王偉 趙全軍 劉爽 王濤 史鐵鈞 王淑為 郭欣茹

大鼠腦損傷海水浸泡后損傷腦組織小膠質(zhì)細胞炎性改變

王偉 趙全軍 劉爽 王濤 史鐵鈞 王淑為 郭欣茹

目的 觀察創(chuàng)傷性腦損傷合并海水浸泡后損傷腦組織的炎性反應(yīng)及小膠質(zhì)細胞的炎性改變。方法 利用改良的自由落體打擊模型構(gòu)建重型創(chuàng)傷性腦損傷大鼠模型，并于損傷處持續(xù)滴注海水45 min。分別于海水浸泡結(jié)束后第24、48、72、96 h取腦組織，以HE染色觀察損傷腦組織病理變化，以免疫組化DAB顯色，觀察小膠質(zhì)細胞的特異性抗體CD11b/c和CD68陽性細胞的數(shù)量及分布情況。結(jié)果 HE染色可見海水浸泡組24 h可見神經(jīng)細胞水腫明顯，細胞核深染，核周大量空泡形成并伴有明顯的出血；48 h細胞水腫更加明顯，細胞雜亂無章，核固縮畸形，細胞周圍開始出現(xiàn)大空泡并伴有大量血細胞浸潤；海水浸泡72 h及96 h組局部出血消退，腦細胞水腫不再繼續(xù)加重，仍可見明顯細胞核固縮畸形，細胞周圍大小空泡浸潤腦組織呈網(wǎng)格狀改。DAB顯色可見海水浸泡組24 h時CD11b/c及CD68陽性小膠質(zhì)細胞大量聚集、活化于損傷組織表面，48 h時聚集于損傷腦組織內(nèi)，可呈多層分布，可見明顯的吞噬行為；72 h及96 h組細胞數(shù)目已較48 h組明顯減少，可見局部組織中細胞密度降低，細胞吞噬行為明顯減少；相同時間點CD68陽性的細胞數(shù)目均明顯多于CD11b/c陽性細胞(均P<0.01)。結(jié)論 腦損傷海水浸泡后72 h內(nèi)腦組織炎性反應(yīng)最為強烈，小膠質(zhì)細胞大量聚集活化，72 h及96 h后逐漸減弱并趨于平穩(wěn)。

創(chuàng)傷性腦損傷；海水浸泡；炎癥；小膠質(zhì)細胞；CD11b/c；CD68

既往海水浸泡顱腦損傷的主要原因是海上作戰(zhàn)及軍事登陸作戰(zhàn)，隨著人們生活水平提高，海邊度假村的盛行，以及海難發(fā)生的增多，使海水浸泡顱腦損傷在普通人群中的發(fā)生率也逐年升高。研究表明，單純創(chuàng)傷性腦損傷的死亡率高達58%以上[1]，腦外傷患者約25%會出現(xiàn)終生殘疾[2]。海水中高離子濃度及其高滲透性會加重腦組織的炎性反應(yīng)及腦損害，炎性反應(yīng)所導(dǎo)致的二次損傷是后期各種功能缺陷的主要原因[3]，因此海水浸泡腦損傷死亡率及致殘率均較高。本研究中對創(chuàng)傷性腦損傷海水浸泡后不同時段腦出血、水腫及小膠質(zhì)細胞聚集活化的情況進行觀察，探究創(chuàng)傷性腦損傷海水浸泡后神經(jīng)炎性病理改變，以期為臨床治療海水浸泡顱腦損傷積累實驗資料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組:實驗所用動物均為清潔級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量230～250 g，由海軍總醫(yī)院實驗動物中心提供并幫助飼養(yǎng)。

