周麗敏，馬文潔，武炳瑾，張德強(qiáng)，楊智全，孫道杰

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

小麥穗突變體 Sda1與其野生型葉片總蛋白雙向電泳體系的建立

周麗敏，馬文潔，武炳瑾，張德強(qiáng)，楊智全，孫道杰

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

為探索適合小麥穗突變體 Sda1葉片蛋白的雙向電泳體系，尋找Sda1與其野生型葉片的差異蛋白，以Sda1與其野生型的抽穗期葉片為材料，從蛋白質(zhì)提取、雙向電泳條件等方面對(duì)適合 Sda1及其野生型葉片蛋白的雙向電泳體系進(jìn)行探索。分析試驗(yàn)得到的雙向電泳圖譜，發(fā)現(xiàn)利用TCA/丙酮提取葉片總蛋白，用pH 4～7的17 cm線性膠條，采用13%濃度的分離膠，上樣量為900 μg，利用改良的等電聚焦程序，能夠得到背景清晰、分辨率高的電泳圖譜；電泳圖譜在低分子區(qū)蛋白點(diǎn)分布均勻，并且重復(fù)性好。利用PDQuest 8.0.1 軟件分析圖譜，得到27個(gè)差異點(diǎn)蛋白，相比于野生型植株， Sda1突變體表現(xiàn)為蛋白表達(dá)量下調(diào)與缺失，發(fā)現(xiàn)6個(gè)缺失蛋白，21個(gè)表達(dá)下調(diào)蛋白。

小麥；穗突變體；葉片；雙向電泳；2-DE圖譜

小麥?zhǔn)侵袊?guó)的主要糧食作物之一，產(chǎn)量性狀的改良是目前小麥遺傳改良的重要方面[1]。對(duì)小麥產(chǎn)量性狀影響較大的是穗部性狀，包括穗粒數(shù)、小穗數(shù)、千粒重等[2]。旗葉是籽粒干物質(zhì)積累的重要來(lái)源[3]，研究小麥穗突變體 Sda1及其野生型葉片的蛋白質(zhì)組學(xué)，對(duì)提升小麥穗粒數(shù)與葉片的“源-庫(kù)”關(guān)系的認(rèn)識(shí)具有重要意義。

蛋白質(zhì)組技術(shù)是后基因組時(shí)代的重要工具，它是在基因表達(dá)水平上對(duì)生命活動(dòng)的本質(zhì)進(jìn)行研究，常利用高分辨蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。雙向電泳技術(shù)(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)作為蛋白質(zhì)分離的重要手段，是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛的一種蛋白分析方法[4-6]。蛋白樣品的成功制備是雙向電泳實(shí)驗(yàn)成功的前提，雙向電泳技術(shù)的難點(diǎn)在于蛋白樣品的提取、等電聚焦(IEF)條件的選擇。關(guān)于小麥幼穗[7]、籽粒谷蛋白[8]、葉片[9]、花藥[10]等蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，在蛋白質(zhì)提取、雙向電泳條件的探索等方面已有大量報(bào)道。TCA/丙酮沉淀法是傳統(tǒng)的蛋白制備方法，但存在蛋白沉淀不完全、復(fù)溶較為困難、無(wú)法完全去除鹽離子等缺陷[9]。而TCA/丙酮沉淀-酚/SDS聯(lián)合抽提法能夠使沉淀中殘留的酚類、脂質(zhì)、色素等次級(jí)代謝物極大的去除[11]。小麥葉片蛋白質(zhì)的提取、分離、鑒定等受小麥葉片中的次級(jí)代謝產(chǎn)物如酚類、多糖、脂質(zhì)、核酸、鹽離子影響，不同品系小麥葉片中的次級(jí)代謝物含量不同。雖然利用TCA/丙酮沉淀法[9]、酚提取-甲醇/醋酸銨沉淀[12]、尿素/硫脲法[12]、TCA/丙酮沉淀-酚/SDS聯(lián)合抽提法[11]，都得到了清晰的雙向電泳圖譜，但由于次級(jí)代謝物的影響，還需根據(jù)不同的小麥品系選擇合適的提取方法。

