李允江 ，孫琳 ，畢云生 ， 張淑瑜，于燕莉*

(1.山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東 濟南 250035；2.濟南軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，山東 濟南 250031)

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【藥理與毒理】

復方葛根片對衰老大鼠胸主動脈損傷的保護作用

李允江1，孫琳1，畢云生2， 張淑瑜2，于燕莉2*

(1.山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東 濟南 250035；2.濟南軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，山東 濟南 250031)

為研究復方葛根片對D-半乳糖致大鼠衰老后血清中同型半胱氨酸(Hcy)水平的影響及胸主動脈損傷的保護作用，將大鼠分為模型組，正常組，復方葛根片高、中、低劑量組。采用皮下注射D-半乳糖的方法制備大鼠衰老模型，運用AU5800全自動生化儀測定血清中Hcy的含量，運用SPSS16分析各Hcy含量和體重差異。對大鼠胸主動脈進行HE染色，在光鏡下觀察血管的組織病理學病變。研究結(jié)果表明，模型組與正常組以及各給藥組與模型組的Hcy水平、體重均存在顯著性差異(P<0.01))。復方葛根片各劑量組對胸主動脈血管具有不同程度的保護作用，高劑量組的保護作用最明顯。 研究認為復方葛根片能降低D-半乳糖致衰老大鼠血清中Hcy水平，并對胸主動脈的血管損傷具有保護作用。

D-半乳糖 ；同型半胱氨酸；老齡鼠

根據(jù)2011年中國第六次人口普查結(jié)果預計，至2037年我國老齡化人口將突破4億[1]。心腦血管疾病是威脅老年人口健康的重要疾病之一，在造成老年人死亡的疾病中占首位。Ungvari等[2]發(fā)現(xiàn)65～74 周歲的老年人中，因心腦血管疾病死亡的人數(shù)占總死亡人數(shù)的 40%；而在年齡大于等于 85 歲的人群中，這一比例升至約 60%。Wald等[3]研究發(fā)現(xiàn)血漿中的同型半胱氨酸(Hcy)含量與心血管疾病的發(fā)生成正相關(guān)，還有很多學者的研究結(jié)果都證實了Hcy是獨立的心腦血管疾病風險的預測因子。

D-半乳糖衰老動物模型是一種比較成熟的衰老動物模型，該造模方法相比于其他幾種衰老模型得到的結(jié)果更加穩(wěn)定。秦紅兵等[4]研究發(fā)現(xiàn)D-半乳糖建立亞急性衰老模型可使小鼠記憶功能下降、氧自由基產(chǎn)物增加、抗氧化能力和免疫功能降低，認為此模型可用于行為學、抗氧化以及免疫等方面的抗衰老藥效研究。本課題組的前期研究也已經(jīng)顯示，D-半乳糖能夠升高衰老大鼠血清中Hcy的水平。課題組前期的實驗結(jié)果表明復方葛根片(濟南軍區(qū)總醫(yī)院的院內(nèi)制劑)具有良好的抗衰老作用，但其對血管的作用尚未見報道。本實驗將采用D-半乳糖誘導的大鼠衰老模型，研究復方葛根片對胸主動脈損傷以及血清Hcy水平的影響，以期揭示其抗衰老作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物

無特定病原體級實驗用雄性Wistar大鼠50只，體重160～180 g，購自山東大學實驗動物中心(許可證號SCXK(魯)2013-0009)，飼養(yǎng)在濟南軍區(qū)總醫(yī)院實驗動物中心。

1.2 儀器及試藥

精密電子天平(JA3003)，上海精科儀器公司；醫(yī)用低速離心機(B600A)，北京白洋醫(yī)用離心機有限公司；D-半乳糖(15121101)，張家港市思普生化有限公司；全自動生化分析儀(AU5800)，美國貝克曼庫爾特公司；水合氯醛(10%，批號：20151023)，濟南軍區(qū)總醫(yī)院制劑室；復方葛根片(0.4 克/片，相等于含生藥材0.3 g，批號：20151026)，濟南軍區(qū)總醫(yī)院制劑室，多聚甲醛溶液(自配);Tissue-TEK全自動組織脫水機，德國MEDITE公司; Tissue-TEK全自動染色機，德國MEDITE公司；Hcy測定試劑盒(批號：2016040016)，浙江東甌診斷產(chǎn)品有限公司。