1.1.2 主要儀器與試劑：Narishige腦立體定位儀(型號SR-5R，日本成茂顯微操作系統(tǒng)公司)；奧林巴斯BX63熒光顯微鏡(上海土森視覺科技有限公司)。實驗所用海水為配制海水(配方由國家第三海洋局提供)具體成分(單位mmol/L)：NaCl 443.66、KCl 9.73、CaCl212. 70、MgCl225.76、MgSO427.54、NaHCO32. 40、NaBr 0. 81，PH8.2，滲透壓1200 mOsm/L；甲醛溶液(北京科藝源技術(shù)服務(wù)中心)；水合氯醛溶液(解放軍第306醫(yī)院提供)；Anti-CD11b/c、anti-CD68及相應(yīng)二抗均購自上海abcam公司；DAPI(批號AR1177，武漢博士德公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型構(gòu)建：創(chuàng)傷性腦損傷模型采用改良自由落體損傷模型方法[1,4]造模。0.1 g/L水合氯醛按體質(zhì)量5 mL/kg劑量腹腔注射對大鼠進行麻醉后將其固定于立體定位儀上，作頭皮正中切口2.5 cm，參照包新民大鼠腦立體定向圖譜于前囟后2.0 mm，正中線旁開3.5 mm為中心，5.0 mm為直徑，用牙科鉆去除直徑5 mm的顱骨瓣，暴露硬腦膜(注意保護硬腦膜完整)，以40 g砝碼20 cm高度自由下落打擊硬腦膜。損傷后局部進行海水浸泡45 min，清除傷口周圍血腫并縫合切口。此種方法致傷力度為800 g·cm；海水浸泡45 min模擬了傷者落水及被救起后送去就醫(yī)的時間，此觀察時間是參照預(yù)實驗結(jié)果(海水浸泡大鼠腦損傷模型30 min、45 min、60 min，60 min組大鼠損傷24 h因重度腦水腫死亡)及既往研究結(jié)果[4-6]確定的。造模后根據(jù)改良的神經(jīng)功能評分(mNSS)選擇得分大于12分[7-8]的重度損傷大鼠納入實驗組并進行隨機分組；空白對照組麻醉后單純?nèi)コB骨骨瓣，縫合頭皮切口，不進行自由落體打擊及海水浸泡。造模完成后動物放回籠內(nèi)正常飲食。最終分為空白對照組及海水浸泡腦損傷24 h、48 h、72 h、96 h組五組(后四組簡稱海水浸泡24 h、48 h、72 h、96 h組)，每組5只，共計25只。

1.2.2 HE染色及免疫組化DAB顯色：海水浸泡24、48、72、96 h組分別于造模后24、48、72、96 h，空白對照組于腦損傷后24 h對大鼠進行甲醛灌注內(nèi)固定取腦。腦灌注內(nèi)固定方法：大鼠麻醉后迅速開胸腔，充分暴露心臟后，鈍性撕開心包并暴露主動脈，從心尖處插入灌注針頭至主動脈內(nèi)(注意不要損傷主動脈)，剪開右心耳同時迅速用400 mL生理鹽水全速灌注，灌注過程中可見肝臟血液逐漸消失殆盡，最后呈黃白色，鼠尾蒼白。之后用4%(體積分?jǐn)?shù))甲醛溶液400 mL進行灌注固定，前200 mL需全速灌注，后期為更好的固定，后200 mL則盡量慢速滴注。待灌注固定完成后對大鼠進行斷頭取腦。將取出的鼠腦置于4%(體積分?jǐn)?shù))甲酫中過夜后切取損傷處的腦組織，再經(jīng)20%(體積分?jǐn)?shù))甲酫溶液固定后進行脫水，包埋制作組織蠟塊。對組織蠟塊進行切片，脫蠟至水后進行相應(yīng)染色，每個切片厚約5 μm。