雙向電泳中的等電聚焦程序是雙向電泳成功與否的另一重要影響因子。前人對(duì)等電聚焦條件的選擇多參照O′Farrell[13]的方法，大多只有主動(dòng)水化(主動(dòng)水化是在低電壓條件下除去樣品中的鹽分，使大分子量蛋白質(zhì)進(jìn)入膠條的過(guò)程，但容易使小分子蛋白部分損失[14]；被動(dòng)水化是在沒(méi)有電壓條件下通過(guò)膠條的吸附使小分子蛋白進(jìn)入膠條，可以有效減少蛋白沉淀，但容易使小分子蛋白到達(dá)等電點(diǎn)而堵塞膠條上的膠孔，大分子的蛋白難以進(jìn)入膠條)。齊婷婷等[15]提出了小麥葉片蛋白的被動(dòng)水化研究，但由于受提取方法的影響，圖譜結(jié)果不是很理想。

小麥葉片雙向電泳第二向SDS-PAGE中的膠濃度多為12%[9-12]，由于蛋白質(zhì)種類以及分子量的不同需要選擇不同的膠濃度，但目前關(guān)于小麥突變體 Sda1的雙向電泳體系還未見(jiàn)報(bào)道。

為了得到蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰、分辨率高的Sda1突變體葉片蛋白2-DE圖譜，本研究從樣品制備、電泳條件中等電聚焦程序、第二向分離膠濃度等方面進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化，以期找到適合該穗突變體葉片的雙向電泳體系，為雙向電泳體系條件的改進(jìn)和優(yōu)化提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材 料

2009年5月在本課題組育種材料中發(fā)現(xiàn)小麥穗部發(fā)育異常的突變體Sda1，該突變體由隱性單基因控制,并且突變性狀只能通過(guò)雜合體自交遺傳[16]。該突變體整體表現(xiàn)為穗小，雄蕊敗育，雌蕊發(fā)育不良且形態(tài)不完整，植株矮，葉片短小細(xì)窄，不易產(chǎn)生種子。 2014年6月份隨機(jī)收獲沒(méi)有發(fā)生突變的植株上的小麥籽粒，當(dāng)年10月份種植于楊凌實(shí)驗(yàn)田中，2015年4月在突變性狀發(fā)生的抽穗期，取穗伸出旗葉葉鞘2 cm的Sda1突變體與其野生型葉片，存放于-80 ℃冰箱備用。

1.2 儀器和試劑

PROTEAN IEF cell等電聚焦系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)，PROTEAN Ⅱ xi Cell垂直電泳系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)，Power Look 2100XL掃描儀(美國(guó)UMAX公司)。pH 4～7線性17 cm IPG干膠條、載體兩性電解質(zhì)(pH4～7)、礦物油均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；Sigma公司的二硫蘇糖醇(DTT)、尿素、硫脲，Sigma公司進(jìn)口分裝的CHAPS、碘乙酰胺；Tris飽和酚、SDS、蔗糖、 β-巰基乙醇、鹽酸、TEMED、丙烯酰胺、N,N′-2甲叉雙丙烯酰胺、甘氨酸、過(guò)硫酸銨(AP)等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 蛋白提取方法

1.3.1 TCA/丙酮沉淀法

蛋白樣品提取參照劉 衛(wèi)等[10]的TCA/丙酮沉淀法，蛋白提取液用2 mL無(wú)酶離心管分裝于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 酚/SDS抽提法

參照李紅兵等[11]的方法，每研磨1 g葉片加入10 mL TCA/丙酮提取液(10% TCA，0.2% DTT)，反復(fù)顛倒混合，-20 ℃沉淀過(guò)夜提取蛋白質(zhì)，4 ℃下16 000 r·min-1離心10 min，棄上清；沉淀用含100 mmol·L-1醋酸銨的80%甲醇溶液洗1次，80%丙酮洗1次，通風(fēng)櫥內(nèi)室溫干燥10 min；加入10 mL酚/SDS抽提液[pH 8.0的Tris飽和酚與SDS(十二烷基硫酸鈉)緩沖液1∶1混合，其中SDS緩沖液成份為：30%蔗糖、 2%SDS、 5%β-巰基乙醇]、0.1 mol·L-1醋酸銨的甲醇溶液，-20 ℃沉淀4 h；4 ℃下16 000 r·min-1離心10 min，棄上清液，沉淀用甲醇洗1次，80%丙酮洗1次，通風(fēng)櫥內(nèi)自然風(fēng)干，按1 mg加入30 μL蛋白質(zhì)裂解液(7 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲，4% CHAPS，65 mmol·L-1DTT， 2% pH 4～7 載體兩性電解質(zhì))通風(fēng)櫥內(nèi)室溫裂解蛋白樣品，至沉淀不再生成為止。16 000 r·min-1離心20 min,取上清液于無(wú)酶離心管中，即為蛋白提取液，用2 mL無(wú)酶離心管分裝于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 等電聚焦電泳

