徐 蕾， 胡海燕， 王丹丹， 戚菲菲， 曾 勝， 劉 靜， 劉北星

(中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110122)

Th2型γδ T細(xì)胞參與急性RSV感染所誘發(fā)的氣道炎癥反應(yīng)

徐 蕾， 胡海燕， 王丹丹， 戚菲菲， 曾 勝， 劉 靜， 劉北星*

(中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110122)

γδ T細(xì)胞是機(jī)體重要的固有免疫細(xì)胞，參與肺組織炎性病變及哮喘的發(fā)生發(fā)展。但迄今為止，γδ T細(xì)胞在呼吸道合胞病毒感染所誘發(fā)的氣道炎癥反應(yīng)中的作用尚不十分清楚。研究通過建立RSV急性感染的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，采用HE染色、Real-timeRT-PCR、流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)方法，旨在揭示γδT細(xì)胞在感染性氣道炎癥發(fā)生中的作用及其相關(guān)作用機(jī)制。結(jié)果顯示，RSV感染導(dǎo)致BALA/c鼠肺炎性細(xì)胞浸潤，其中嗜酸性粒細(xì)胞增加明顯；同時(shí)肺組織局部Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-13 mRNA表達(dá)升高；RSV感染后，肺組織γδT細(xì)胞總數(shù)，特別是活化的CD69+γδT細(xì)胞數(shù)量顯著增加，其中分泌Th2型細(xì)胞因子IL-4和IL-13的γδT細(xì)胞數(shù)量增加明顯，而分泌Th1型細(xì)胞因子IFN-γ的γδT細(xì)胞數(shù)量顯著減少，證實(shí)γδ T細(xì)胞通過分泌Th2型細(xì)胞因子介導(dǎo)RSV感染誘發(fā)的氣道炎癥反應(yīng)。

γδ T細(xì)胞；呼吸道合胞病毒；氣道炎癥；哮喘

哮喘是以Th2優(yōu)勢應(yīng)答為主的，以氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性為主要特征的呼吸道疾病[1-2]。諸多因素影響哮喘的發(fā)生發(fā)展，其中病毒感染尤其是呼吸道合胞病毒感染是誘發(fā)和加重哮喘的主要原因[3]。呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)是秋冬季節(jié)引起嬰幼兒毛細(xì)支氣管炎和肺炎的主要病原體。研究發(fā)現(xiàn)，嬰幼兒期嚴(yán)重RSV感染與兒童期哮喘及過敏癥密切相關(guān)[4]。RSV毛細(xì)支氣管炎患兒外周血中Th2型細(xì)胞因子如IL-4以及總IgE水平明顯升高, 而Th1型細(xì)胞因子IFN-γ水平有所下降，提示RSV感染可能通過誘導(dǎo)Th2優(yōu)勢應(yīng)答影響哮喘的發(fā)生發(fā)展[5]。廣泛分布于皮膚黏膜系統(tǒng)的γδ T細(xì)胞是機(jī)體重要的固有免疫細(xì)胞之一。呼吸道黏膜系統(tǒng)的γδT細(xì)胞位于免疫防御的第一道防線，在呼吸道黏膜局部抗感染免疫及免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用。γδT細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞和調(diào)節(jié)細(xì)胞影響感染及過敏性炎癥反應(yīng)的發(fā)生過程[6]。Aoyagi等[7]發(fā)現(xiàn)RSV嚴(yán)重毛細(xì)支氣管炎患兒外周血中IFN-γ分泌型γδT細(xì)胞數(shù)量明顯減少，并伴隨感染早期Th2型細(xì)胞因子水平的上升。我們前期研究工作亦發(fā)現(xiàn)，致敏前RSV感染明顯降低致敏鼠肺組織γδT細(xì)胞數(shù)量，降低肺組織Th2型細(xì)胞因子水平，提示γδT細(xì)胞可能在肺組織炎性病變及喘息發(fā)作方面發(fā)揮重要作用[8]。為進(jìn)一步明確RSV感染所誘發(fā)的氣道炎癥反應(yīng)過程中γδ T細(xì)胞的作用, 本研究利用RSV急性感染BALB/c鼠模型，通過HE染色、Real-time RT-PCR、流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，探討在RSV感染導(dǎo)致BALB/c鼠氣道炎癥的發(fā)展過程中，γδT細(xì)胞可能作為效應(yīng)細(xì)胞和調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)揮重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡雌性BALB/c鼠，購自北京華阜康生物科技股份有限公司,在中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級動(dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)。

1.1.2 病毒 人類呼吸道合胞病毒A2 型(RSV A2)，Hep-2細(xì)胞增殖病毒，30%蔗糖超速離心法分離病毒粒子，-80 ℃冰箱保存。病毒滴度用組織細(xì)胞半數(shù)感染量50% (50% tissue culture infections dose, TCID50)表示。

