熊翠玲林躍文梁勤鄭燕珍徐細(xì)建張曌南黃枳腱郭睿陳大福

（1福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院，福州350002；2龍?zhí)镘S文蜂業(yè)專業(yè)合作社，泉州362114）

一種囊狀幼蟲病毒分子標(biāo)記的克隆

熊翠玲1林躍文2梁勤1鄭燕珍1徐細(xì)建1張曌南1黃枳腱1郭睿1陳大福1

（1福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院，福州350002；2龍?zhí)镘S文蜂業(yè)專業(yè)合作社，泉州362114）

蜜蜂囊狀幼蟲病是由囊狀幼蟲病毒（Sacbrood virus，SBV）侵染蜜蜂幼蟲而導(dǎo)致的一種致死性病毒病。本研究根據(jù)GeneBank上SBV多個(gè)毒株的基因組信息設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性引物，從出現(xiàn)囊狀幼蟲病典型癥狀的中蜂幼蟲中擴(kuò)增出一個(gè)大小約為106 bp的特異性SBV106片段，進(jìn)而將其克隆進(jìn)pGEM-T載體，經(jīng)藍(lán)白斑篩選出陽性質(zhì)粒，EcoRⅠ酶切可得約106 bp大小的目的片段，陽性質(zhì)粒原菌液測(cè)序結(jié)果顯示該片段與SBV全序列（收錄號(hào)：AF092924）的相似度達(dá)100%，證明該序列為SBV特有序列。上述結(jié)果表明SBV106片段可作為檢測(cè)蜜蜂囊狀幼蟲病的分子標(biāo)記，應(yīng)用于養(yǎng)蜂生產(chǎn)。

囊狀幼蟲病毒；分子標(biāo)記；PCR；克隆

1 引言

蜜蜂是社會(huì)學(xué)模式昆蟲，也是一種重要的授粉昆蟲，對(duì)全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有著至關(guān)重要的作用[1]。中華蜜蜂（Apis cerana cerana）（簡(jiǎn)稱中蜂）特指我國的土著蜂[2]，與意大利蜜蜂（Apis mellifera Ligustica）（簡(jiǎn)稱意蜂）相比，中蜂相對(duì)勤奮、敏捷、適應(yīng)性強(qiáng)、嗅覺更靈敏，善于發(fā)現(xiàn)和利用零星蜜源，抗逆性強(qiáng)，表現(xiàn)為冬季更較耐寒，夏季較耐熱，而且中蜂抵抗螨蟲、美洲幼蟲腐臭病、白堊病的能力比意蜂強(qiáng)，不足是抵抗巢蟲的能力較差，清理能力差，喜歡新的巢脾，?？幸f巢脾，蜂王的產(chǎn)卵能力不及意蜂王，春季和秋季容易分蜂，還容易迷巢，易發(fā)生盜蜂，多數(shù)蜂群群勢(shì)較弱，產(chǎn)漿量極低[3-5]。

囊狀幼蟲病毒是由囊狀幼蟲病毒（Sacbrood virus，SBV）侵染蜜蜂引起的疾病，早在1913年就見諸報(bào)道[6]。SBV是傳播最廣的蜜蜂病毒之一，傳染性極強(qiáng)[7]，對(duì)世界各地蜜蜂的健康造成極大危害，自從1913年美國首次鑒定[8]后，在各個(gè)大洲都有發(fā)現(xiàn)[6,9-11]，是第一個(gè)被鑒定的蜜蜂幼蟲病毒[8]，也是第一個(gè)全基因組測(cè)序的蜜蜂病毒[12]，該病毒為單鏈正義RNA[13]，屬于小RNA病毒科，無囊膜，外形無特征，含有4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白[14]。

目前有多種分子生物學(xué)方法可以定性檢測(cè)SBV，如：RT-PCR[15]，Nest-PCR[16]，免疫擴(kuò)散技術(shù)，酶聯(lián)免疫法，電子顯微鏡鏡檢，Western Blotting[17]，實(shí)時(shí)熒光定量PCR[18]，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）[19]。本研究根據(jù)Genbank中SBV全序列保守區(qū)段設(shè)計(jì)特異性引物，通過對(duì)患囊狀幼蟲病的中蜂幼蟲進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得特異性分子標(biāo)記，然后將其克隆至pGEM-T載體，進(jìn)而在不同來源的患病幼蟲上驗(yàn)證該分子標(biāo)記的特異性，為下一步實(shí)時(shí)熒光定量PCR提供目的基因。

2 材料與方法

2.1材料

出現(xiàn)囊狀幼蟲病典型癥狀的中蜂幼蟲，分別采自福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院教學(xué)實(shí)驗(yàn)蜂場(chǎng)、福建省福州市晉安區(qū)壽山鄉(xiāng)蜂場(chǎng)和湖北省鐘祥市蜂場(chǎng)。