(1)HE染色：取每只鼠5張切片進行常規(guī)HE染色，觀察腦組織損傷周圍出血、水腫及組織結(jié)構(gòu)改變。

(2)DAB染色：取每只鼠切片5張，室溫下置5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))雙氧水中15 min，微波爐中高火EDTA修復(fù)15 min,自然冷卻后，PBS洗5 min×3次；滴加山羊血清后置37℃恒溫箱中20 min；滴加一抗(CD11b/c比例為1︰100，CD68比例為1︰200)4℃冰箱過夜；PBS洗5 min×3次；滴加二抗(耦聯(lián)劑)，于37 ℃恒溫箱中20 min；PBS洗5 min×3次；滴加三抗(辣根酶)，37 ℃恒溫箱中20 min；PBS洗5 min×3次；DAB顯色，熒光顯微鏡下觀察細胞顯色是否充分(以便根據(jù)細胞色差及時調(diào)整抗體濃度)；染核(DAPI)，脫水，封片。400倍鏡下觀察免疫熒光陽性細胞(鏡下綠色熒光細胞)在不同時間點的數(shù)量、分布及聚集情況，并計數(shù)鏡下陽性細胞數(shù)。每張切片于400倍鏡下任取5個視野進行計數(shù)，取其均值作為此片小膠質(zhì)細胞數(shù)目。小膠質(zhì)細胞的密度=均值/實際鏡下面積。每個400倍鏡下視野實際面積為0.24 mm2。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 以IBM SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，經(jīng)正態(tài)性及方差齊性檢驗均服從正態(tài)分布且方差齊，多組間比較one-way ANOVA進行分析，組間兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組腦組織腦出血及腦水腫變化比較 100倍鏡下可見各海水浸泡組均有明顯的組織缺損，海水浸泡48 h出現(xiàn)明顯的局部出血，與海水浸泡24 h及72 h比較均明顯嚴(yán)重，72 h及96 h時損傷局部已無明顯出血現(xiàn)象。400倍鏡下可見空白對照組腦組織中有少許小空泡出現(xiàn)，神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)大致正常，未見細胞水腫及明顯的出血(圖1A)；海水浸泡組24 h可見神經(jīng)細胞水腫明顯，細胞核深染，核周大量空泡形成并伴有明顯的出血(圖1B)；48 h細胞水腫更加明顯，細胞雜亂無章，核固縮畸形，細胞周圍開始出現(xiàn)大空泡并伴有大量血細胞浸潤(圖1C)；海水浸泡72 h及96 h組可見局部出血已消退，腦細胞水腫已不再繼續(xù)加重，96 h組局部出血及水腫已有明顯恢復(fù)，但兩組仍可見明顯細胞核固縮畸形，細胞周圍大小空泡浸潤腦組織呈網(wǎng)格狀改變(圖1C、D)。

2.2 各組損傷腦組織CD11b/c及CD68表達比較 100倍鏡下，同空白對照組相比較，海水浸泡組24h時CD11b/c陽性小膠質(zhì)細胞即已經(jīng)大量聚集、活化，集中部位主要位于損傷組織表面；48 h后細胞大量聚集于損傷腦組織內(nèi)，有多處細胞呈多層分布，并可見明顯的吞噬行為；72 h及96 h組細胞數(shù)目已較48 h組明顯減少，可見局部組織中細胞密度降低，細胞吞噬行為明顯減少。400倍鏡下可見更加明顯的細胞分布變化情況(圖2)。與空白對照組比較，海水浸泡組24 h(因多層分布而無法準(zhǔn)確計數(shù))、48 h小膠質(zhì)細胞數(shù)量明顯增高，至72 h及 96 h已明顯下降，空白對照組、48 h組、72 h組、96 h組四組間CD11b/c陽性細胞密度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=2162.19，P<0.01；表1)，且各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。

A：空白對照組；B：海水浸泡24 h；C：海水浸泡48 h；D：海水浸泡72 h；E：海水浸泡96 h 圖2 各組損傷腦組織CD11b/c表達比較(DAB×400) A：空白對照組；B：海水浸泡24 h；C：海水浸泡48 h；D：海水浸泡72 h；E：海水浸泡96 h 圖1 各組損傷處腦組織病理改變比較(HE×400) A：空白對照組；B：海水浸泡24 h；C：海水浸泡48 h；D：海水浸泡72 h；E：海水浸泡96 h 圖3 各組損傷腦組織CD68表達比較(DAB×400)

CD68陽性細胞在海水浸泡24 h時即可見有大量細胞聚集于損傷處，24 h、48 h細胞數(shù)目均明顯增多且聚集覆蓋于損傷處無法計數(shù)，72 h可見細胞數(shù)目已明顯減少，96 h細胞數(shù)量減少更加顯著，而且分布較散亂。CD68陽性細胞各個時間點的分布趨勢與CD11b/c陽性細胞基本相同，但相同時間點CD68陽性的細胞數(shù)目明顯多于CD11b/c陽性細胞(圖3、表1)。

組別CD11b/cCD68海水浸泡96h370．40±18．31?#401．40±8．79?▲海水浸泡72h471．80±11．14?#543．98±10．57?▲海水浸泡48h991．20±28．80?—海水浸泡24h—— 空白對照組90．60±4．67121．20±14．58▲

注：表中“—”表示者細胞數(shù)量大，分層分布，顯微鏡下無法計數(shù)；與空白對照組比較，*P<0.01；與海水浸泡48 h組比較，#P<0.01；與海水浸泡72 h組比較，△P<0.01；與CD11b/c細胞數(shù)量比較，▲P<0.01

