焦子偉，努爾買買提·伊力亞斯，梁 月，楊曉絨

（1.伊犁師范學院化學與生物科學學院，新疆伊寧 835000；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，沈陽 110866）

蛹蟲草交配系統(tǒng)與營養(yǎng)體親和性研究

焦子偉1，努爾買買提·伊力亞斯1，梁 月2，楊曉絨1

（1.伊犁師范學院化學與生物科學學院，新疆伊寧 835000；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，沈陽 110866）

【目的】蛹蟲草是一種藥（食）用真菌，屬典型的子囊菌異宗交配系統(tǒng)，研究蛹蟲草交配系統(tǒng)和營養(yǎng)體親和性。【方法】從蛹蟲草子實體進行單孢子分離，獲得不同的單子囊孢子群體。選取單子囊孢子菌株進行培養(yǎng)并提取菌絲體DNA，設計特異性引物對其交配型目的基因進行PCR擴增，明確不同群體內(nèi)部各單子囊孢子菌株的交配型類型并分析其分離比例。隨機選取不同交配型代表菌種采用對峙培養(yǎng)方法對相同和不同的交配型菌株的營養(yǎng)體親和性進行檢測?！窘Y(jié)果】所有檢測的菌株均具有兩種交配型 MAT1－1或 MAT1－2之一。檢測的不同群體菌株中兩種交配型的分離比例，卡方檢驗均符合1∶1的理論比值。隨機選取不同交配型的菌株進行營養(yǎng)體親和性對峙培養(yǎng)試驗，所選菌株被初步分為4個不同的營養(yǎng)親和群，蛹蟲草存在潛在的遺傳分化。相同交配型菌株之間的營養(yǎng)親和性較高（90%）；相反不同交配型菌種之間的營養(yǎng)親和性比例較低（60%）?！窘Y(jié)論】所有供試單子囊菌株只具有一種交配型且未出現(xiàn)偏分離現(xiàn)象，其交配系統(tǒng)與營養(yǎng)體親和性之間存在一定的相關性，相同交配型菌株組合比不同交配型菌株組合的營養(yǎng)親和性更普遍，因此利用不同交配型且菌絲體營養(yǎng)親和性較高的菌種組合，則更有利于發(fā)育產(chǎn)生原基，形成子實體。

蛹蟲草；單子囊孢子；交配型；親和性；營養(yǎng)親和群

0 引 言

【研究意義】蛹蟲草（Cordyceps militaris）最早源于中國，是一種珍貴的藥（食）用真菌，寄生于鱗翅目昆蟲蛹體后能形成真菌與昆蟲復合體，故又名北冬蟲夏草、北蟲草、蛹草、蛹草菌等［1］?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明蛹蟲草具有多種藥用成分，具有滋肺益氣、增精益腎、止血化痰、抑制腫瘤、延緩衰老、提高機體免疫力等作用，在醫(yī)療保健等領域具有廣闊的市場［2，3］。由于蛹蟲草生活環(huán)境限制，自然蟲草資源逐年減少，導致蛹蟲草子實體價格較高。人工培養(yǎng)蛹蟲草子實體的技術日趨成熟，由于缺乏科學的理論基礎和指導，在生產(chǎn)中經(jīng)常出現(xiàn)菌種退化和子實體產(chǎn)量不高品質(zhì)低下等瓶頸問題［4］。因此加強研究蛹蟲草基礎生物學，特別是遺傳學領域的真菌交配系統(tǒng)與親和性的相互關聯(lián)，以期獲得優(yōu)質(zhì)的穩(wěn)定、高產(chǎn)蛹蟲草菌種及提升人工栽培技術水平十分必要?！厩叭搜芯窟M展】近年來，國內(nèi)外研究人員在人工培養(yǎng)、菌種選育、活性成分以及藥理作用等方面對蛹蟲草作了較為深入的研究［5］。特別是蛹蟲草菌株育種方法有人工馴化、單孢子分離、組織分離、誘變、雜交等，并獲得相對穩(wěn)定的遺傳菌株［6］，但對蛹蟲草的生物學和遺傳學等研究方面仍較薄弱［7］。蛹蟲草是典型的異宗配合的子囊菌，已證明菌絲融合能夠比較客觀地反映真菌種內(nèi)菌株在遺傳、形態(tài)、生理和生態(tài)等各方面的差異，營養(yǎng)親和的個體親緣關系近，不能親和的個體親緣關系遠［8－10］。蛹蟲草含有相互不同源的交配型基因MAT－1－1－1和 MAT1－1－2［11－12］。蛹蟲草交配型基因 MAT1－1序列中α－Box（Genbank ID：AB124614）和MAT1－2序列中 HMG－Box（Genbank ID：AB124626）具有高度保守性，常被作為交配型的分子標記 用 于鑒 定 蛹蟲 草 交 配型 的 不同［11，13］。通過交配型基因的特異引物，確定交配型基因的類型，進而鑒定蛹蟲草的核相類型［13－14］?！颈狙芯壳腥朦c】主要通過生物學及分子生物學方法，進行單子囊孢子分離，利用特異性引物擴增以明確菌種的交配型種類，通過統(tǒng)計學方法檢測兩種交配型分離比例，以獲得不同群體內(nèi)及整合群體的偏態(tài)分布情況，并進一步采用對峙培養(yǎng)方法，對相同和不同交配型菌株的營養(yǎng)親和性進行檢驗和分析?！緮M解決的關鍵問題】明確蛹蟲草的交配系統(tǒng)與菌絲營養(yǎng)親和性之間聯(lián)系，為研究蛹蟲草遺傳分化性的分子機制提供理論基礎，為蛹蟲草栽培菌種的篩選與馴化提供新的技術參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌 株

