李晶 沈震亞 陳超 文萍#

（1江西省中醫(yī)藥研究院 南昌 330046；2江中藥業(yè)股份有限公司 江西 南昌 330046）

南丹參不同提取部位體外抗氧化活性比較*

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（1江西省中醫(yī)藥研究院 南昌 330046；2江中藥業(yè)股份有限公司 江西 南昌 330046）

目的：研究南丹參不同提取部位對1,1-二苯基苦肼（DPPH）的清除能力，結(jié)合化學成分分析，初步揭示南丹參抗氧化藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。方法：用回流提取法、水煎煮提取法結(jié)合不同溶劑梯度萃取法制備南丹參8個不同提取部位，通過觀察其對DPPH自由基清除能力測定南丹參提取部位的體外抗氧化活性，并結(jié)合HPLC化學成分分析揭示其抗氧化作用物質(zhì)基礎(chǔ)。結(jié)果：南丹參各提取物中5個提取部位均有不同程度的體外抗氧化活性，其中以水-萃取后水部位抗氧化效果最佳，其次為醇-水沉部位，按每克藥材計DPPH清除量分別為155.269 mg和109.305 mg。結(jié)論：通過對南丹參不同提取部位抗氧化活性能力比較結(jié)合HPLC成分分析，發(fā)現(xiàn)其主要抗氧化活性成分為其中所含的原兒茶醛、丹酚酸B、丹參素鈉和丹參酮ⅡA。

南丹參；提取部位；DPPH

南丹參是江西省廣泛分布的野生藥用資源，收載于2014年版江西省中藥材標準，為唇形科植物南丹參Salvia bowleyana Dunn的干燥根及根莖，具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩的功效[1]，在我國部分地區(qū)作為丹參的替代用藥使用[2]。郭巧茹等[3]通過1,1-二苯基苦肼（DPPH）清除法對南丹參不同器官的抗氧化能力進行了比較研究，發(fā)現(xiàn)酚酸類成分是南丹參抗自由基的主要活性成分。本次實驗通過對南丹參藥材各個提取部位進行抗氧化活性研究，從中篩選出DPPH清除能力強的活性部位并通過HPLC法對其抗氧化活性成分進行了鑒定。現(xiàn)報告如下：

1 材料

1.1 提取部位的制備

1.1.1 藥材來源南丹參藥材采自江西省都昌縣武三鎮(zhèn)武山林場（經(jīng)度：116°28'12.36"，緯度：29° 31'54.12"），原植物經(jīng)我院虞金寶研究員鑒定為南丹參，采集后除去雜質(zhì)，低溫烘干，并粉碎成過40目篩的粉末，備用。

1.1.2 醇溶性各提取部位的制備取南丹參藥材粉末20 g置平底燒瓶中，加6倍量乙醇回流提取2次，每次2 h，濾過，合并乙醇提取液，取適量稀釋至藥材含量為0.4 g/ml，備測，剩余部分減壓回收乙醇，加純凈水稀釋成藥材含量為1 g/ml的混懸液，依次以等量石油醚（60～90℃）、乙酸乙酯、正丁醇梯度萃取2次，分別收集各部位及水沉部位。

1.1.3 水溶性各提取部位制備取上述回流提取后的藥渣，揮去乙醇加6倍量水煎煮提取2次，每次2 h，濾過，合并水煎煮液，取適量稀釋至藥材含量為0.4 g/ml，備測，剩余部分減壓濃縮至藥材含量1g/ml，先后以等量乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取2次，分別收集各部位及水部位。

1.2 儀器與試劑SHIMADZU UV-2450型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；1,1-二苯基苦肼（美國Sigma公司），無水乙醇（分析純），娃哈哈純凈水。

2 實驗內(nèi)容及方法

2.1 DPPH自由基清除測定法分別精密吸取1 ml南丹參各提取部位，配1 mg/ml濃度的待測溶液，加入0.102 mg/ml的DPPH溶液3 ml，搖勻后放置60 min，以無水乙醇為空白對照，測定517 nm處的吸收度值，記為A1；再測定上述1 ml無水乙醇與3 ml DPPH溶液混合后517 nm處的吸收值，記為A2，通過以下公式計算對DPPH自由基的清除量。清除量（mg/g）=（A1－A2）÷A1×0.102×3×1 000。

2.2 線性關(guān)系考察取0.102 mg/ml DPPH母液以無水乙醇梯度稀釋成每毫升含DPPH為89.25、76.50、51.00、38.25、25.50、10.20 μg的溶液并測定吸光度，分別以DPPH濃度和吸光度為X、Y值進行線型回歸，得回歸方程Y=0.011 128 86X+0.668 711，R2=0.992。結(jié)果表明：DPPH含量在10.2～102 μg/ml之間濃度與吸光度呈線性相關(guān)。