1.1.3 試劑 RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購自TAKARA公司。小鼠流式檢測抗體FITC-anti-TCRγδmAb、APC-anti-CD3 mAb、PEcy7-anti-CD69 mAb及PE標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體(IFN-γ、IL-4、IL-13)購自Biolenged公司。

1.2 方法

1.2.1 RSV感染 小鼠給予水合氯醛麻醉后，經(jīng)鼻黏膜感染20 μL含2×106TCID50RSV的病毒懸液，感染后第4天收集實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.2.2 肺組織病理標(biāo)本制作及染色 感染后第4天的小鼠肺組織浸泡于4%多聚甲醛中固定，隨后經(jīng)過石蠟包埋、切片后進(jìn)行HE染色分析小鼠肺組織炎癥反應(yīng)。

1.2.3 Real-timeRT-PCR技術(shù)檢測細(xì)胞因子mRNA的表達(dá) 用RNAisoplus試劑盒提取細(xì)胞總RNA，PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明，采用Real-time RT-PCR技術(shù)檢測肺組織局部Th1型細(xì)胞因子IFN-γ和Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-13的mRNA表達(dá)水平。引物設(shè)計(jì)：IFN-γ-F,5′-TATCTGGAGGAACTGGCAAA-3′, IFN-γ-R, 5′-GGTGTGATTCAATGACGCTT-3′;IL-13-F, 5′-AGCATGGTATGGAGTGTGGA-3′, IL-13-R,5′-TTGCAATTGGAGATGTTGGT-3′;IL-4-F, 5′-TGTACCAGGAGCCATATCCA-3′,IL-4-R,5′-TTCTTCGTTGCTGTGAGGAC-3′;β-actin-F, 5′-CAACGAGCGGTTCCGATG-3′, β-actin-R, 5′-GCCACAGGATTCCATACCCA-3′。在ABI 7500系統(tǒng)下進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。結(jié)果采用2-ΔΔCT(fold change)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4 小鼠肺組織單細(xì)胞懸液制備 取小鼠肺組織并剪碎，用10 mL含有collagenaseD (200 μg/mL)和DNAseⅠ(40 μg/mL)的10%FBSvRPMI1640重懸組織塊，在37 ℃水平搖床上孵育90 min。300目鋼網(wǎng)過濾經(jīng)酶消化后的肺組織，收集細(xì)胞懸液并用淋巴細(xì)胞分離液分離，RPMI1640調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL用于熒光抗體染色。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面分子 向細(xì)胞懸液中加入封閉抗體CD16/CD32(ebioscience)，4 ℃避光孵育15 min；2%FBS-PBS洗滌1次后進(jìn)行表面染色，加入FITC-anti-TCRγδmAb、APC-anti-CD3mAb及PEcy7-anti-CD69 mAb(Biolenged)，4 ℃避光孵育30 min；2%FBS-PBS洗滌1次，300 μL 2%FBS-PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子 細(xì)胞經(jīng)表面染色后，2%FBS-PBS洗滌1次；向細(xì)胞懸液中加入2 μL/mL的Cell Activation Cocktail(Biolenged)37 ℃溫箱孵育1 h后，加入2 μmol/L蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑(Monensin)，繼續(xù)孵育4 h；2%FBS-PBS洗滌2次，加入250 μL Fixation and Permeabilization Solution(BD)，4 ℃避光孵育20 min；Perm/Wash Buffer(BD)和2%FBS-PBS洗滌后，加入PE標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體(IFN-γ、IL-4、IL-13)或同種型抗體，4 ℃避光孵育30 min；2% FBS-PBS洗滌2次， 300 μL 2%

FBS-PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 RSV感染誘發(fā)BALB/c鼠急性氣道炎癥

用RSV經(jīng)鼻感染BALB/c鼠，感染后第4天取肺組織，HE染色發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，RSV感染鼠肺組織細(xì)支氣管周圍明顯出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(圖1)。肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞總數(shù)明顯增加，其中以嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞數(shù)量增加尤為顯著(圖2)，提示經(jīng)鼻感染RSV可誘導(dǎo)BALB/c鼠氣道炎癥應(yīng)答。

圖1 RSV感染導(dǎo)致BALB/c小鼠肺組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤Fig.1 Infection with RSV resulted in a massive inflammation in the lungs of BALB/c mice

圖2 RSV感染對BALB/c小鼠肺泡灌洗液 中炎性細(xì)胞數(shù)量的影響Fig.2 Infection with RSV influence the number of inflammatory cells in the bronchoalveolar lavage fluids of BALB/c mice *P<0.05，**P<0.01,***P<0.001，下圖同 *P<0.05，**P<0.01,***P<0.001，the following figure with