供試的新鮮人工栽培蛹蟲草子實體取自學院蛹蟲草人工栽培室，其親本菌株源自新疆天山區(qū)域。

1.1.2 供試藥品和培養(yǎng)基

改良馬鈴薯（PDA）固體培養(yǎng)基［15］：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，瓊脂16 g，磷酸二氫鉀（KH2PO4）2 g，七水硫酸鎂（MgSO4·7H2O）1 g，復合VB 25 mg，用水補至1 000mL，pH 6.5～7.0。

改良PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，蛋白胨3 g，磷酸二氫鉀（KH2PO4）2 g，七水硫酸鎂（MgSO4·7H2O）1 g，復合VB 25 mg，用水補至1 000mL，pH 6.5～7.0。

1.0 %水瓊脂：瓊脂粉10.0 g，用水補足至1 000mL。

改良的DNA提取法［13］：抽提緩沖液（50 mM Tri－HCl，150 mM NaCl，100 mM EDTA），20% SDS，5 M NaCl，CTAB／NaCl溶液（10%CTAB，0.7 M NaCl），Tris飽和酚／氯仿／異戊醇（v／v／v，25∶24∶1），氯仿／異戊醇（24∶1），異丙醇，75%乙醇，TE（10 mM Tris－HCl pH 8.0，1 mM EDTA）和RNase A（100g／mL）。

1.2 方 法

1.2.1 單孢子分離

將蛹蟲草子實體懸于 1.0%水瓊脂培養(yǎng)基上方，使子實體上密布的子囊殼內(nèi)的子囊所含的子囊孢子自然彈射，約 1～2 h。在體式解剖鏡下用無菌挑針挑取只有單個子囊孢子的水瓊脂小塊，置于改良的固體 PDA培養(yǎng)基上，23℃下光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以獲得分離的單子囊孢子蛹蟲草菌株。隨機選取4個不同來源的蛹蟲草子實體分別進行單孢子分離，每個子實體至少分離 5個單子囊孢子菌株，源于同一子實體的菌種作為同一群體的代表菌株，每個單子囊孢子菌株命名為群體字母加數(shù)字組成。圖1

圖1 單子囊孢子分離Fig．1 Isolation of single－ascospores of Cordyceps militaris

1.2.2PCR擴增

DNA提取參照［13］的方法，根據(jù)交配型 MAT1－1利用引物（MAT1F，5′－CCATCTCATCGC GGATG－3′；MAT1R，5′－GGGCAAAACGACCATTG－3′），PCR反應體系20 μL，反應條件為：94℃，3 min；94℃變性 30 s，53℃退火 30 s，72℃延伸60 s，35個循環(huán)；72℃下延伸 10 min。根據(jù)交配型 MAT1－2采用引物（MAT2F，5′－ACATACGCTTGTCAAGA －3′，MAT2R 5′－AGGAGAGCCTTCT TGAT－3′），PCR反應體系20 μL，反應條件為：94℃，3 min；94℃變性30 s，48℃退火30 s，72℃延伸60 s，35個循環(huán)；72℃下延伸10 min。PCR產(chǎn)物通過 1.6%瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)電泳結(jié)果確定其交配型的類型。