2.3 反應時間考察參照文獻[4]并稍作改進，精密吸取1 ml南丹參水提取部位溶液，加入0.102 mg/ml的DPPH溶液3 ml，搖勻后放置90 min，以無水乙醇為空白對照，于517 nm處每隔2 min測定吸收度，通過制備吸收度-反應時間曲線確定反應完全時間為60 min，見圖1。

圖1 吸收度-反應時間曲線

2.4 各提取部位抗氧化能力測定取南丹參藥材各提取部位，以無水乙醇稀釋分別至每毫升含藥材量為72、120、240、400、800、1 200和4 000 μg的待測液，按2.1項下分別測定吸收度，并計算各提取部位DPPH清除量。研究發(fā)現(xiàn)南丹參醇提取物中正丁醇部位、水提取物中乙醚和乙酸乙酯部位基本無DPPH清除能力，其他各部位DPPH清除量較高，依次為水-萃取后水>醇-水沉>水-正丁醇>醇-石油醚>醇-乙酸乙酯，同時構(gòu)建各提取物加入量與DPPH清除量的量效關(guān)系曲線，并分別計算每克南丹參藥材各提取物的DPPH清除量。見表1。

表1 南丹參各提取部位DPPH清除能力測定

2.5 各提取部位抗氧化活性物質(zhì)HPLC分析基于前期南丹參藥材指紋圖譜研究基礎(chǔ)，為探明各提取部位中抗氧化活性成分，我們對有較好DPPH清除能力的各提取部位進行了HPLC色譜分析，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，這些提取部位所含化學成分主要為丹酚酸B、原兒茶醛、丹參素、丹參酮ⅡA以及丹參酮Ⅰ。

3 討論

在各提取部位DPPH清除能力測定方法制定中，我們參照文獻[3～5]，采用1 ml待測液加上3 ml DPPH母液的混合液作為底色，對清除量進行修正，結(jié)果通過對濃度在線性范圍內(nèi)的多批提取物進行吸收度測定，結(jié)果均顯示在517 nm處無吸收。因此，對DPPH清除量計算進行了優(yōu)化。此外，為進一步驗證南丹參中具有抗氧化活性部位所含主成分的抗氧化活性，我們同時對HPLC分析出的各成分的對照品溶液進行了DPPH清除能力測定，結(jié)果顯示每微克丹酚酸B、原兒茶醛、丹參素、丹參酮ⅡA以及丹參酮Ⅰ對照品DPPH清除量依次為：4.398 mg、13.026 mg、4.256 mg、0.790 mg和0 mg，提示南丹參抗氧化活性成分為丹酚酸B、原兒茶醛、丹參素和丹參酮ⅡA。

南丹參、丹參同屬唇形科中藥材，丹參是植物丹參的干燥根及根莖，南丹參是植物南丹參的干燥根及根莖，因兩者在功效方面存在相同性，且南丹參在我國部分地區(qū)為地方習用藥材，在江西、浙江民間亦作丹參入藥。我們通過參加全國第四次資源普查發(fā)現(xiàn)南丹參廣泛分布于江西省多個地區(qū)，且有一定蘊藏量。為擴大南丹參藥用的使用范圍，本研究對其化學成分和藥理藥效等方面進行了部分研究，為相關(guān)南丹參的臨床應用和深入開發(fā)提供技術(shù)支撐。

[1]江西省食品藥品監(jiān)督管理局.江西省中藥材標準[S].上海:上?？茖W技術(shù)出版社,2014.230-231

[2]衛(wèi)生部藥政管理局.中藥材手冊[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1990.54

[3]郭巧茹,陳鶯鶯,李琳,等.南丹參不同器官提取物清除DPPH能力的研究[J].福建師范大學學報(自然科學版),2012,28(1):98-101

[4]李紅,張元湖.應用DPPH法測定蘋果提取物的抗氧化能力[J].山東農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版),2005,35(1):35-38

[5]王桂芹,鄭玉華,錢進芳.虎杖根莖中蒽醌類成分的體外抗氧化活性[J].植物資源與環(huán)境學報,2011,20(2):43-48

R965

B

10.13638/j.issn.1671-4040.2016.10.045

2016-09-13）

江西省自然科學基金青年基金項目（編號：20142BAB215065）

#通訊作者：文萍，E-mail：14834129@qq.com