李 群，田 茜，賈文斌，戴 雙，王 棟，張文蘭

山東省農(nóng)作物種質(zhì)資源中心，山東 濟(jì)南 250100

生物超弱發(fā)光特性在種質(zhì)資源保存中的應(yīng)用研究

李 群，田 茜，賈文斌，戴 雙，王 棟，張文蘭

山東省農(nóng)作物種質(zhì)資源中心，山東 濟(jì)南 250100

為了探索一種快捷、無損、準(zhǔn)確測(cè)定種子活力的方法，選取不同貯存年限的小麥、玉米、大豆、水稻等4種作物，測(cè)量其超微弱發(fā)光強(qiáng)度，將作出的曲線與發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)曲線進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明，不同作物間因其自身的特性，超弱發(fā)光值存在明顯的差異；同一品種不同保存年限的種子超弱發(fā)光能力差異明顯，其超弱發(fā)光強(qiáng)度與貯存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，且與其發(fā)芽勢(shì)變化呈現(xiàn)極強(qiáng)的正相關(guān)；建立了不同作物基于超弱發(fā)光的種子活力預(yù)測(cè)模型，延遲發(fā)光擬合曲線可間接反映種子的活力。因此，通過測(cè)定種子的自發(fā)發(fā)光和延遲發(fā)光參數(shù)及做出的擬合曲線，可以快速、無損地判斷儲(chǔ)藏種子活力的高低，確保種子的安全貯存與適時(shí)更新。

生物超弱發(fā)光；種子活力；種質(zhì)資源；保存

眾所周知，種子在貯存過程中隨著時(shí)間的延長會(huì)發(fā)生老化、劣變而導(dǎo)致生理生化特性發(fā)生改變，由此造成種子質(zhì)量特性——種子活力的下降。常用檢測(cè)種子活力的方法有直接法和間接法，這些都屬于有損檢測(cè)。特別對(duì)于稀有種子，用這些方法測(cè)定后將無法再利用，造成不可挽回的資源損失，因此，在種質(zhì)資源保存領(lǐng)域，需要一種快速、無損的種子活力檢測(cè)方法。

生物組織或細(xì)胞在生命活動(dòng)的代謝過程中都會(huì)自發(fā)地輻射出一種極其微弱的光子流[1]，其強(qiáng)度為幾個(gè)到幾百個(gè)光子.s-1.cm-2，波長范圍180～800 nm，稱為生物系統(tǒng)的代謝超微弱發(fā)光 （ultra-weak luminescence，UWL），反映了生物體與生命活動(dòng)過程的有關(guān)信息[2]。

生物超弱發(fā)光通常包括兩部分：一種為自發(fā)的超微弱發(fā)光，與生物體的代謝有關(guān)；另一種為延遲發(fā)光 （delayed luminescence，DL），是由外界如光、電離輻射、超聲、化學(xué)藥物等因素誘導(dǎo)而發(fā)光。自發(fā)發(fā)光和延遲發(fā)光與生物的新陳代謝狀態(tài)和水平，細(xì)胞的分裂、死亡、變異以及細(xì)胞間信息的傳遞等許多基本的生命過程都有著內(nèi)在的聯(lián)系，是反映生物體內(nèi)部機(jī)能的一個(gè)重要窗口[3，4]。

本試驗(yàn)利用生物超弱發(fā)光特性，在不破壞被檢種子物理和化學(xué)結(jié)構(gòu)的情況下檢測(cè)種子的發(fā)光光子數(shù)，以此分析與貯存時(shí)間的關(guān)系，以期為種質(zhì)資源的安全貯存與適時(shí)更新提供一種無損、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從種子資源庫中選取小麥、玉米、大豆、水稻4種作物的種子，貯存時(shí)間分別是1年、3年、5年、7年、9年，貯存溫度為0℃，濕度為30%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽率的測(cè)定

取以上4種作物種子，在自然狀態(tài)下放置24 h，使其溫度與環(huán)境一致，然后按照《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》（GB/T3543.3-1995）的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)。

