劉艷霞， 蘭欣欣， 曹 婧， 張晶華， 蘭海燕*

( 新疆大學 生命科學與技術(shù)學院/新疆生物資源基因工程重點實驗室， 烏魯木齊 830046 )

藜科植物藜和灰綠藜實時熒光定量PCR內(nèi)參基因的選擇

劉艷霞1， 蘭欣欣2， 曹 婧2， 張晶華2， 蘭海燕2*

( 新疆大學 生命科學與技術(shù)學院/新疆生物資源基因工程重點實驗室， 烏魯木齊 830046 )

選擇合適的內(nèi)參基因是實時熒光定量PCR(qRT-PCR)研究的關(guān)鍵，目前對藜科耐鹽(鹽生)植物脅迫相關(guān)基因的表達分析中所用內(nèi)參基因的報道較為有限。該研究利用GeNorm、NormFinder和BestKeeper 3個內(nèi)參基因分析軟件，對已選擇過的β-TUBULIN、β-ACTIN、GAPDH3個常用候選內(nèi)參基因進行了比較分析，篩選出在NaCl和PEG脅迫下藜和灰綠藜中表達相對穩(wěn)定的內(nèi)參基因。結(jié)果表明：GeNorm、NormFinder內(nèi)參軟件分析在NaCl和PEG脅迫下，GAPDH是藜和灰綠藜中均共同穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因，同時在藜和灰綠藜中也有各自表達較穩(wěn)定的內(nèi)參基因，β-ACTIN在藜中穩(wěn)定表達，β-TUBULIN則在灰綠藜中穩(wěn)定表達。對相同科不同種的植物內(nèi)參基因表達差異進行比較，內(nèi)參基因在相同科中具有相同穩(wěn)定表達的內(nèi)參；對相同脅迫下兩種不同植物內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性進行分析，內(nèi)參基因的選擇需根據(jù)實際的實驗材料和實驗條件而定。基于3個分析軟件對以上3個常用內(nèi)參基因的分析結(jié)果，初步確定了在藜科植物藜和灰綠藜中相對穩(wěn)定的內(nèi)參基因，為藜和灰綠藜脅迫相關(guān)基因的定量表達分析提供了參考依據(jù)。

藜， 灰綠藜， 實時熒光定量PCR， 內(nèi)參基因， 脅迫

實時熒光定量PCR (quantitative real time RT-PCR，qRT-PCR) 是在傳統(tǒng)聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR) 基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項新的核酸定量技術(shù)，該技術(shù)操作快速簡便，具有特異性、高敏感性、精確性等特點，在農(nóng)學、微生物學、醫(yī)學、食品安全檢測，特別是分子生物學方面均有重要應(yīng)用(陳旭等，2010；王彥杰等，2012)。qPCR和傳統(tǒng)技術(shù)如免疫印跡方法具相似之處，但前者需要穩(wěn)定的內(nèi)參基因校正樣品總RNA的含量(Radonic et al，2004)。目前，常用的內(nèi)參基因多為管家基因(house-keeping gene)，如甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GLYCERALDEHYDE-3-PHOSPHATEDEHYDROGENASE,GAPDH) (Zou et al，2011 )、肌動蛋白基因(ACTIN,ACT) (Chen et al，2011)和微管蛋白基因(TUBULIN,TUB) (Zhou et al，2011)、泛素基因(UBIQUITIN) (Parra & Gomez，2011)、28S核糖體RNA基因(28SrRNA)、18S核糖體RNA基因(18SrRNA) (Miao et al，2011)、親環(huán)蛋白基因(CYP)、多聚泛素酶基因(UBQ)、轉(zhuǎn)錄延伸因子基因(EF-1α) (Dheda et al，2004)等。由于這些管家基因參與生物體基本生命代謝活動，具組成型穩(wěn)定表達的特性(Reid et al，2006 )。內(nèi)參基因不存在通用性，隨著物種及實驗條件的改變，這些傳統(tǒng)的保守基因的表達并非總是穩(wěn)定的，因此對內(nèi)參基因的選擇應(yīng)根據(jù)具體實驗條件和材料方法而定(Gao et al，2012)。目前對qPCR中內(nèi)參基因的穩(wěn)定性的分析主要通過GeNorm、NormFinder、BestKeeper 3個常用內(nèi)參基因分析軟件進行穩(wěn)定指數(shù)分析、ΔCt值分析。Ct也稱循環(huán)閾值，表示在PCR循環(huán)過程中，每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達閾值時所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，ΔCt值越小起始拷貝數(shù)越多(袁偉等，2012)。GeNorm程序由Vandesompele et al(2002)使用Excel編寫的穩(wěn)定性選擇程序；NormFinder是Andersen et al(2004)基于方差分析選擇合適內(nèi)參基因的軟件；BestKeeper程序是Pfaffl et al(2004)開發(fā)的基于對管家基因和目標基因獨立分析的基因表達穩(wěn)定性軟件。