2.2方法

2.2.1 患病幼蟲總RNA提取與cDNA合成

取2只患病中蜂幼蟲放入1.5 mL EP管中，充分研磨，根據(jù)RNA抽提試劑盒（TaKaRa公司，日本）說明書提取研磨樣品總RNA。為排除無關(guān)DNA的污染，使后續(xù)實(shí)驗(yàn)不受干擾，用無Rnase的Dnase I（TaKaRa公司，日本）處理上述RNA，然后按照cDNA合成試劑盒（Promega公司，美國）說明書將經(jīng)處理的RNA反轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)cDNA。

2.2.2 目的基因的擴(kuò)增及克隆

參照GenBank中SBV多個(gè)毒株的基因組序列，利用DNAman軟件（LynnonBiosoft公司，美國）在病毒序列保守區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，SBV106F：5’-AGGATTGGTTGGTTGCGAAGTT-3’，SBV106R：5-CCTACCTCAGCGTCGTACATTC-3’。同時(shí)選擇基因βactin作為內(nèi)參基因，其引物序列參照已有文獻(xiàn)報(bào)道[12]（β-actinF：5’-TGCCAACACTGTCCTTTCTG-3’，β-actinR：5’-AGAATTGACCCACCAATCCA-3’）。引物委托上海生工生物工程有限公司合成。

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，分別以上述引物對(duì)SBV106分子標(biāo)記和β-actin進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s、57℃退火30 s、72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%（W/V）的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳30 min，EB染色8 min，并用凝膠成像系統(tǒng)（培清科技有限公司，中國）進(jìn)行拍照。利用膠回收試劑盒（Axygen公司，美國）純化SBV106分子標(biāo)記對(duì)應(yīng)的DNA片段，然后連接pGEM-T載體（Promega公司，美國），轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，利用藍(lán)白斑篩選陽性質(zhì)粒。利用質(zhì)粒抽提試劑盒（Axygen公司，美國）抽提菌液中的陽性質(zhì)粒，利用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ（TaKaRa公司，日本）對(duì)其進(jìn)行酶切鑒定，酶切鑒定為陽性的質(zhì)粒原菌液送上海生工測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用序列分析軟件進(jìn)行分析，并在NCBI中進(jìn)行Blast序列比對(duì)。

2.2.3 SBV分子標(biāo)記的驗(yàn)證

取-20℃保存的采自湖北鐘祥市中蜂場(chǎng)的患病幼蟲3～5只，福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)蜂場(chǎng)病群明顯發(fā)病幼蟲3～5只，無癥狀小幼蟲3～5只，3個(gè)上年有發(fā)病但今年未發(fā)病的蜂群各取大幼蟲3～5只，健康蜂群大幼蟲4只，分別放在1.5 mL EP管中進(jìn)行研磨，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，之后以引物SBV106F/R進(jìn)行PCR檢測(cè)。

3 結(jié)果與分析

3.1 SBV106片段的擴(kuò)增

以患病幼蟲cDNA為模板，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增出一條大小約為106 bp的特異性片段（圖1），而以無菌水作為模板的空白對(duì)照，PCR結(jié)果呈陰，說明該分子標(biāo)記可檢測(cè)出患病幼蟲體內(nèi)SBV的存在。

圖1 SBV目的基因的PCR擴(kuò)增

3.2重組質(zhì)粒的酶切鑒定

將藍(lán)白斑篩選出的白色單斑轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的菌液抽提質(zhì)粒，繼而用EcoRⅠ對(duì)其進(jìn)行酶切鑒定，酶切產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示，有3個(gè)重組質(zhì)粒能酶切得到SBV目的片段（圖2），表明SBV目的片段被成功克隆進(jìn)pGEMT載體。

圖2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

3.3目的基因的測(cè)序與分析

將酶切鑒定為陽性的質(zhì)粒對(duì)應(yīng)菌液送生工測(cè)序，利用Research序列處理軟件進(jìn)行序列分析，找出引物序列，確定目的基因片段，測(cè)序結(jié)果表明所克隆的SBV106片段長(zhǎng)度為106 bp（圖3），將該序列與Genbank收錄SBV全序列（收錄號(hào)：AF092924）進(jìn)行比對(duì)，相似度達(dá)100%（圖4），證明該序列為SBV特有序列，可以作為檢測(cè)蜜蜂囊狀幼蟲病的分子標(biāo)記。同時(shí)也說明本研究所檢測(cè)病毒為SBV，可以作為后續(xù)研究的材料。