1.2.3 交配型分離

將不同群體的單子囊孢子菌株進行DNA提取和PCR檢測，對不同來源的群體內(nèi)的交配型分離比率進行分析，以獲得交配型分離特點，并通過卡方檢驗群體是否符合理論上的交配型分離比率。

1.2.4 營養(yǎng)親和性試驗

選取不同交配型代表菌株，接種至改良 PDA固體培養(yǎng)基上，進行兩兩組合配對的對峙培養(yǎng)，每皿放置兩個菌株，以觀察不同和相同交配型菌株兩兩組合的親和性，以同一菌株的自身配對為對照組。接種后培養(yǎng)物，放在23℃黑暗培養(yǎng)4 d，第5 d開始光照／黑暗（16 h／8 h）交替培養(yǎng)。觀察記錄菌落顏色、生長狀態(tài)、有無氣生菌絲；第14 d特別關注菌落結(jié)合區(qū)域菌絲親和性，原基形成和子實體發(fā)育等。持續(xù) 28 d觀察菌株間組合配對結(jié)果有無變化，參考李沛利等［16］的劃分方法，對菌株間配對的結(jié)果進行歸類。

2 結(jié)果與分析

2.1 交配型PCR鑒定

所有供試菌株均能夠擴增出特異性片段，其中代表菌株 A2和 B3能夠通過PCR擴增出交配型基因MAT1－1的α－Box片段，擴增特異性產(chǎn)物大小為233 bp。而菌株A9和B8能夠通過PCR擴增出交配型基因MAT1－2的 HMG－Box片段，擴增特異性產(chǎn)物長度為191 bp。同時，不同交配性菌株 A2、B3和 A9、B8只能擴增出交配型MAT1－1或MAT1－2之一，說明代表菌株只具有一個交配型基因，沒有 MAT1－1和 MAT1－2兩種交配型共同存在的情況，是典型的二級異宗交配系統(tǒng)。圖2

圖2 單子囊孢子菌株交配型PCR鑒定Fig．2 Identification of mating type of single－ascospore strains by PCR

2.2 交配型分離

根據(jù)PCR結(jié)果，統(tǒng)計不同群體內(nèi)單子囊孢子菌株的交配型分布。供試的四個不同群體交配型分布為：群體A，交配型MAT ratio（MAT1－1∶MAT1－2）＝7∶3；群體 B，交配型MAT ratio＝5∶3；群體C，交配型 MAT ratio＝7∶7；群體 D，交配型MAT ratio＝3∶2。37株蛹蟲草單孢分離菌株有22株含有交配型基因MAT1－1，占所有供試菌株的59.5%；有15株含有交配型基因 MAT1－2，占所有供試菌株的40.5%。所有供試單孢分離菌株中交配型MAT ratio＝22∶15。圖3

圖3 不同群體單子囊孢子菌株的交配型分布Fig．3 Distribution of Mating type of different single－ascospore strains

通過統(tǒng)計分析，進行卡方檢測分析發(fā)現(xiàn)，4個獨立的單子囊孢子群體內(nèi)部交配型比例 χ2值均小于3.841（P＜0.05），水平差異不顯著，說明不同群體子囊孢子的交配型 MAT1－1和 MAT1－2分離比例符合1∶1；同時將4個群體進行整合，以作為地域代表群體進行分析表明，交配型MAT1－1和 MAT1－2分離比例符合 1∶1，即說明新疆地區(qū)人工栽培條件下所采集的單子囊孢子群體不存在偏態(tài)分布。表1

2.3 營養(yǎng)親和性

隨機選取兩種不同交配型的菌株（MAT1－1：A2，A5，B3，B9，B11和MAT1－2：A1，A9，B1，B4，B8）在改良 PDA固體培養(yǎng)基上兩兩對峙培養(yǎng)，觀察營養(yǎng)體親和性情況，結(jié)果可以初步分為兩大類（親和與不親和）及四種表型，包括 I型，親和，菌落間無空白且交互處呈線狀隆起并長出原基或子實體；II型，親和，菌落間無空白地帶，無隆起也未長出原基；III型，不親和，一側(cè)菌落邊緣呈線狀隆起并有原基，一側(cè)邊緣處有空白，兩菌落未長平；IV型，不親和，兩菌落接觸，一側(cè)菌落中間邊緣呈線狀隆起及原基，一側(cè)沒有 。圖4