3 討論

3.1 海水浸泡腦損傷后腦出血、腦水腫隨時間的進展 外傷性腦損傷后繼發(fā)性腦損傷的主要病理改變是腦水腫的形成，是腦損傷死亡的主要原因，約占腦損傷死因的50%[9]。海水中高離子濃度也是腦損傷后期加重創(chuàng)傷性腦水腫的重要因素[5]，細胞內(nèi)鈣離子超載被認為是腦水腫后神經(jīng)細胞死亡的最后通路[10]，海水中高濃度的鈣離子必然會加速腦水腫后期神經(jīng)細胞的死亡。有研究表明單純性腦損傷傷后3 h出現(xiàn)明顯水腫改變，8 h后水腫依舊；海水浸泡顱腦損傷傷后8 h才出現(xiàn)明顯的水腫且呈進一步加重的趨勢,這可能與海水低溫及高鎂對腦組織具有一定的保護作用有關(guān)[6]。本研究中同樣也觀察到損傷后24 h神經(jīng)細胞核深染，周圍大量空泡形成，表明損傷后24 h已出現(xiàn)明顯的腦水腫，48 h時水腫進一步加重，至72及96 h時神經(jīng)細胞排列更加紊亂，正常腦組織結(jié)構(gòu)已完全破環(huán)。這些表現(xiàn)同時間的關(guān)系與先前文獻描述類似[4-6，11-12]。但除海水外，炎性介質(zhì)也是造成腦水腫的一大重要因素。腦損傷后炎性反應(yīng)以一系列級聯(lián)反應(yīng)為特點，各種炎性介質(zhì)的釋放使免疫細胞聚集，生成過敏毒素使血腦屏障通透性增加，腦水腫加劇[13]。既往研究表明，損傷腦組織炎性反應(yīng)所導(dǎo)致的二次損傷是持續(xù)損傷及后期各種功能缺陷的主要原因，其特征主要包括白細胞聚集，小膠質(zhì)細胞的活化，各種炎性介質(zhì)的上調(diào)[14]。外傷性腦損傷后主要的炎性介質(zhì)包括IL-1、IL-6、IL-10、TNF、IFN等，有研究表明大鼠腦出血后24～48 h炎性細胞浸潤最為嚴(yán)重，而24～72 h TNF、IL-6、NF-κB、ICAM-1等出現(xiàn)表達高峰[15]。國外針對外傷性腦損傷后各種炎性介質(zhì)表達的研究表明，損傷后前48 h炎性反應(yīng)最為強烈，48～72 h候逐漸降低并趨于平穩(wěn)，炎性因子IL-1、TNF等均于損傷后6 h達高峰，6 h候逐漸下降，48 h候趨于平穩(wěn)[16]。本研究未單獨探討海水因素對腦細胞的影響，也未對主要的炎性介質(zhì)進行檢測研究，在以后研究中可進一步對此兩種因素進行研究。

3.2 小膠質(zhì)細胞聚集活化的高峰期 炎性反應(yīng)的參與者主要是炎性細胞及炎性介質(zhì)。小膠質(zhì)細胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要免疫細胞，是腦組織的常駐守衛(wèi)細胞。外傷性腦損傷后血腦屏障被破壞，血液中的免疫物質(zhì)進入腦組織形成炎性反應(yīng)并激活小膠質(zhì)細胞，觸發(fā)中樞免疫反應(yīng)。有研究表明大鼠腦損傷7天后小膠質(zhì)細胞細胞深染，包體腫脹，分布密度減小，突起粗短，呈網(wǎng)狀(典型活化狀態(tài))，且持續(xù)至28天依然呈活化狀態(tài)[17]，而針對更早期神經(jīng)炎性改變的研究發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細胞在腦出血后4 h即已出現(xiàn)，持續(xù)長達4周[18]。針對小膠質(zhì)細胞的超微研究顯示損傷早期小膠質(zhì)細胞形狀不規(guī)則，且參與皮層脊髓束的退行性改變，吞噬退行的軸突神經(jīng)[19]，這說明小膠質(zhì)細胞在損傷早期即以開始活化，且進行吞噬活動。諸多實驗研究小膠質(zhì)細胞的活化狀態(tài)，持續(xù)時間，但針對其活化數(shù)目隨時間的變化趨勢卻少見報道。而小膠質(zhì)細胞所行使的吞噬作用對新移植至腦內(nèi)的細胞尤為關(guān)鍵，所以避開小膠質(zhì)細胞聚集活化的高峰期，對細胞移植治療的效果影響極大。本次實驗針對小膠質(zhì)細胞數(shù)目隨時間的變化進行觀察，發(fā)現(xiàn)海水浸泡腦損傷后48 h細胞大量聚集于損傷腦組織內(nèi)，有多處細胞呈多層分布，并可見明顯的吞噬行為。72～96 h細胞數(shù)目逐漸減少，密度降低，細胞吞噬行為明顯減少。表明小膠質(zhì)細胞在72 h內(nèi)數(shù)量已達高峰，96 h后已大量減少。但關(guān)于活化高峰出現(xiàn)的具體時間仍待繼續(xù)研究觀察。