1.2.2 自發(fā)發(fā)光的測(cè)量

從庫中取出種子，置于4℃保鮮箱中24 h緩慢升溫，再置于生化培養(yǎng)箱中緩慢升溫至25℃，使之盡量保持種子貯存時(shí)的自然狀態(tài)，不因?yàn)樯郎仄茐姆N子的基礎(chǔ)代謝。為了使種子數(shù)量能夠覆蓋測(cè)量杯底并略有盈余，從每個(gè)年份的種子中隨機(jī)取出3組（小麥每組50粒、玉米10粒、大豆15粒、水稻70粒）。先將種子置于暗室中30 min，隨后取出放入超微弱發(fā)光測(cè)量儀的測(cè)量杯中進(jìn)行測(cè)定，時(shí)間為100 s，以每種樣品3組的測(cè)量平均值作為總光子數(shù)，計(jì)算自發(fā)光光子數(shù)。

式中：t為100 s，N為總光子數(shù)，n為種子總粒數(shù)。

1.2.3 延遲發(fā)光的測(cè)量

為從多個(gè)方面反映貯存時(shí)間對(duì)種子生理特性的影響，可采用延遲發(fā)光特征檢測(cè)。經(jīng)過外界較強(qiáng)光照的激發(fā)，對(duì)在低溫、低氧、超干條件下長時(shí)間貯存的種子起到“喚醒”作用。有文獻(xiàn)報(bào)道可采用幾十Lux[5]的日光燈或LED燈珠照射新鮮種子，而本試驗(yàn)中部分種子經(jīng)過了較長時(shí)間的貯存，因而選擇光強(qiáng)度為4 000 Lux的日光燈為光源對(duì)種子進(jìn)行照射。樣品分組方式與自發(fā)發(fā)光測(cè)量相同，將待測(cè)樣品依次照射2 min，迅速測(cè)定延遲發(fā)光光子數(shù)，每次100 s。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)測(cè)定結(jié)果

由圖1可知，小麥、玉米、大豆、水稻4種作物種子的發(fā)芽率隨著貯存時(shí)間的延長逐漸降低，而且趨勢(shì)大致相同，與貯存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，大體上是 1~7年間發(fā)芽率緩慢降低，7年后明顯降低。圖2反映出4種作物的發(fā)芽勢(shì)曲線與發(fā)芽率相似，降低趨勢(shì)也基本一致。不同作物之間的發(fā)芽勢(shì)則有明顯差異，其中大豆發(fā)芽勢(shì)曲線略有不同，表現(xiàn)為保存5年的大豆種子呈現(xiàn)出顯著下降，之后趨于平緩。這是由于大豆屬高脂肪作物，含有豐富的不飽和脂肪酸，在儲(chǔ)存過程中極易氧化變質(zhì)，耐貯性低于其他3種作物。

圖1 4種作物種子發(fā)芽率與保存時(shí)間的關(guān)系

圖2 4種作物種子發(fā)芽勢(shì)與保存時(shí)間的關(guān)系

種子活力的高低體現(xiàn)在發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)的高低。隨著貯存時(shí)間的延長，種子內(nèi)部的營養(yǎng)物質(zhì)逐步呼吸消耗，種子的生命活力衰退，表現(xiàn)出種子的發(fā)芽力在逐年降低，因而對(duì)活力變化趨勢(shì)的影響是一致的，但在貯存過程中，這4種作物的耐貯性因作物類別而呈現(xiàn)差異。

2.2 發(fā)光檢測(cè)結(jié)果與分析

將4種作物不同保存年限種子測(cè)得的自身發(fā)光光子數(shù)作圖3?？梢钥闯觯N子保存時(shí)間不同，其自身發(fā)光存在明顯差異，呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，這是由于隨著時(shí)間的延長，自身的生理活動(dòng)（呼吸氧化作用）、各種酶的活動(dòng)在外界環(huán)境的影響下發(fā)生了生理生化的變化，活力也隨之降低，總體上是隨保存時(shí)間的延長而減弱，這與圖2的發(fā)芽勢(shì)曲線具有相同的變化趨勢(shì)。而不同作物種子之間也存在著明顯差異，這可能與種子本身的特性，如種子大小、內(nèi)在品質(zhì)、活性氧及還原性物質(zhì)的含量等有關(guān)。大豆的超弱發(fā)光曲線與其他3種作物略有不同，保存前3年變化較小，保存第5年以后則急劇下降，與發(fā)芽勢(shì)曲線相似。

圖3 4種作物種子自身發(fā)光光子數(shù)隨保存時(shí)間的變化趨勢(shì)

通過對(duì)4種作物發(fā)芽勢(shì)及超弱發(fā)光數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析（見表1），相關(guān)系數(shù)達(dá)0.96~0.98，表明差異達(dá)極顯著水平，存在極強(qiáng)的正相關(guān)，這也證明了種子超弱發(fā)光強(qiáng)度的高低在一定程度上反映種子活力的大小，可以作為衡量種子活力的重要指標(biāo)。