灰綠藜(Chenopodiumglaucum)為藜科一年生草本鹽生植物，能夠有效地降低土壤含鹽量，增加土壤有機質(zhì)，從而改善土壤性質(zhì)(趙可夫等，1999)。藜(C.album)為藜科一年生耐鹽草本植物，具有很強的抗逆性并具有泌鹽的鹽囊泡結(jié)構(gòu)(鄧彥斌等，1998；周三等，2011)。藜科植物已經(jīng)成為植物耐鹽性研究的優(yōu)良材料(段德玉等，2004)。目前關(guān)于藜科植物基因表達分析的內(nèi)參基因選擇的報道還很有限，基于此，本研究以常用的3個內(nèi)參基因β-ACTIN、β-TUBULIN、GAPDH對藜和灰綠藜兩種藜科近源植物脅迫相關(guān)基因表達的內(nèi)參基因進行分析比較，并基于GeNorm、NormFinder、BestKeeper 3個內(nèi)參基因分析軟件選擇穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因，分析在相同脅迫下具有親緣關(guān)系的同科不同種植物內(nèi)參基因的表達變化，以及在不同脅迫下同一種植物的內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性的變化，為后續(xù)的藜科植物基因表達研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

選取成熟良好且完整的藜(Chenopodiumalbum)或灰綠藜(C.glaucum)的種子播種于25 cm直徑并裝有蛭石和珍珠巖(3∶1)基質(zhì)的花盆中，于光周期16 h 晝/8 h夜，溫度23～25℃，光強為150～200 μmol·m-2·s-1的環(huán)境中生長，定期澆灌1/2 Hoagland (pH 6.0)營養(yǎng)液(張薇等, 2015)。植株培養(yǎng)生長3個月后進行NaCl和PEG脅迫處理，NaCl濃度分別為50、100、300 mmol·L-1，PEG 6000濃度分別為5%、10%、20%。藜和灰綠藜都經(jīng)過NaCl 5 h，PEG 48 h的脅迫處理，脅迫處理后選取株型和長勢一致的植株，取植株從上向下第2～4片幼嫩葉片，立即置于液氮中，隨后保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 植物葉片總RNA的提取和cDNA合成 利用OMEGA植物總RNA樣品提取試劑盒(編號：R6827-02 產(chǎn)地：美國)說明書提取樣品總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。取1 μL總RNA按TAKARA公司的反轉(zhuǎn)錄PCR試劑提供的操作步驟進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

表 1 實時熒光定量PCR檢測中所用的3個內(nèi)參基因的引物序列

1.2.2 引物設(shè)計與內(nèi)參基因的擴增 選用3個常用內(nèi)參基因-肌動蛋白基因(ACTIN)、微管蛋白基因(TUBULIN)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)為目標，利用DNAMAN軟件根據(jù)其他物種中3個基因的保守序列設(shè)計針對兩種藜科植物的引物(表1)。3個內(nèi)參基因的擴增反應(yīng)條件均為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