表1 不同群體交配型分離Table 1 Segregation of mating types in different groups

四種表現(xiàn)型在不同對峙培養(yǎng)組合之間的分布各不相同。具有相同交配型MAT1－1的菌株組合兩兩對峙培養(yǎng)時，配對菌落生長狀態(tài)出現(xiàn)了三種表型，I型和 II型分別各有7對，III型為 1對，并未出現(xiàn) IV型。具有相同交配型 MAT1－2的菌株組合兩兩對峙培養(yǎng)時，僅出現(xiàn)了13對 II型和2對 IV型，其中II型占到了將近 90%。另外，不同交配型MAT1－1與 MAT1－2的菌株對峙培養(yǎng)時，四種表現(xiàn)型均可觀察到；其中，9對組合表現(xiàn)出I型，6對組合表現(xiàn)出II型，3對組合表現(xiàn)出 III型，7對組合表現(xiàn)出 IV型，出現(xiàn)頻率從高到低為：I型≥IV型≥II型≥III型。表2

圖4 菌株在改良 PDA培養(yǎng)基上對峙培養(yǎng)四種表型Fig．4 Four phenotypes of paired strains by crossing culture on modified PDA

表2 不同代表菌株在改良 PDA培養(yǎng)基上對峙培養(yǎng)表型分布Table 2 Distribution of phenotypes of paired strains by crossing culture on modified PDA

對所有供試單子囊孢子菌株營養(yǎng)親性分析發(fā)現(xiàn)群體中，親和性比例為 76.4%，不親和比例23.6%。研究表明，不同交配型（MAT1－1與MAT1－2）對峙培養(yǎng)時，營養(yǎng)體親和比例為 60.0 %，不親和比例為40.0%。相同交配型（MAT1－1及 MAT1－2）對峙培養(yǎng)時，營養(yǎng)體親和比例為90%，不親和比例為10%；其中，交配型MAT1－1對峙培養(yǎng)時，營養(yǎng)體親和比例為93.3%，不親和比例為6.7%；交配型 MAT1－2對峙培養(yǎng)時，營養(yǎng)體親和比例為86.7%，不親和比例為13.3%營養(yǎng)親和性結(jié)果表明，同種交配型之間配對組合表現(xiàn)出較好的親和性，但是原基發(fā)育的很少；而不同交配型 MAT1－1和MAT1－2之間雜交組合的營養(yǎng)親和比例相對較低，親和性良好的組合均發(fā)育成原基，說明具有不同交配型且營養(yǎng)親和性良好的蛹蟲草菌株，更容易發(fā)育原基，形成子實體。表3，圖5

表3 不同菌株間營養(yǎng)體親和性Table 3 Vegetative compatibility of different strains

圖5 交配型組合的親和性Fig．5 Compatibility of combination between mating types

3 討 論

蛹蟲草為典型的二級異宗交配系統(tǒng)，由兩個不同交配型的發(fā)生親和的同核體配合后形成異核體，異核體發(fā)育形成子實體，而缺失了交配型基因的同核體不能完成有性生活史，理論上不能形成正常的蛹蟲草子實體［10］。由此推斷大部分蛹蟲草子實體應該是異核體而非同核體，形成異核體時兩種交配型基因隨機組合，蛹蟲草交配型基因是互不同源的，兩種交配型比例應為1∶1。研究檢測結(jié)果表明所有供試菌株中只含有一種交配型（MAT1－1或MAT1－2），沒有兩種交配型共存的情況，并通過卡方檢驗表明不同群體子囊孢子交配型分離比例符合 1∶1，說明供試的蛹蟲草群體中交配型均沒有出現(xiàn)分離現(xiàn)象。