表1 4種作物發(fā)芽勢(shì)及超弱發(fā)光的相關(guān)度

2.3 延遲發(fā)光結(jié)果與分析

種子經(jīng)過強(qiáng)光激發(fā)后測(cè)得延遲發(fā)光數(shù)據(jù)，作出擬合曲線如圖4、圖5、圖6和圖7，經(jīng)比較分析其規(guī)律后，可以較好地反映種子活性與貯存時(shí)間在延遲發(fā)光方面有密切關(guān)聯(lián)。

圖4 不同保存時(shí)間大豆種子的延遲發(fā)光擬合曲線

圖5 不同保存時(shí)間玉米種子的延遲發(fā)光擬合曲線

圖6 不同保存時(shí)間水稻種子的延遲發(fā)光擬合曲線

圖7 不同保存時(shí)間小麥種子的延遲發(fā)光擬合曲線

同一種種子延遲發(fā)光的擬合曲線呈現(xiàn)出明顯的層次性，保存時(shí)間長的種子其光子數(shù)高于貯存時(shí)間短的種子。這種現(xiàn)象的原因可能在于種子遭受外界環(huán)境干擾時(shí)（光照）要靠自身的新陳代謝來修復(fù)，保存時(shí)間短的種子可能快速修復(fù)完畢，而保存時(shí)間長的種子仍在進(jìn)行旺盛的新陳代謝來修復(fù)細(xì)胞基礎(chǔ)代謝，導(dǎo)致貯存時(shí)間長的種子發(fā)光強(qiáng)度高于保存時(shí)間短的種子。

另外，不同作物之間的延遲發(fā)光初始強(qiáng)度亦存在差異，表現(xiàn)為大豆＞小麥＞水稻＞玉米。這可能是由于不同作物種子內(nèi)部的細(xì)胞內(nèi)高分子物質(zhì)如淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、可溶性糖等含量的差異，反映到DL特性上的結(jié)果。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)4種作物5個(gè)貯存年限的種子進(jìn)行了超弱發(fā)光測(cè)量，結(jié)果顯示，種子的自發(fā)光強(qiáng)度與貯存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)性，即種子儲(chǔ)藏時(shí)間越長，自身發(fā)光強(qiáng)度越弱，這與種子活力水平的變化相一致，由此可作為檢測(cè)種子活力的主要指標(biāo)。而在延遲發(fā)光方面，則表現(xiàn)出貯存時(shí)間與延遲發(fā)光特性呈正相關(guān)性，即貯存時(shí)間長的種子其光子數(shù)越高。這種特性很好地將延遲發(fā)光作為反映種子內(nèi)部新陳代謝變化的一個(gè)窗口，可以作為衡量種子活力高低的另一指標(biāo)。

許多研究認(rèn)為，種子超弱發(fā)光強(qiáng)弱與其內(nèi)部基礎(chǔ)代謝活動(dòng)有著非常密切的關(guān)聯(lián)[6～9]，本研究也得出了與之相符的結(jié)果?；诔醢l(fā)光特性對(duì)生理狀態(tài)變化的敏感性以及對(duì)許多物理、化學(xué)因素的敏感性，為其作為表征貯存種子活力狀態(tài)的指標(biāo)提供了可行的依據(jù)。由于本試驗(yàn)參試作物的種類較少，在其他類別種子中的應(yīng)用有待于進(jìn)一步探索。

總之，相對(duì)于傳統(tǒng)化學(xué)檢測(cè)方法及其他有損傷檢測(cè)，該方法樣品量少且不破壞種子，特別對(duì)于種子量少的珍貴品種極其有益，是一種費(fèi)用低、靈敏度高、快速、簡潔的方法，在種質(zhì)資源保存中有著廣泛的應(yīng)用前景。

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1005-2690

S325

B

李群 （1962-），女，漢族，上海人，大專，高級(jí)農(nóng)藝師，主要從事種子質(zhì)量檢測(cè)及新技術(shù)、新方法研究。

2015-09-15

濟(jì)南市科學(xué)技術(shù)局、濟(jì)南市高校院所自主創(chuàng)新項(xiàng)目“種子活力快速鑒定新方法的研究”（編號(hào)：201202062）

（2016）01-0034-04