用Bio-Rad 公司的IPGphor 電泳儀進(jìn)行第一向等電聚焦電泳，其中蛋白質(zhì)上樣量約為900 μg，總上樣量體積為 350 μL(pH 4～7，17 cm線性 IPG 預(yù)制膠條)，水化和聚焦的溫度為 20 ℃，聚焦完畢后，膠條先在 5 mL 膠條平衡緩沖液Ⅰ(0.375 mol·L-1的Tris-HCl，pH 8.8，7 mol·L-1尿素，30%甘油，5% SDS，2% DTT)中平衡15 min，再于5 mL膠條平衡緩沖液Ⅱ(2.5%碘乙酰胺替代2% DTT，其余組分同平衡緩沖液Ⅰ)中平衡 15 min，然后進(jìn)行第二向 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用12%和13%兩種濃度的SDS-PAGE分離膠進(jìn)行試驗(yàn)，本研究的改良程序見(jiàn)表1，比經(jīng)典的等電聚焦程序增加了一步被動(dòng)水化和500 V、線性的除鹽過(guò)程。

1.5 2-DE圖譜分析

用Power Look 2100XL掃描儀對(duì)染色、脫色后雙向電泳的凝膠進(jìn)行掃描，分辨率為300 dpi。用PDQuest 8.0.1凝膠圖譜分析軟件對(duì)凝膠中蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的大小、數(shù)目等進(jìn)行配比分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白提取方法的比較

采用TCA/丙酮沉淀法和酚/SDS抽提法兩種方法提取的蛋白樣品，在相同的電泳條件下經(jīng)多次試驗(yàn)均獲得了清晰的雙向電泳圖譜。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，不同的蛋白提取方法獲得的圖譜之間，無(wú)論在質(zhì)量還是蛋白點(diǎn)數(shù)上都存在顯著差異。

TCA/丙酮沉淀法提取的蛋白電泳圖譜(圖1-A)蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)多且蛋白形狀規(guī)則、清晰。酚/SDS抽提法得到的電泳圖譜(圖1-B)較TCA丙酮沉淀法蛋白質(zhì)點(diǎn)明顯變少，尤其在酸性端，蛋白丟失嚴(yán)重，不符合獲得葉片總蛋白這一要求。雖然酚/SDS抽提法在上部高豐度蛋白處能明顯消除干擾的影響，但是蛋白丟失嚴(yán)重，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白質(zhì)。

表1 本實(shí)驗(yàn)改良的等電聚焦電泳程序

Table 1 Procedures of improved isoelectric focusing electrophoresis

程序Procedure電壓Volt/V升壓方式Voltageraisingmethod時(shí)間Time/h主動(dòng)水化Initiativehydration50-2被動(dòng)水化Passivehydration0-2主動(dòng)水化Initiativehydration50-12除鹽Demineralixation250快速Fast1除鹽Demineralixation500線性Liner1除鹽Demineralixation1000快速Fast1升壓Boost8500線性Liner12聚焦Isoelectricfocusing8500快速Fast10保持Maintain500快速Fast任意時(shí)間Anytime

2.2 第二向電泳SDS-PAGE膠濃度的選擇

利用前人的研究結(jié)果[ 9-12]，第二向凝膠電泳采用濃度為12%的凝膠(圖2-A),起始時(shí)用低電流(10 mA·gel-1)，待樣品完全走出 IPG膠條，濃縮成一條線后，再加大電流至恒直流電20 mA·gel-1，待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時(shí)停止電泳。從圖2中發(fā)現(xiàn)12%的分離膠中小分子蛋白未能得到較好的分離，且整體來(lái)看條帶在膠下方；在相同電泳條件下用13%的凝膠進(jìn)行電泳，觀察膠濃度對(duì)蛋白質(zhì)分離效果的影響，發(fā)現(xiàn)在13%的分離膠中, 蛋白條帶清晰且分布均勻(圖2-B)。