真菌營養(yǎng)體親和性鑒定通過抗衡區(qū)的產(chǎn)生、隱性的營養(yǎng)缺陷型或色素標記的互補作用以及菌系的生長特性來觀察測定［7］。相同交配型單子囊孢子菌株間產(chǎn)生子實體或菌株自身產(chǎn)生子實體的沒有不同交配型菌株配對形成子實體的產(chǎn)量高，且相同交配型菌株的配對組合及單子囊孢子菌株自交產(chǎn)生的子實體通常情況下不能產(chǎn)生子囊和子囊孢子［13］。研究通過試驗表明交配系統(tǒng)與營養(yǎng)親和性之間具有一定的潛在聯(lián)系，同種交配型菌株之間表現(xiàn)親和性高于不同交配型菌株之間；同種交配型菌株之間也有營養(yǎng)不親和現(xiàn)象，這可能是菌株交配型相同但來源不同，親緣關系較遠導致。另外，同種交配型之間對峙培養(yǎng)表現(xiàn)出較好的親和性，但是由于缺乏遺傳因子（如交配型），從而導致鮮有原基發(fā)育；值得注意的是不同交配型之間其營養(yǎng)親和性比例較低；但具有營養(yǎng)親和性的不同交配型菌種之間，大多可以發(fā)育原基并形成子實體。

4 結(jié) 論

所有供試群體中，單子囊菌株只具有一種交配型（MAT1－1或MAT1－2），交配型 MAT1－1和 MAT1－2分離比例符合 1∶1，且交配型未出現(xiàn)偏分離現(xiàn)象。蛹蟲草交配系統(tǒng)與營養(yǎng)親和性之間具有一定的潛在相關性，相同交配型菌株之間的營養(yǎng)親和性為90%，較高；不同交配型菌種之間的營養(yǎng)親和性比例60%，較低。相同交配型菌株比不同交配型菌株營養(yǎng)體之間更普遍存在營養(yǎng)親和性；但如果不同交配型菌株具有營養(yǎng)親和性，則更有利于原基發(fā)育及子實體形成。

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Preliminary Study on Mating System and Vegetative Compatibility in Cordyceps militaris

JIAO Zi－wei1，Nuermaimaiti1，LIANG Yue2，YANG Xiao－rong1
（1．College of Chemistry and Biological Sciences，Yili Normal University，Yining Xinjiang 835000，China；2．College of Plant Protection，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China）

【Objective】Cordyceps militaris is a kind of medical and edible fungus，which is a typically heterothallic ascomycetous fungus.This project aims to conduct a preliminary investigation of the correlation of mating system and vegetative compatibility.【Method】In this paper，different single－spore groups were obtained through single ascospore isolation from the different fruiting bodies of C．militaris．The isolated strains were cultured and mycelial DNA was extracted.Design specific primers were designed for PCR amplification of mating type gene to identify the mating types and segregation ratio.Some strains were randomly selected to detect vegetative compatibility between the same and／or the different mating type strains using the confrontation training method between paired cultures.【Result】The results showed that all detected strains were either mating type MAT 1－1 or MAT 1－2.Difference sampling groups were determined and thereafter the segregation ratio was analyzed by Chi－square，which indicated that the ratio of two mating types was consistent with a theoretical segregation ratio of 1∶1.The strains with the different mating type were randomly chosen to investigate the vegetative compatibility using crossing culture between paired strains.The results indicated that the strains were divided into four vegetative compatibility groups，which indicated the potentially genetic differentiation.Vegetative compatibility between the strains between the same mating type（s）was higher（90%）than those between the different mating types（60%）.【Conclusion】All the tested single ascospores only showed one of mating types and the population sample did not present segregation distortion.The correlation of mating system and vegetative compatibility in C．militaris was possible.The vegetative compatibility of strain in combination with the same mating type was more widespread than that of different mating types.Thereafter，the combination of the strains with different mating types and vegetative compatibility suggested utilization for development of stroma and formation of fruiting body.

Cordyceps militaris；Single ascospore；mating type；compatibility；vegetative compatibility group

S188＋.2

A

1001－4330（2016）09－1708－07

10.6048／j.issn.1001－4330.2016.09.019

2016－02－23

新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆項目（201491153）；遼寧省高等學校優(yōu)秀科技人才支持計劃（LR2015058）

焦子偉（1973－），男，河南人，副教授，博士，研究方向為微生物生態(tài)，（E－mail）741285332＠qq.com

（Cotresponding author）：努爾買買提·伊力亞斯（1971－），男，新疆伊寧人，副教授，博士研究生，研究方向為植物分類，（E－mail）2696232271＠qq.com梁月（1978－），男，遼寧人，教授，博士，研究方向為真菌生物學及植物真菌病害，（E－mail）yliang＠syau.edu.cn

Fund project：Supported by The Xinjiang Uygur Autonomous Region science and technology support project（201491153）and Liaoning Province university outstanding scientific and technical personnel support program（LR2015058）.