1.2.3 實時熒光定量PCR分析 利用GeneAmp 7500實時PCR系統(tǒng)及SYBR Green (Qiagen)進行定量PCR分析，參照Qiagen公司熒光定量試劑盒具體操作步驟，將藜和灰綠藜經(jīng)過脅迫處理后的cDNA為模板，每處理4個生物學重復，每重復兩次技術(shù)重復，在20 μL體系中反應(yīng)。具體的反應(yīng)條件如下：預變性 95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s， 60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。根據(jù)循環(huán)Ct值制作3種內(nèi)參基因的標準曲線。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 通過瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)對總RNA質(zhì)量和內(nèi)參基因目的片段進行檢測，且根據(jù)PCR循環(huán)過程中的Ct(循環(huán)閾值)進行比較，熒光定量數(shù)據(jù)采用4次生物學重復和兩次技術(shù)重復(共 6 個重復)計算平均值，Ct值越小起始拷貝數(shù)越多(袁偉等，2012)；并通過三個內(nèi)參軟件GeNorm、NormFinder、BestKeeper對選取的三個內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進行分析，GeNorm根據(jù)M (平均表達穩(wěn)定值)的大小進行穩(wěn)定性比較，M值越小穩(wěn)定性越好(Vandesompele et al，2002)；NormFinder根據(jù)運算出內(nèi)參基因S(穩(wěn)定值)分析內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性，S值越小表示內(nèi)參基因穩(wěn)定性越好(Andersen et al，2004)。BestKeeper是用于比較內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性和基因表達水平的軟件，Geo mean(幾何平均數(shù))、SD(標準變異系數(shù))越小穩(wěn)定性越好(Pfaffl et al，2004)?；?個軟件的分析比較從而篩選藜和灰綠藜在脅迫條件下最合適的內(nèi)參基因組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA質(zhì)量和內(nèi)參基因目的片段擴增檢測

圖1顯示，藜和灰綠藜葉片不同處理的總 RNA樣品條帶清晰，無明顯降解，28SrRNA與18SrRNA的亮度比值至少為2∶1。定量檢測結(jié)果表明，各樣品A 260 /A 280值均在 2.0 左右，說明藜和灰綠藜植株葉片總RNA較完整且純度較高，可進行后續(xù)實驗。用脅迫下藜和灰綠藜葉片 cDNA分別擴增3個內(nèi)參基因β-ACTIN、β-TUBULIN、GAPDH的目的DNA片段，瓊脂糖凝膠電泳分析顯示3個內(nèi)參基因條帶與預期大小一致，且均為單一目的條帶(圖2)，表明各內(nèi)參基因引物均具有較好的特異性，可用于后續(xù)實時熒光定量PCR分析。

2.2 實時熒光定量PCR分析

實時熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，內(nèi)參基因的標準曲線線性相關(guān)系數(shù)為R2≥ 0.999，引物的擴增效率為85.6%～92.1% (表2)。以上數(shù)據(jù)均符合實時熒光定量PCR對擴增效率的要求。各內(nèi)參基因的熔解曲線只有明顯的單一信號峰，樣品重復間的擴增重復性較高，陰性對照未檢測到熒光信號。這表明實時熒光定量PCR反應(yīng)中模板與引物結(jié)合較好，結(jié)果具較高的特異性。

2.3 內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性分析

通過GeNorm、NormFinder、BestKeeper 3個內(nèi)參分析軟件對實時熒光定量PCR儀所得到的Ct值進行內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析。ΔCt值是樣品中各基因的循環(huán)閾值，ΔCt值最小的基因表達穩(wěn)定性越高(袁偉等，2012)。圖3所示的是藜和灰綠藜中不同內(nèi)參基因的表達水平(Ct值)。結(jié)果顯示，藜的β-ACTIN的Ct值的變化范圍最小，Ct值變化范圍其次是GAPDH，β-TUBULIN；在灰綠藜中β-TUBULIN的Ct值變化范圍最小，其次是GAPDH，β-ACTIN。由ΔCt值分析結(jié)果可知，在藜中β-ACTIN表達較穩(wěn)定，在灰綠藜中β-TUBULIN表達較穩(wěn)定。

圖 1 藜和灰綠藜總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of total RNA extracted from Chenopodium album and C. glaucum

圖 2 藜和灰綠藜中3個內(nèi)參基因的PCR擴增產(chǎn)物1. 肌動蛋白基因; 2. 甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因; 3. 微管蛋白基因; M. 分子量標記。Fig. 2 Agarose gel analysis of three candidate reference genes amplification in Chenopodium album and C. glaucum1. β-ACTIN ; 2. GAPDH; 3. β-TUBULIN; M. Marker.