2.3 等電聚焦電泳程序的比較

將TCA/丙酮沉淀法提取的 Sda1穗突變體葉片蛋白用17 cm、pH 4～10的線性膠條進(jìn)行雙向電泳，圖3-A為參照G?rg等[17]的方法，同時(shí)添加500 V，線性,1 h的鹽離子去除步驟進(jìn)行的。圖3-B是按表1程序(本實(shí)驗(yàn)改良的等電聚焦電泳程序)進(jìn)行的凝膠電泳圖像。圖3-A雖然得到了清晰的蛋白質(zhì)點(diǎn)，但是蛋白分點(diǎn)較少，圖3-B則得到了較多的小分子量蛋白點(diǎn)，且分離效果較好。

圖1 不同提取方法的凝膠圖

圖2 不同濃度凝膠的2-DE圖譜

圖3 經(jīng)典等電聚焦電泳程序(A)及本研究改良電泳程序(B)的2-DE圖譜

2.4 Sda1突變體與其野生型葉片總蛋白的差異

利用以上得到的適合該突變體的雙向電泳條件，得到 Sda1突變體和野生型的差異蛋白結(jié)果(圖4)，利用PDQuest 8.0.1 軟件分析得到27個(gè)差異點(diǎn)蛋白，其中有21個(gè)蛋白在 Sda1中表達(dá)下調(diào)，6個(gè)表現(xiàn)為缺失。

圖4 Sda1突變體與野生型抽穗期葉片總蛋白2-DE圖譜

3 討 論

3.1 蛋白提取方法的選擇

本研究利用TCA/丙酮沉淀法結(jié)合酚/SDS抽提法制備葉片蛋白樣品，試驗(yàn)結(jié)果蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰、背景清楚、蛋白質(zhì)點(diǎn)分布均勻。但是利用此方法電泳圖譜蛋白質(zhì)點(diǎn)總數(shù)少，尤其在膠圖下端低分子量區(qū)域的蛋白質(zhì)點(diǎn)明顯較少。筆者還同時(shí)利用傳統(tǒng)的TCA/丙酮沉淀法制備蛋白進(jìn)行雙向電泳，圖譜結(jié)果(圖1-A)得到的膠圖點(diǎn)分布均勻、清晰、且橫紋較少。我們分析酚/SDS聯(lián)合抽提法可能在抽提過(guò)程中導(dǎo)致一些小分子蛋白丟失或者一些水溶性蛋白轉(zhuǎn)移到水相中導(dǎo)致蛋白缺失。本研究結(jié)果與劉偉霞等[12]利用酚提取-甲醇/醋酸銨沉淀法得到的小麥葉片圖譜結(jié)果一致。本研究利用傳統(tǒng)TCA/丙酮沉淀法制備蛋白樣品時(shí)，針對(duì)該方法復(fù)溶較為困難，在蛋白樣品制備后立即進(jìn)行濃度測(cè)定定量、上樣進(jìn)行電泳。對(duì)無(wú)法完全去除鹽離子的問(wèn)題，通過(guò)雙向電泳等電聚焦時(shí)第一向增加500 V,線性，1 h的鹽離子去除步驟來(lái)解決，得到比較好的膠圖，蛋白質(zhì)點(diǎn)分布均勻、清晰、且橫紋較少。

3.2 電泳條件的優(yōu)化

3.2.1 等電聚焦(IEF)電泳程序的選擇

適宜的等電聚焦程序能夠使蛋白質(zhì)有效進(jìn)入膠條,進(jìn)而獲得理想的凝膠圖譜。等電聚焦的好壞會(huì)直接影響雙向電泳圖譜的質(zhì)量[12]。等電聚焦過(guò)程是在電泳槽中放有兩性電解質(zhì)并通以直流電，兩性電解質(zhì)形成一個(gè)由陽(yáng)極到陰極逐步增加的pH梯度，蛋白質(zhì)在電流作用下聚焦于與該蛋白質(zhì)點(diǎn)相等等電點(diǎn)和相等pH點(diǎn) 的IPG膠條上。Westermeier[18]發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)與上樣緩沖液混合后，在室溫條件下被動(dòng)水化容易使蛋白降解，在蛋白溶脹過(guò)程中施加低電壓可以使大分子蛋白進(jìn)入膠條。因此合適的等電聚焦程序需根據(jù)組織蛋白特性使主動(dòng)水化與被動(dòng)水化相結(jié)合，使蛋白質(zhì)點(diǎn)在 IPG膠條上被較好的吸收。