2 方法

2.1 分組及給藥

Wistar大鼠按體重隨機分成5個組，即正常組、模型組、復方葛根片高劑量組(簡稱高劑量組)、復方葛根片中劑量組(簡稱中劑量組)和復方葛根片低劑量組(簡稱低劑量組)，每組10只。每組每天正常喂食、喂水；模型組、高劑量組、中劑量組和低劑量組每天定時腹腔注射D-半乳糖150 mg/kg，正常組注射同樣體積的生理鹽水，按照體重每100 g注射1 mL的量進行操作。根據(jù)藥理實驗方法學中的折算系數(shù)(0.018)確定灌胃劑量，高劑量組、中劑量組和低劑量組按照和人的等效劑量(中劑量)2.26 g/d用灌胃器每天定時灌胃給藥，灌胃前對大鼠禁食禁水2 h，確保空腹給藥。正常組根據(jù)各大鼠體重按照每100 g注射1 mL的劑量進行蒸餾水灌胃。以周為單位測量各組體重，根據(jù)體重對相應的給藥劑量進行調(diào)整。直至給藥7周后結(jié)束。

2.2 指標的檢測

給藥全部結(jié)束后，禁食不禁水12 h，腹腔注射水合氯醛，用5 mL真空采血管經(jīng)腹主靜脈取血，輕微晃動使充分混合后靜置片刻于低溫離心機中3 000 r/min離心分離血清，并置于eppendoff管中，保存在-80 ℃的超低溫冰箱中備用。取血后快速剪下胸主動脈，用生理鹽水洗去殘留的血液。用眼科手術(shù)剪去除血管外圍的脂肪組織，然后用足量的多聚甲醛溶液進行固定并保存。取200 μL血清(足量)，置于全自動生化分析儀中檢測Hcy的含量；用全自動脫水機對血管組織進行脫水，固定包埋，進而用全自動染色機進行HE染色。顯微鏡下觀察血管的組織病理切片，分析藥物對大鼠胸主動脈的影響。

2.3 統(tǒng)計方法學

用統(tǒng)計學軟件SPSS16對大鼠血清中Hcy的水平、體重進行單因素方差分析，表格數(shù)據(jù)按照x±s的形式表示，比較各組Hcy水平、體重的差異，按照P<0.05的標準定義差異是否顯著。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般情況差異性

正常組大鼠毛色順滑白亮，精神矍鑠；模型組精神萎靡，毛色粗糙，呈現(xiàn)出輕微的黃色，脊背高高彎起。各給藥組精神狀態(tài)良好，但毛色不是特別白凈光滑，給藥組之間精神狀態(tài)差異不顯著。各組給藥前的體重均無顯著性差異(P>0.01)，提示隨機分組成功；各給藥組大鼠體重用藥后比用藥前均顯著增加(P<0.01)，但體重增加量正常組大于高劑量組大于中劑量組大于低劑量組大于模型組。用藥后正常組體重與模型組相比顯著提高，有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；復方葛根片各給藥組與模型組相比，大鼠體重顯著提高，有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。體重結(jié)果提示D-半乳糖能降低大鼠體重增長的速度，復方葛根片能降低D-半乳糖對大鼠體重增長的抑制作用。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠用藥前后體重的差異(x±s)Table 1 Body weight differences of rats before and after drugs

3.2 大鼠血清Hcy的水平

經(jīng)SPSS分析，Hcy水平的方差不齊(P=0.048<0.05)。模型組與對照相比，Hcy水平顯著升高，有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，提示模型制作成功；高、中、低3個劑量組與模型組相比，Hcy水平均顯著降低，有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，提示復方葛根片能明顯降低衰老大鼠血清中Hcy的水平。但各給藥組與正常組相比均有顯著性差異(P<0.01)，說明高、中、低3劑量組均不能使Hcy水平降至正常水平。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠Hcy的水平(x±s)Table 2 Hcy level of each rat group (x±s)