2.3.1 內(nèi)參基因的GeNorm分析 GeNorm軟件通過比較M值確定最穩(wěn)定內(nèi)參基因，M值越小表明穩(wěn)定性越好。通過GeNorm軟件分析(圖4)，藜在NaCl脅迫下β-TUBULIN、β-ACTIN、GAPDH3個內(nèi)參的平均M值依次為0.726 562、0.552 129、0.552 129，表達穩(wěn)定度由低到高排列順序為β-TUBULIN<β-ACTIN=GAPDH，β-ACTIN和GAPDH2個內(nèi)參的表達均較穩(wěn)定。在PEG脅迫下3個內(nèi)參基因表達穩(wěn)定度由低到高的順序為GAPDH<β-ACTIN=β-TUBULIN，其中β-ACTIN和β-TUBULIN兩個內(nèi)參的表達均較穩(wěn)定?；揖G藜在NaCl脅迫下3個內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定度由低到高順序為β-ACTIN<β-TUBULIN=GAPDH，其中β-TUBULIN和GAPDH兩個內(nèi)參的表達均較穩(wěn)定。灰綠藜在PEG脅迫下3個內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定度由低到高排列順序為β-ACTIN<β-TUBULIN=GAPDH， 其中β-TUBULIN和GAPDH兩個內(nèi)參的表達均較穩(wěn)定。由以上結(jié)果可知， 藜的β-ACTIN較穩(wěn)定，β-TUBULIN和GAPDH的穩(wěn)定性較低；灰綠藜的β-TUBULIN和GAPDH的穩(wěn)定性最高，β-ACTIN的穩(wěn)定性最低。

表 2 藜和灰綠藜實時熒光定量PCR分析中3種內(nèi)參基因的相關(guān)系數(shù)及擴增效率

注：β-ACTIN. 肌動蛋白基因;β-TUBULIN. 微管蛋白基因;GAPDH. 甘油醛-3-磷酸-脫氫酶基因。

Note:β-ACTIN;β-TUBULIN;GAPDH. Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase.

圖 3 藜和灰綠藜中內(nèi)參基因的表達水平(Ct值)Fig. 3 Graphical representation of the expression level of the candidate reference genesin Chenopodium album and C. glaucum

圖 4 GeNorm軟件分析候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性Fig. 4 Stability of candidate reference genes analyzed by GeNorm software

2.3.2 內(nèi)參基因的NormFinder分析 NormFinder軟件利用方差分析法對內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進行分析，所得值越小穩(wěn)定性越好。與GeNorm軟件的分析結(jié)果一致，在NaCl和PEG脅迫下，藜的最佳內(nèi)參基因是β-ACTIN；灰綠藜的最佳內(nèi)參基因是GAPDH。NormFinder軟件計算結(jié)果顯示(表3)，在NaCl脅迫下，3個內(nèi)參基因在藜中表達穩(wěn)定度由低到高排列順序為GAPDH<β-TUBULIN<β-ACTIN,β-ACTIN為最優(yōu)內(nèi)參基因。在PEG處理下，3個內(nèi)參基因在藜中的表達穩(wěn)定度由低到高排列順序為GAPDH<β-TUBULIN<β-ACTIN,β-ACTIN是最優(yōu)內(nèi)參基因。在NaCl脅迫下，3個內(nèi)參基因在灰綠藜中的表達穩(wěn)定度排列順序為β-ACTIN<β-TUBULIN