本研究首先在低電壓條件50 V, 2 h，使得蛋白樣品移動(dòng)到對(duì)應(yīng)的等電點(diǎn)，再利用0 V,2 h的被動(dòng)水化過(guò)程，使得小分子蛋白得到充分吸收，再在50 V，12 h的主動(dòng)水化條件下使大分子蛋白進(jìn)入膠條。等電聚焦結(jié)果在SDS-PAGE膠上均勻分離，得到較好的電泳圖譜，方便篩選蛋白差異點(diǎn)并進(jìn)行鑒定[12-18]。另外，鹽離子影響蛋白質(zhì)電泳圖譜質(zhì)量[6]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)利用比其他實(shí)驗(yàn)[12，15，18]多一步的除鹽程序并且采取逐步升壓的方式，所得到的兩張膠圖中的豎條紋干擾較少，分辨率高。并且圖3B較圖3A的蛋白質(zhì)點(diǎn)多，證明被動(dòng)水化使得蛋白分子能夠被充分吸收。

3.2.2 雙向電泳不同膠濃度的選擇

分離膠把經(jīng)過(guò)第一向等電聚焦到IPG膠條中的蛋白在SDS-PAGE膠中按蛋白分子大小分離出來(lái)，實(shí)驗(yàn)中要根據(jù)不同的植物組織選擇不同的膠濃度。本試驗(yàn)先采用前人小麥葉片蛋白雙向電泳[11,19]采用的12%分離膠，因膠分子之間孔隙較大，小分子蛋白容易透過(guò)膠之間的孔隙，不易分離。本實(shí)驗(yàn)后又采用13%的SDS-PAGE膠，增加了低分子量區(qū)的分離效果，2-DE圖譜效果較好，可以避免蛋白丟失導(dǎo)致的結(jié)果不準(zhǔn)確。因此，針對(duì)不同的蛋白樣品應(yīng)選擇不同的分離膠濃度。

3.3 小麥穗突變體 Sda1與其野生型的差異

Sda1突變體較其野生型整體表現(xiàn)雄蕊敗育，穗小、雌蕊發(fā)育不良并且形態(tài)不完整，植株矮、葉片窄小、不易產(chǎn)生種子，這些性狀表現(xiàn)可能與相關(guān)蛋白的表達(dá)下調(diào)或缺失有關(guān)。

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Establishment of Two-Dimensional Electrophoresis System for the Total Leaf Proteins Separation in the Spike Mutant Sda1 and Its Wild-Type

ZHOU Limin,MA Wenjie,WU Bingjin,ZHANG Deqiang,YANG Zhiquan,SUN Daojie

(Agronomy College,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China)

In order to explore suitable 2-DE(two-dimensional electrophoresis) system for Sda1(spike development atrophy 1) leaf protein to screen differential protein expression between Sda1 and its wildlife type in wheat(Triticum).The protein extraction method and two-dimensional electrophoresis conditions were studied. A clear background, well distributed protein spots and reproducible 2-DE maps can be obtained by using the TCA/acetone protein extraction method, with 13% separation gel, a sample amount of 900 μg, the linear strip 17 cm immobilized pH gradient(IPG) strip pH 4 to 7, modified isoelectric focusing(IEF) process, and modified Coomassie Brilliant Blue for staining. Using this optimized 2-DE system, some differential protein spots between Sda1 and its wildlife-type were found. Compared with its wildlife-type,21 spots were down-expressed, and six spots were not expressed in Sda1.

Wheat；Spike mutants；Leaf；Two-dimensional electrophoresis; 2-DE map

麥類作物學(xué)報(bào) 2016，36(12)：1629?1634JournalofTriticeaeCropsdoi：10．7606/j．issn．1009?1041．2016．12．12

時(shí)間：2016-12-07

2016-06-12

2016-07-25

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2014CB138100)；陜西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015JM3094)；陜西省重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2014KCT-25) 第一作者E-mail：mizhouzai8866@126.com

孫道杰(E-mail:chinawheat@hotmail.com)

S512.1；S330

A

1009-1041(2016)12-1623-06

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