小膠質(zhì)細胞屬于巨噬細胞系統(tǒng)，外周巨噬細胞主要表達CD68表型，而腦組織中巨噬細胞可以表達CD11b/c和CD68兩種表型。目前，國內(nèi)外有關(guān)于免疫標(biāo)記的動物實驗均未具體闡述CD11b/c和CD68的區(qū)別[16，20]。當(dāng)血腦屏障被破壞，外周大量巨噬細胞進入大腦，吞噬退行性神經(jīng)細胞。本實驗中發(fā)現(xiàn)海水浸泡腦損傷后相同時期(24及72 h)CD68+細胞數(shù)量要遠多于CD11b/c+細胞，海水浸泡顱腦損傷96 h后兩種表型的細胞數(shù)量無明顯差異(P=0.07)，表明此時可能炎性反應(yīng)高峰已漸消退，血腦屏障功能逐漸恢復(fù)。本研究中空白對照組CD68+細胞數(shù)量也多于CD11b/c+細胞(P=0.03)，推測可能是由于去骨瓣時對血腦屏障造成輕微損傷導(dǎo)致的。

綜上可見，大鼠腦損傷海水浸泡后損傷腦組織炎性反應(yīng)明顯，小膠質(zhì)細胞活性增強，關(guān)于海水浸泡后腦損傷的治療還需進一步觀察研究。

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(本文編輯：鄒晨雙)

Change of pathology on neuroinflammation after traumatic brain injury immerged with sea water in rats

WANGWei,ZHAOQuanjun*,LIUShuang,WANGTao,SHITiejun,WANGShuwei,GUOXinru.

*DepartmentofNeurosurgery,306HospitalofPLA,Beijing100101,China

Corresponding author:ZHAOQuanjun, Email: docto@sina.com

Objectives To observe the inflammatory responses of brain tissues and the inflammatory change of microglia in rats with traumatic brain injury(TBI)and sea water immersion. Methods Serious TBI was constructed using freeney’s weight drop device, sea water immersion continuous infusion was adopted immediately for 45 minutes after TBI model building. The brain tissues were collected at 24 h, 48 h, 72 h, 96 h after injury and observed by HE staining and immunohistochemical staining with CD11b/c and CD68 antibody.The number and distribution of the positive cells were observed. Results TBI with sea water immersion induced an obvious neuroinflammation which showed nerve cell edema was obvious, the nucleus was stained, and a large number of vacuoles were formed and accompanied with obvious hemorrhage at 24 h after injury.The cell edema was more obvious, the cell was disorganized, the nuclear condensation and big vacuoles were observed, a lot of blood cell infiltrated at 48 h.Local bleeding subsided, brain edema did not increase, obvious nuclear condensation was observed and the vacuoles surrounding the cells changed into grid-like patternat 72-96 h after injury. A large number of CD11b/c and CD68 positive microglia gathered and activated on the surface of injured tissue by DAB stainingand the cells gathered in the injured brain tissueat 48 h, there was a multi-layer distribution which showed obvious phagocytosis.Cell number at 72 h and 96 h significantly decreased compared with the 48 h group, the cell density in the local tissue decreased, and the phagocytic behavior significantly decreased.At the same time, the number of CD68 positive cells was significantly higher than that of CD11b/c positive cells(P<0.01, respectively). Conclusions The neuroinflammation of TBI rats immerged with sea water was the most serious in the initial 72 hours and a large number of microglia aggregates and activates. Then the changes start to level off after 72-96 h.

traumatic brain injury;sea water immersion;neuroinflammation;microglia;CD11b/c;CD68

10.3969/j.issn.1006-2963.2016.06.008

軍隊后勤科研資助項目(CHJ12J022)

510515南方醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院(王偉)；100101中國人民解放軍第306醫(yī)院神經(jīng)外科(趙全軍、王濤、史鐵鈞)；100048 中國人民解放軍海軍總醫(yī)院神經(jīng)外科(劉爽、王淑為、郭欣茹)

趙全軍，Email：docto@sina.com

R364.7

A

1006-2963(2016)06-0421-05

2015-12-02)