2.3.3 內(nèi)參基因的Bestkeeper分析 BestKeeper軟件可以對內(nèi)參基因和目標基因進行單獨分析，是用于分析不同的實驗處理下內(nèi)參基因參數(shù)的軟件，參數(shù)大小反應(yīng)內(nèi)參基因穩(wěn)定性差異，值小的內(nèi)參基因表達較穩(wěn)定。BestKeeper軟件默認的SD值大于1時，說明該內(nèi)參基因的穩(wěn)定性較差。

表4顯示，對藜而言，在NaCl脅迫下內(nèi)參基因β-TUBULIN的SD值為0.48，Geo mean為18.16，Min、Max分別為16.94，19.00，在3個內(nèi)參基因中值最小，故β-TUBULIN為表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因；在PEG脅迫下內(nèi)參基因β-TUBULIN的SD值為0.32，Geo mean為19.32，Min，Max值分別為18.69、20.10，在3個內(nèi)參基因中值也最小，故在PEG處理下β-TUBULIN也是表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。對灰綠藜而言，在NaCl脅迫下內(nèi)參基因β-TUBULIN的SD值為0.29，Geo mean為16.17，Min、Max值分別為15.58、16.93，在3個內(nèi)參基因中值最小，因此β-TUBULIN為表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因；在NaCl脅迫下內(nèi)參基因β-ACTIN的SD值為0.61，Geo mean(幾何平均數(shù))為21.43，Min、Max值分別為19.61、22.58，在3個內(nèi)參基因中值最小， 因此β-ACTIN為表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

表 3 NormFinder軟件分析候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性

注： S. 穩(wěn)定值。

Note: S. Stable value.

表 4 Bestkeeper軟件分析候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性

注： [Ct]. 循環(huán)數(shù); Geo Mean. 幾何平均數(shù); Min, max [Ct]. 極端值 [Ct]; Min, max [x-fold]. 表達水平的極端值; Std dev [± Ct]. 標準變異系數(shù) [± Ct]。

Note: Ct. Cycle threshold; Geo Mean. Geometric mean; Min, max [Ct]. Extreme values of Ct; Min, max [x-fold]. Extreme values of expression levels expressed as absolute x-fold over or under coefficient; Std dev [± Ct]. Standard deviation [Ct].

3 討論與結(jié)論

實時熒光定量PCR技術(shù)具有特異性、準確性高、靈敏度高等特點，為了實驗獲得更好的結(jié)果，這項技術(shù)必須嚴格遵循相關(guān)的實驗規(guī)范(Udvardi et al，2008；Bustin et al，2009)。內(nèi)參基因表達隨著實驗條件的變化而變化(Czechowski et al，2005；Paolacci et al，2009；Nicot et al，2005)，目的基因最終計算結(jié)果需要用內(nèi)參基因進行校正，所以針對不同的實驗條件分析和篩選穩(wěn)定的內(nèi)參基因很重要。在篩選相關(guān)內(nèi)參基因時可首先參考前人研究的報道，若無相關(guān)內(nèi)參基因信息，應(yīng)選擇常用的且穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因再進行后續(xù)實驗(魏毅東等，2013)。本研究中，GAPDH在藜和灰綠藜中均穩(wěn)定表達，說明屬于同種的植物具有相似性，在內(nèi)參基因的穩(wěn)定性表達上有相同的情況，然而相同的內(nèi)參基因在同一種植物中表達不一定相同，即β-ACTIN在藜中表達較穩(wěn)定，β-TUBULIN則在灰綠藜中表達較穩(wěn)定。GAPDH及β-ACTIN作為內(nèi)參基因被廣泛應(yīng)用(孫美蓮等，2010；Lovdal & Lillo，2009)。理想的內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性不隨光周期、溫度等外界環(huán)境的變化而改變，內(nèi)參基因在所有細胞中均可穩(wěn)定表達(Paolacci et al， 2009)。在不同組織器官和生理狀態(tài)下均穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因是不存在的，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性具有相對性，相同生理條件下不同內(nèi)參基因的表達量通常不同，一種實驗條件下表現(xiàn)穩(wěn)定的內(nèi)參基因在另一種條件下表達可能是不穩(wěn)定的(Nicot et al，2005)。Bustin et al (2009)證明實驗中使用不穩(wěn)定的內(nèi)參基因會影響結(jié)果的可靠性。因此，在利用實時熒光定量PCR進行基因表達分析時，為了得到更可靠的實驗結(jié)果，在實驗過程中需要根據(jù)研究對象和實驗條件選擇合適的內(nèi)參基因(Ohl et al，2005)。