2.2 RSV感染增強(qiáng)BALB/c鼠肺組織局部Th2型細(xì)胞因子mRNA表達(dá)

Real-timeRT-PCR技術(shù)檢測小鼠肺組織Th1/Th2型細(xì)胞因子mRNA表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RSV感染不僅能增強(qiáng)肺組織局部Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-13 mRNA的表達(dá)，Th1型細(xì)胞因子IFN-γ水平與對照組相比亦有所升高。推測本研究中升高的干擾素可能參與機(jī)體對RSV病毒的抑制和清除，介導(dǎo)機(jī)體的抗感染免疫(圖3)。

2.3 RSV感染增加小鼠肺組織局部γδ T細(xì)胞總數(shù)及活化的γδ T細(xì)胞數(shù)量

在對RSV感染與過敏性哮喘相關(guān)性的研究中發(fā)現(xiàn)，致敏前感染RSV可能通過影響γδ T細(xì)胞的活性，進(jìn)而影響哮喘的發(fā)展進(jìn)程[8]。為進(jìn)一步證實(shí)RSV感染對肺組織局部γδ T細(xì)胞的影響，分離了小鼠肺組織淋巴細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠肺組織γδ T細(xì)胞總數(shù)及其活化的γδ T細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果顯示，RSV感染導(dǎo)致肺組織局部γδ T細(xì)胞總數(shù)以及活化γδ T細(xì)胞(細(xì)胞表面標(biāo)記為CD69+γδ T細(xì)胞)的百分比和細(xì)胞數(shù)均明顯增加，提示RSV感染通過影響γδ T細(xì)胞的數(shù)量和活性左右氣道炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展(圖4)。

圖3 RSV感染影響B(tài)ALB/c鼠肺組織局部細(xì)胞因子mRNA表達(dá)Fig.3 Infection with RSV influence the expression of cytokine mRNA in the lungs of BALB/c mice

圖4 RSV感染增加小鼠肺細(xì)胞中γδ T細(xì)胞總數(shù)及活化γδ T細(xì)胞數(shù)量Fig.4 RSV infection increased the number of γδ T cells as well as CD69+ γδ T cells in the lungs of miceA：肺組織γδ T細(xì)胞總數(shù)；B:肺組織CD69+ γδ T細(xì)胞數(shù)量；C:肺組織CD69+ γδ T細(xì)胞流式散點(diǎn)圖A：γδ T cellsin the lungs; B:CD69+ γδ T cellsin the lungs;C:representative flow cytometry plots for CD69+ γδ T cells

2.4 RSV感染增加小鼠肺組織內(nèi)Th2型γδ T細(xì)胞數(shù)量

流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子，分析小鼠肺組織局部Th1/Th2型γδ T細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分泌Th2型細(xì)胞因子的γδ T細(xì)胞，如IL-13+γδ T細(xì)胞、IL-4+γδ T細(xì)胞數(shù)量在感染后明顯增加。然而，分泌Th1型細(xì)胞因子的γδ T細(xì)胞，如IFN-γ+γδ T細(xì)胞數(shù)量卻顯著降低(圖5)。Th2型細(xì)胞因子IL-4與IL-5可以協(xié)同誘導(dǎo)嗜酸性細(xì)胞的活化與分化，增加血清中IgE含量，誘發(fā)實(shí)驗(yàn)鼠氣道炎癥，導(dǎo)致Th2樣反應(yīng)[9-10]。結(jié)果顯示，分泌Th2型細(xì)胞因子的γδ T細(xì)胞在RSV感染誘發(fā)的氣道炎癥中發(fā)揮重要作用。

圖5 RSV感染影響小鼠肺組織局部Th1/Th2型γδ T細(xì)胞數(shù)量Fig.5 Infection with RSV influence the number ofTh1/Th2-associated γδ T cells in the lungs of miceA：肺組織IL-13+ γδ T細(xì)胞數(shù)量；B:肺組織IL-4+ γδ T細(xì)胞數(shù)量；C:肺組織IFN-γ+ γδ T細(xì)胞數(shù)量；D:分泌IL-4、IL-13和IFN-γ的γδT細(xì)胞的流式散點(diǎn)圖A：IL-13+ γδ T cells in the lungs; B:IL-4+ γδ T cells in the lungs;C:IFN-γ+ γδ T cells in the lungs;D:representative flow cytometry plots demonstrating IL-13、IL-4 and IFN-γ expression by γδ T cells