3.3 大鼠胸主動脈血管組織病理學檢測結(jié)果

如圖1所示，模型組的胸主動脈在鏡下可以發(fā)現(xiàn)血管管腔不規(guī)則，局部血管內(nèi)膜水腫并伴有炎細胞浸潤，局部內(nèi)皮細胞腫脹，內(nèi)膜增厚，局部內(nèi)皮細胞脫失，血管組織及平滑肌增生。正常組血管管腔規(guī)則，內(nèi)皮細胞未見腫脹，內(nèi)膜光滑，未見脂質(zhì)沉淀，血管內(nèi)膜、中膜以及血管壁未見纖維組織及平滑肌增生，無炎性細胞浸潤。低劑量組血管管腔不規(guī)則，管腔內(nèi)輕度浸潤，血管內(nèi)皮細胞雖未脫落但出現(xiàn)水腫，血管內(nèi)膜及血管壁無明顯水腫及炎性細胞浸潤。中劑量組的動脈血管未見明顯狹窄，內(nèi)膜及管壁未見水腫及增生肥厚，無脂質(zhì)沉淀，局部內(nèi)皮細胞輕度水腫。高劑量組血管管腔較規(guī)則，內(nèi)皮細胞未見水腫，血管內(nèi)膜無脂質(zhì)沉淀，血管壁未見明顯纖維組織及平滑肌增生，無炎性細胞浸潤。

圖1 大鼠胸主動脈血管組織病理學檢測結(jié)果(×100，HE)Fig.1 Histopathological examination results of rat thoracic aorta (×100, HE)

4 討論

心腦血管疾病是我國死亡率最高的疾病，在老年人中表現(xiàn)的最為突出，并且目前增長速度依然很快。同時，心腦血管疾病多是從血管病變上開始，所以有效防治血管老化對于預防和治療心腦血管疾病具有重要意義。