GeNorm、NormFinder、BestKeeper是基于統(tǒng)計學的3個內(nèi)參分析軟件。GeNorm內(nèi)參軟件是Vandesompele et al (2002)發(fā)明對內(nèi)參基因穩(wěn)定性進行分析的軟件。通過軟件運算出基因表達穩(wěn)定性的M值分析內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性，M值越小穩(wěn)定性越好。GeNorm軟件還可確定在不同生理條件下最適的內(nèi)參基因數(shù)目具有可靠的表達分析結(jié)果。NormFinder內(nèi)參軟件是Andersen et al (2004)發(fā)明的基于方差分析判斷在不同條件下內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性的程序，NormFinder運算出內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定值，按穩(wěn)定值的大小排序，值越小穩(wěn)定性越好，進而選擇出最穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因。BestKeeper內(nèi)參軟件是Pfaffl et al(2004)開發(fā)的用于比較內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性和基因表達水平的軟件，Ct值標準偏差和變異系數(shù)越小穩(wěn)定性越好。

本研究選用GeNorm、NormFinder、BestKeeper 3個常用內(nèi)參分析軟件對ΔCt(qRT-PCR過程中循環(huán)數(shù))、M(平均表達穩(wěn)定性值)、S(穩(wěn)定值)、Geo mean(幾何平均數(shù))、SD(標準變異系數(shù))等數(shù)值對內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進行分析。GeNorm軟件對3個內(nèi)參基因分析顯示：藜在NaCl和PEG脅迫處理下β-ACTIN和GAPDH是表達較穩(wěn)定的內(nèi)參基因，灰綠藜相對表達穩(wěn)定的內(nèi)參基因是β-TUBULIN和GAPDH，NormFinder的計算結(jié)果和GeNorm一致。BestKeeper內(nèi)參軟件的分析結(jié)果顯示，β-TUBULIN在經(jīng)過NaCl和PEG脅迫的藜中和NaCl處理下的灰綠藜中是表達較穩(wěn)定的內(nèi)參基因，β-ACTIN為PEG脅迫下灰綠藜中表達穩(wěn)定的基因。BestKeeper和NormFinder、GeNorm軟件分析結(jié)果不完全一致。ΔCt值是樣品中各基因的循環(huán)閾值，ΔCt值最小的基因表達穩(wěn)定性越高，通過對2個內(nèi)參基因的ΔCt(RT-PCR過程中循環(huán)數(shù))值比較可助篩選表達最穩(wěn)定的管家內(nèi)參基因(胡瑞波等，2009)。通過對ΔCt進行分析，結(jié)果顯示在藜中β-ACTIN內(nèi)參基因的Ct值變化范圍最小，其次是GAPDH，β-TUBULIN的Ct值最??；在灰綠藜中β-TUBULIN的Ct值變化范圍最小，與NormFinder、GeNorm軟件分析一致。