圖3 SBV106片段測(cè)序結(jié)果

圖4 SBV106片段序列的Blast比對(duì)結(jié)果

3.4 SBV分子標(biāo)記應(yīng)用性檢測(cè)

將蜂場(chǎng)采集的中蜂幼蟲樣品經(jīng)引物SBV106F/R進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示有明顯囊狀幼蟲病癥狀的幼蟲樣品檢測(cè)結(jié)果均呈陽性，發(fā)病蜂群的無癥狀幼蟲檢測(cè)呈陽性，曾發(fā)病蜂群的無癥狀幼蟲部分為陽性，取自從未發(fā)病的健康蜂群的幼蟲檢測(cè)結(jié)果均呈陰性（圖5）。上述結(jié)果說明，應(yīng)用該SBV分子標(biāo)記檢測(cè)蜜蜂幼蟲樣品，能準(zhǔn)確檢測(cè)出患病幼蟲均呈SBV陽性，而在無癥狀幼蟲樣品中，也能檢測(cè)出部分樣品呈SBV陽性。

圖5 不同蜂場(chǎng)中蜂幼蟲樣本的PCR檢測(cè)結(jié)果

4 討論

由于中華蜜蜂病毒多為RNA病毒，純種毒株目前無法獲得，且蜜蜂通常是同時(shí)攜帶多種病毒，難以取得攜帶單一病毒的蟲體，所以本試驗(yàn)中未進(jìn)行該分子標(biāo)記的特異性驗(yàn)證。引物設(shè)計(jì)本身要求特異性，必須在cDNA保守區(qū)內(nèi)，通過測(cè)序以及與數(shù)據(jù)庫中SBV全序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)該分子標(biāo)記克隆基因能達(dá)到100%相似度。并且熒光定量反應(yīng)過程中，如果有非特異性擴(kuò)增，熔解曲線會(huì)出現(xiàn)非特異峰，只有單一峰基本可以確定該分子標(biāo)記的特異性。

由于病蟲樣本有限，故分子標(biāo)記應(yīng)用性所檢測(cè)樣本偏少，可在蜜蜂病毒病爆發(fā)時(shí)進(jìn)一步對(duì)該分子標(biāo)記的應(yīng)用性、特異性進(jìn)行測(cè)定。病群中所有有癥狀幼蟲檢測(cè)結(jié)果呈陽性，且SBV條帶亮度很高，說明幼蟲蛻皮液中含有大量SBV導(dǎo)致其發(fā)病死亡。上年患病群檢測(cè)結(jié)果部分呈陽性、部分呈陰性表明SBV仍然存在于蜂群中部分幼蟲體內(nèi)，呈潛伏狀態(tài)，蜂群并未表現(xiàn)出明顯發(fā)病癥狀。

健康蜂群中蜜蜂幼蟲樣品病毒檢測(cè)結(jié)果呈陰性可能是由于實(shí)驗(yàn)操作上出現(xiàn)問題所致，可用內(nèi)參β-actin驗(yàn)證。如果β-actin條帶呈陽性，說明實(shí)驗(yàn)操作無問題，病毒呈陰性是由于樣品中確實(shí)不含SBV；如果β-actin條帶呈陰性，表明實(shí)驗(yàn)操作有問題，應(yīng)重新提取RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；或是由于樣品本身不含SBV也會(huì)使檢測(cè)結(jié)果呈陰性；也可能是因?yàn)闃悠泛琒BV量極低，達(dá)不到本研究PCR檢測(cè)極限濃度，所以檢測(cè)結(jié)果呈陰性。

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Cloning of a kind of molecular marker for Sacbrood virus

Xiong Cuiling1,Lin Yuewen2,Liang Qin1,Zheng Yanzhen1,Xu Xijian1,Zhang Zhaonan1, Huang Zhijian1,Guo Rui1,Chen Dafu1
(1 College of Bee Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002;2 Longtianyuewen Professional Corporation for Apiculture,Quanzhou 362114)

Sacbrood is a kind of fatal disease for honeybee larvae caused by SBV.In this study,a pair of primers was designed according to genome information of several SBV strains published in GeneBank.A specific fragment about 106 bp was amplified from Apis cerana cerana larvae with obvious symptoms.Subsequently,this SBV106 fragment was cloned into pGEM-T vector,and after blue-white selection,positive plasmids were digested with EcoRⅠand a 106 bp fragment was obtained by agarose gel electrophoresis.The corresponding bacterial solution was sequenced and the result showed SBV106 has a 100%identity with SBV genome(GeneBank accession number:AF092924).These results together suggested SBV106,as a molecular marker for detecting Sacbrood,could be applied to apiculture.

SBV;molecular marker;PCR;clone

國家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-45-KXJ7）、福建農(nóng)林大學(xué)科技發(fā)展資金（KF2015123）、福建省自然科學(xué)基金指導(dǎo)性科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012D079）資助

熊翠玲（1977-），碩士，實(shí)驗(yàn)師，從事蜜蜂病敵害研究

陳大福（1973-），博士，副教授，從事蜜蜂保護(hù)學(xué)研究；郭睿（1987-），博士，講師，從事蜜蜂保護(hù)學(xué)研究