Vigen等[5]研究發(fā)現(xiàn)血管功能障礙與衰老相關(guān)疾病的關(guān)系密切。從血管入手研究延緩衰老是一種捷徑。Hcy是人體生命活動代謝的正常產(chǎn)物，當人們食用含蛋氨酸的蛋白質(zhì)后，就會通過體內(nèi)的蛋氨酸代謝途徑生成，是谷胱甘肽以及S-AMe生成的中間產(chǎn)物。其中S-AME是人體內(nèi)良好的甲基供體，是一種不可或缺的生命物質(zhì)，能夠保證體內(nèi)的生化反應按照正確而有效的方式進行。也就是說食用的蛋氨酸先轉(zhuǎn)換為同型半胱氨酸，再經(jīng)過一系列的生化反應轉(zhuǎn)化為谷胱甘肽和S-AMe。但是一旦機體由于種種原因而缺乏維生素B族的一些元素、葉酸，以及個別金屬元素比如鋅等，就會使生化反應的某些環(huán)節(jié)因缺少反應物而無法完成正常的轉(zhuǎn)化過程，同型半胱氨酸的利用減少，會使體內(nèi)同型半胱氨酸含量升高，而生成谷胱甘肽和S-腺苷蛋氨酸的途徑受阻，二者在體內(nèi)的含量因此而降低。鮑溪荷等[6]研究發(fā)現(xiàn)甲鈷胺可能通過降低循環(huán) Hcy 水平降低 T2DM患者尿 MCP-1、TGF-β1 排泄，進而減輕腎臟局部增強的炎癥反應。楊安寧等[7]研究發(fā)現(xiàn)Hcy可能影響了甲硫氨酸循環(huán)中 DNMTs 的活性，導致 AS相關(guān)基因發(fā)生 DNA 甲基化改變，進而引起泡沫細胞形成過程中膽固醇代謝紊亂。Boushey等[8]發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)的Hcy水平每升高5 μmol/L,患冠心病的風險將會增高70%,患腦血管病的風險也會增高50%，可見高Hcy水平的危險性非常高。孫衛(wèi)華等[9]研究發(fā)現(xiàn)降低 Hcy濃度有益于延緩糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。目前，常用葉酸、維生素B12、維生素B6以及含其有效成分的藥物降低Hcy水平。然而葉酸雖可通過降低Hcy的水平來減少發(fā)生心腦血管疾病的可能性，但是一旦病人患有了心腦血管疾病，服用葉酸卻不能治愈疾病。Loscalzo[10]研究發(fā)現(xiàn)Hcy可通過介導血管平滑肌細胞的增殖以及基質(zhì)形成,從而產(chǎn)生有害作用。付偉光等[11]研究發(fā)現(xiàn)動態(tài)監(jiān)測冠心病患者 Hcy等水平的變化，有助于了解冠心病病程發(fā)展，預測冠心病病變的嚴重程度，指導臨床合理用藥。Xu 等[12]在用一定濃度的同型半胱氨酸誘導血管內(nèi)皮細胞衰老的實驗過程中，發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)粘附分子1 以及PAI-1 在血管內(nèi)產(chǎn)生，而這兩種物質(zhì)是動脈血管發(fā)生病變的初始物質(zhì)，說明Hcy能夠誘導這兩種物質(zhì)的產(chǎn)生和釋放，能夠誘導血管的動脈硬化的發(fā)生。Jia等[13]研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病血管病并發(fā)癥中，Hcy可損傷血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)，從而影響血管的功能。于燕莉等[14]研究發(fā)現(xiàn)復方葛根片能夠降低D-半乳糖致衰老大鼠模型引起的氧化應激反應，而Gonzalez等[15]研究發(fā)現(xiàn)氧化應激反應能夠誘導胰島素受體信號通路，從而降低衰老器官的自噬反應。而自噬反應可以清除體內(nèi)在蛋白質(zhì)合成過程中產(chǎn)生的錯誤蛋白等物質(zhì)，起到保護血管的作用。這可能是復方葛根片延緩衰老的一條作用途徑，但具體機制和其他作用途徑還有待進一步研究。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)復方葛根片能夠降低衰老大鼠Hcy的水平，并且呈現(xiàn)出了一定的量效關(guān)系，血管的組織病理切片顯示復方葛根片對血管的結(jié)構(gòu)具有一定的保護作用。Loscalzo[10]認為葉酸降低Hcy具有劑量依賴性，其促進血管平滑肌細胞增殖以及基質(zhì)的形成從而對血管具有一定的損害作用。所以，復方葛根片在這方面與葉酸相比具有有一定的優(yōu)勢。

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Protective effect of compound puerarin tablet on thoracic aorta injury of aged rats

LI Yun-jiang1，SUN Lin1，BI Yun-sheng2，ZHANG Shu-yu2，YU Yan-li2*

(1.School of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China;2. Department of Pharmacy, General Hospital of Jinan Military Command, Jinan 250031, China)

∶We divided rats into model group and normal group, and high, middle and low dose group of compound puerarin tablet to investigate the impact of compound puerarin tablet on D-galactose induced serum homocysteine (Hcy) level and protective effect on thoracic aorta injury of aged rats. We employed subcutaneous D-galactose injection to establish rats aging model, AU5800 automatic biochemical analyzer to detect Hcy content in rats serum, and SPSS16 to analyze Hcy content and weight difference of each group. We also performed HE staining to rats thoracic aorta and observed its pathological changes with a light microscope. Results show that significant difference (P<0.01) exists in Hcy level and weight of model group and normal group, each dose group and model group. Different dose groups have different protective effects on thoracic aortic vessels, especially for the high dose group having best protective effect. We discover that compound puerarin tablets can reduce Hcy levels in D-galactose induced old rats serum and have protective effects on vascular injury of thoracic aorta.

∶ D-galactose; Homocysteine; aged rat

10.3976/j.issn.1002-4026.2016.05.010

2016-06-27

李允江(1990—)，碩士研究生，研究方向為藥理學。Email:291484173@qq.com

*通信作者，于燕莉，主任藥師。Email：yuyanli323@sohu.com

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