3個內(nèi)參軟件對3個內(nèi)參基因進行分析時，GeNorm和NormFinder分析的結(jié)果完全一致，而BestKeeper在藜的內(nèi)參基因分析時結(jié)果和GeNorm和NormFinder分析結(jié)果部分不一致，造成這種差異的根本原因可能是軟件的統(tǒng)計學原理不同造成的(Hu et al，2009)。大多發(fā)表的文章均已使用GeNorm和NormFinder內(nèi)參軟件進行內(nèi)參穩(wěn)定性分析并獲得合適的內(nèi)參基因(Kim S & Kim T，2003；Savli et al，2003；Aandersen et al，2004；Hong et al，2008；陳孝仁等，2013)。本研究通過GeNorm、NormFinder兩個內(nèi)參軟件以及對實時熒光定量PCR的Ct值進行分析顯示，沒有一個固定的基因在任何條件下均穩(wěn)定表達。本研究由NormFinder和GeNorm軟件分析結(jié)果得出一致結(jié)論：藜中β-ACTIN在NaCl和PEG脅迫下均穩(wěn)定表達；在灰綠藜中NaCl和PEG脅迫下β-TUBULIN均穩(wěn)定表達，而GAPDH是兩種藜科植株中共同穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因。由此暗示，相同科不同種的植物在內(nèi)參基因表達上有共性也有差異。在相同脅迫下的內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性是隨機的，內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性與脅迫條件無關(guān)，因此內(nèi)參的選擇還要根據(jù)實驗材料和實驗條件進行選擇(Warrington et al，2000；Suzuki et al，2000)。

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Screening of qRT-PCR reference genes for ChenopodiumalbumandC.glaucumof Chenopodiaceae

LIU Yan-Xia1, LAN Xin-Xin2, CAO Jing2, ZHANG Jing-Hua2, LAN Hai-Yan2*

( College of Life Sciences and Technology, Xinjiang University, Xinjiang Key Laboratory ofBiologicalResourcesandGeneticEngineering, Urumqi 830046, China )

Selection of suitable reference gene is a critical step in real-time quantitative PCR (qRT-PCR) analysis. So far, reports on reference gene screening on stress-tolerant gene expression of Chenopodiaceae species are limited. In the present study, by using three reference-gene-analysis softwares-GeNorm, NormFinder, BestKeeper, the stability of three commonly used candidate reference genesβ-ACTIN,β-TUBULINandGAPDHofChenopodiumalbumandC.glaucumunder NaCl and PEG treatments were compared. The results showed that under NaCl and PEG stresses,GAPDHshowed stable both inC.albumandC.glaucum. The results also demonstated that the same reference genes expressed stable in the same family.β-ACTINexpressed stable inC.album, whileβ-TUBULINexpressed stable inC.glaucum. We also studied the plants of different gera in the same family and the same stress of the stability of the expression of reference genes. The results suggested that same reference gene expressed stable in the same species. For the same stress in these two species, the results showed that selection of the most stable reference gene depended on the experimental materials and the conditions. The analysis results of the three candidate reference genes were based on the three analysis softwares. In our study, we determined the ralatively stable reference genes inC.albumandC.glaucum. This study provides the reference for the further study on qRT-PCR analysis of stress-relevant gene expression in Chenopodiaceae species.

Chenopodiumalbum,C.glaucum, quantitative real-time PCR (qRT-PCR), reference gene, stress

10.11931/guihaia.gxzw201601034

2016-03-22

2016-06-20

國家自然科學基金(31260037, 31460043, 31660068)；新疆自治區(qū)優(yōu)秀青年科技人才培養(yǎng)項目(2013721013) [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31260037, 31460043, 31660068)；Program for Training Young Talents of Xinjiang Uygur Autonomous Region (2013721013)]。

劉艷霞(1994-)，女，甘肅民勤人，碩士研究生，研究方向為生物化學與分子生物學，(E-mail)15292852327@163.com。

*通訊作者： 蘭海燕，博士，教授，研究方向為植物抗逆分子生物學，(E-mail)lanhaiyan@xju.edu.cn。

Q945.11

A

1000-3142(2016)12-1511-09

劉艷霞， 蘭欣欣， 曹婧， 等. 藜科植物藜和灰綠藜實時熒光定量PCR內(nèi)參基因的選擇 [J]. 廣西植物， 2016， 36(12):1511-1518

LIU YX, LAN XX, CAO J， et al. Screening of qRT-PCR reference genes forChenopodiumalbumandC.glaucumof Chenopodiaceae [J]. Guihaia， 2016， 36(12):1511-1518