3 討 論

過敏性哮喘是與Th2型免疫應(yīng)答密切相關(guān)的氣道炎癥性病變，表現(xiàn)為嗜酸性粒細(xì)胞肺組織浸潤，Thl/Th2型細(xì)胞因子比例失衡和氣道高反應(yīng)性等[11]。病毒感染影響過敏原致敏及哮喘的發(fā)生。引起嬰幼兒毛細(xì)支氣管炎和肺炎的主要病原體呼吸道合胞病毒，可導(dǎo)致感染患兒出現(xiàn)喘鳴，氣道堵塞等哮喘樣臨床病癥，故RSV感染與支氣管哮喘相關(guān)性研究受到普遍重視。大量的研究證實(shí)RSV感染與Th1和Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子比例失衡有關(guān)。有研究顯示，RSV感染時(shí)外周血Th2細(xì)胞亞群增加,伴隨IL-4水平輕微增加；IL-5和IL-10水平明顯增高，而Th1細(xì)胞亞群及IFN-γ顯著下降[5,12]。

作為固有免疫細(xì)胞，γδ T細(xì)胞是影響機(jī)體Thl/Th2均衡性的重要因素之一。γδ T細(xì)胞在接受抗原刺激后，可以分泌多種細(xì)胞因子，包括Th1型細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ；Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13[13-14]。在抗感染免疫的初次應(yīng)答中，γδ T細(xì)胞可因抗原性質(zhì)的不同而分泌不同類型的細(xì)胞因子，進(jìn)而調(diào)控免疫應(yīng)答的類型。流式細(xì)胞術(shù)分析證實(shí)過敏性哮喘患者痰細(xì)胞中γδ T細(xì)胞比例明顯升高，并表達(dá)高水平的細(xì)胞因子IL-4和IL-10[15]。有研究表明，去除γδ T細(xì)胞的哮喘模型鼠肺泡灌洗液中Th2型細(xì)胞因子IL-13水平下降，IL-10水平明顯升高，氣道反應(yīng)性亦明顯下降[16]，提示γδ T細(xì)胞在氣道變態(tài)炎癥反應(yīng)過程中不可忽視的生物學(xué)作用。我們研究結(jié)果顯示，RSV感染鼠支氣管周圍炎性細(xì)胞浸潤增加，尤其是嗜酸性粒細(xì)胞，并伴隨肺組織γδ T細(xì)胞總數(shù)及CD69+γδ T細(xì)胞增加。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子，其中IL-4、IL-13分泌型γδ T細(xì)胞數(shù)量顯著增加，同時(shí)IFN-γ分泌型γδ T細(xì)胞數(shù)量明顯減少，提示γδ T細(xì)胞通過分泌Th2型細(xì)胞因子參與RSV感染誘發(fā)的氣道炎癥反應(yīng)。

本研究利用Real-time RT-PCR、流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，證實(shí)RSV感染過程中，分泌Th2型細(xì)胞因子的γδ T細(xì)胞水平明顯增高，提示某些固有免疫細(xì)胞可能在RSV感染誘發(fā)的氣道炎癥應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。

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Airway Inflammation Reaction Induced by Acute Respiratory Syncytial Virus (RSV) Infection Participated with Th2-γδ T Cells

XU Lei, HU Hai-yan, WANG Dan-dan, QI Fei-fei, ZENG Sheng, LIU Jing, LIU Bei-xing

(Teach. &Res.Div.ofImmunol.,Schl.ofBasicMed.Sci.,ChinaMed.Uni.,Shenyang110122)

γδ T cells are important innate immune cells in organism, they participate pulmonary inflammatory pathology and the occurrence and development of asthma. However, the effect of γδ T cells on respiratory syncytial virus (RSV)-induced airway inflammation remains unknown so far. In present study, through the establishment of an experimental animal model with acute RSV infection and the adoption of HE staining, RT-PCR, as well as flow cytometry and other methods were used aiming at the revealing the role of γδ T cells in the infective airway inflammation and related effective mechanism. The results showed that RSV infection caused BALA/c mice pneumonic cells infiltration, of them acidophilic granulocyte significantly increased; at the same time the expression of local Th2 cytokine IL-4, IL-13mRNA of pulmonary tissue raised; after RSV infection, total number of γδ T cells of pulmonary tissue, particularly the amount of the activated CD69+γδ T cells obviously increased, of them the amount of γδ T cells that secrete Th2 cytokine IL-4 and IL-13 increased significantly, however, the amount of γδ T cells that secrete Th1 cytokine IFN-γ decreased significantly, and proved that γδ T cells mediately induced RSV to infect the airway inflammation reaction through the secretion of Th2 cytokine.

γδ T cells; respiratory syncytial virus (RSV); airway inflammation; asthma

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81273239/H1005)

徐蕾 女，碩士研究生。主要從事病毒與哮喘研究。E-mail:xuleispace@126.com

* 通訊作者。女，教授，博士生導(dǎo)師。主要從事病毒與哮喘方面的研究。E-mail:bxliu@mail.cmu.edu.cn

2015-09-10；

2015-11-16

Q939.93;R392

A

1005-7021(2016)05-0032-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.05.006