒有顯著性差異(均P>0.05)。

2.4 AMPK抑制劑Compound C對Apelin-13作用的影響結果如圖4所示：與Apelin-13(10.0 μmol/L)預處理組比較，AMPK抑制劑Compound C組細胞的存活率顯著降低(P<0.05)，而細胞培養(yǎng)液中LDH活力顯著性增加(P<0.05)，這些表明AMPK抑制劑Compound C部分取消了Apelin-13抑制Hcy誘導的HUVECs存活率的降低和細胞培養(yǎng)液中LDH活力水平增加的作用。

3 討 論

血管內皮細胞構成了血液的屏障，具有調節(jié)血管張力，調節(jié)凝血和纖溶的平衡，參與炎癥和免疫反應的調節(jié)等，在維持血管穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要的作用。

圖4 AMPK抑制劑Compound c對Apelin-13作用的影響與對照組比較，a:P<0.05；與Hcy組比較，b:P<0.05；與Apelin-13組比較，c:P<0.05

高Hcy血癥是AS的獨立危險因子之一，血管內皮細胞是Hcy的重要靶細胞之一[7]，因此，血管內皮的損傷和功能障礙是AS的始動環(huán)節(jié)，保護血管內皮細胞是防治以AS為基礎的心腦血管疾病的重要舉措。

Apelin是一種小分子的內源性多肽，其基因定位于人染色體的Xq 25-26.3，包含有2個內含子和3個外顯子。Apelin前蛋白原包含有77個氨基酸，其羧基末端含有與APJ特異性結合的區(qū)域[8]。Apelin的羧基末端富含堿性氨基酸殘基(主要包括精氨酸和賴氨酸)，是蛋白水解酶的酶切位點。蛋白水解酶可將Apelin前體肽水解為長度不同的多肽片段，包括Apelin-12、Apelin-13、Apelin-17和Apelin-36等，其中Apelin/APJ系統(tǒng)在心血管系統(tǒng)的表達水平較高，與心血管系統(tǒng)關系密切，以Apelin-13尤為明顯[9]。Apelin在心血管系統(tǒng)中有著廣泛而重要的生理作用，對血管細胞具有保護作用。研究顯示Apelin能夠顯著地降低高血壓大鼠的動脈壓，具有擴血管的作用[10]。Apelin-13還可逆轉醛固酮對血管內皮細胞損傷及對血管緊張素Ⅱ誘導的肺微血管內皮細胞的損傷具有保護作用[11-12]。

本研究的研究結果顯示1.0和10.0 μmol/L的Apelin-13預處理顯著抑制了Hcy誘導的HUVECs存活率的降低和細胞培養(yǎng)液中LDH活力水平的增加，這些結果表明Apelin-13能抑制Hcy誘導的內皮細胞損傷。

Hcy損傷內皮細胞的機制目前還沒有完全闡明清楚，近年來的研究發(fā)現(xiàn)激活 AMPK通路介導了Hcy對內皮細胞的損傷[13-14]。AMPK是一種異源三聚體蛋白，在真核細胞廣泛存在，是高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，AMPK由一個α催化亞基及β和γ兩個調節(jié)亞基組成。AMPK能夠調控細胞的能量代謝，AMPK作為感受細胞能量的開關在細胞的代謝調控中起到十分重要的作用。它的磷酸化激活可以對細胞能量代謝過程的一些關鍵蛋白激酶如：mTOR、PI3K及SREBP-1等進行調控[15]。AMPK也是參與自噬和細胞存活及調亡調控的重要分子，在細胞內AMPK被激活后可對P53、mTOR等在細胞存活、調亡和自噬中的關鍵調控分子進行磷酸化，進而對細胞的存活、調亡和自噬進行調控。研究表明Apelin對AMPK通路具有調控作用，Apelin-13可通過上調AMPK的磷酸化水平可促進進心肌微血管內皮細胞血管生成[16-17]。本研究的研究結果顯示Apelin-13沒有影響HUVECs細胞中t-AMPK蛋白的表達，卻顯著上調了Hcy處理的HUVECs細胞中p-AMPK蛋白的表達。而AMPK抑制劑Compound C部分取消了Apelin-13抑制Hcy誘導的HUVECs存活率的降低和細胞培養(yǎng)液中LDH活力水平增加的作用。因此這些結果表明Apelin-13可能通過上調AMPK磷酸化的水平，激活AMPK信號通過而發(fā)揮血管內皮的保護作用。

總之，我們的結果闡明Apelin-13抑制了同型半胱氨酸誘導的內皮細胞損傷，其機制與可能與上調AMPK的磷酸化有關，為以AS為基礎的心腦血管疾病的防治提供理論依據(jù)和實驗基礎。

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Apelin-13InhibitstheDamageofEndothelialCellsInducedbyHomocysteineviaAMPKPathway

Wang Bo,ZHOU Jie,ZHANG Tao,et al

(DepartmentofInternalCardiology,theSecondAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,China)

ObjectiveTo observate the protective effect of Apelin-13 on homocysteine (Hcy)-induced damage of vascular endothelial cells and to explore the possible mechanism.MethodsHuman umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were incubated with 10 mmol/L Hcy to induce damage.After pretreatment with Apelin-13 (0.1,1.0 and 10.0 μmol/L) for 1 h,the protective effect of Apelin-13 was investigated.MTT assay was used to detect the survival rate of cells.The level of lactate dehydrogenase (LDH) in the medium was measured by colorimetry.The expression of Amp activated protein kinase (AMPK) in HUVECs was measured by Western Blot.ResultsCompared with the control group,the survival rate of cells was singificantly decreased,the level of LDH in the medium was singificantly increased in the Hcy group (allP<0.05).Compared with the Hcy group,the survival rate of cells was singificantly increased,the level of LDH in the medium was singificantly decreased in the Apelin-13 (1.0 and 10.0 μmol /L) groups (allP<0.05).Compared with the control group,the expressions of p-AMPK in the Hcy group did not have singificant difference (P>0.05).Compared with the Hcy group,the expressions of p-AMPK in Apelin-13 (1.0 and 10.0 μmol /L) groups were singificantly up-regulated (allP<0.05).The endothelial cell protection of Apelin-13 was partly abolished by the inhibitor of AMPK Compound C.ConclusionApelin-13 inhibits the damage induced by homocysteine in HUVECs,which the mechanisms may be related to the up-regulation of AMPK phosphorylation.

Apelin-13; Amp activated protein kinase; homocysteine; endothelial cells

R543

A

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.01.007

2015-09-23；

2015-12-15

衡陽市科技計劃項目(2011KJ49).

*通訊作者，E-mail：qichingnudou@tom.com.

秦旭平)