武 鑫， 李萌萌， 鄧 騁， 鄧威威， 張正竹

( 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶樹生物學(xué)與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 合肥 230036 )

CaXMT和TCS1突變體基因串聯(lián)共表達(dá)及體外酶活檢測分析

武 鑫， 李萌萌， 鄧 騁， 鄧威威， 張正竹*

( 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶樹生物學(xué)與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 合肥 230036 )

咖啡堿和可可堿是茶葉生物堿的主要組分，且咖啡堿是茶葉重要的滋味物質(zhì)，隨著咖啡堿在食品和藥物領(lǐng)域的應(yīng)用愈發(fā)廣泛，咖啡堿的生物合成成為新的研究熱點(diǎn)。目前市場上的咖啡堿主要靠化學(xué)合成，為了探索其生物合成途徑，該研究將咖啡黃嘌呤核苷甲基轉(zhuǎn)移酶(coffee xanthosine methyltransferase，CaXMT)基因和茶樹咖啡堿合成酶(tea caffeine synthase，TCS1)基因的4個(gè)突變體分別串聯(lián)至同一大腸桿菌表達(dá)載體pMAL-c5X，誘導(dǎo)融合蛋白共表達(dá)，并進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析。結(jié)果表明：目的蛋白成功表達(dá)后，應(yīng)用超聲破碎法制備含有目的蛋白的粗酶液，添加底物黃嘌呤核苷(xanthosine，XR)和甲基供體S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)進(jìn)行體外酶促反應(yīng)，將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行高效液相色譜檢測。檢測結(jié)果顯示，pMAL-CaXMT-TM2/3/4的體外酶促反應(yīng)產(chǎn)物僅有可可堿生成，均未見咖啡堿生成。該研究結(jié)果為構(gòu)建生物合成咖啡堿和可可堿的串聯(lián)共表達(dá)載體奠定了基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步研究生物合成咖啡堿和可可堿提供了新思路。

咖啡堿, 串聯(lián)共表達(dá), 體外活性

咖啡堿(1,3,7-三甲基黃嘌呤)和可可堿(3,7-二甲基黃嘌呤)一同被歸類為嘌呤生物堿，存在于茶、咖啡以及大部分軟飲料中(Ashihara et al，2008)?？Х葔A不但能刺激神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)，增強(qiáng)無氧運(yùn)動(dòng)時(shí)的耐力，而且具有利尿、抗癌的作用(吳命燕等，2010；Panayiotis et al,2013)。咖啡堿的制備方法主要分為人工合成、生物合成、天然提取，其中人工合成是咖啡堿的主要來源，但人工合成具有安全性小、污染環(huán)境等問題(李海霞等，2011)。隨著咖啡堿廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥行業(yè)，其生物合成由于低污染、低殘留等優(yōu)點(diǎn)而受到關(guān)注。因此探索其生物合成方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

茶樹中的咖啡堿主要分布在新梢部位，其中嫩芽葉中含量最多，而咖啡堿合成的前體物質(zhì)可可堿僅存在于幼嫩葉片中(宛曉春等，2015；Ashihara & Crozier，1999)?？Х葔A的主要生物合成途徑是黃嘌呤核苷(XR)→7-甲基黃嘌呤核苷(7-MXR)→7-甲基黃嘌呤(7-MX)→可可堿(Tb)→咖啡堿(Cf)，該反應(yīng)途徑由四步組成，包括三步甲基化反應(yīng)和一步脫核苷反應(yīng)(Koshiishia et al，2001；Kato et al，1996)。生物合成途徑中催化前兩步的酶是咖啡黃嘌呤核苷甲基轉(zhuǎn)移酶，催化后兩步反應(yīng)的酶是茶樹咖啡堿合成酶(Ashihara et al,1996；Waldhauser et al,1997；Kato et al，1999)。基于TCS1突變體單獨(dú)表達(dá)基礎(chǔ)上，將4個(gè)突變體TMX分別與CaXMT基因串聯(lián)在表達(dá)載體pMAL-c5X上，通過SDS-PAGE檢測驗(yàn)證了串聯(lián)基因蛋白的共表達(dá)。誘導(dǎo)融合蛋白成功表達(dá)后，進(jìn)一步通過體外酶促反應(yīng)來驗(yàn)證串聯(lián)表達(dá)載體的活性，并采用HPLC進(jìn)行檢測酶促反應(yīng)產(chǎn)物，試圖通過添加底物黃嘌呤核苷來直接生成咖啡堿。但是結(jié)果未見有咖啡堿生成，僅pMAL-CaXMT-TM2/3/4的HPLC檢測結(jié)果顯示有可可堿生成。本研究嘗試以黃嘌呤核苷為反應(yīng)底物，通過串聯(lián)共表達(dá)系統(tǒng)中CaXMT和TMX的共同作用，進(jìn)行酶促反應(yīng)生物合成咖啡堿和可可堿，將對探索生物合成咖啡堿和可可堿起到一定作用。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

菌株E.coliBL21(DE3)pLysS和E.colitransT1購自北京全式金公司；菌株pMAL-CaXMT-TCS1和pMAL-TMX由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹生物學(xué)與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；質(zhì)粒pMD19-T 購自TaKaRa公司。

1.2 試劑與儀器

1.2.1主要試劑 rTaq酶、PrimeSTAR?HS DNA Polymerase、T4 DNA Ligase Polymerase購自TaKaRa公司，限制性內(nèi)切酶SalI、SbfI、NotI購自Fermentas公司，DNA Marker、Protein MarkerⅡ購自北京全式金公司，質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自Axygen公司，氨芐青霉素、氯霉素、IPTG購自上海生工生物工程有限公司。液相色譜所用試劑均為色譜級，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2.2 主要儀器 高效液相色譜儀、粒徑5 μm的ODS 250 mm × 4.6 mm C18反相柱，美國Waters公司；電子分析天平，METILER TOLEDO公司；PCR 儀、凝膠成像系統(tǒng)、Power PAC 3000電泳儀，美國Bio-Rad公司；超聲波細(xì)胞破碎儀，寧波新芝儀器研究所；高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1TCS1突變體TMX基因的克隆與測序 突變體TMX突變位置與TCS1相比，分別為TM1 673CGT→CAT；TM2 949GTT→ATG，TM3 811TTT→TGG；TM4 814GCA→CCA(Jin et al，2014)。據(jù)GenBank報(bào)道的TCS1基因ORF序列，設(shè)計(jì)一對擴(kuò)增引物，在上游引物5′端引入SalI酶切位點(diǎn)，下游引物5′端引入SbfI酶切位點(diǎn)。上游引物TM-F為5′-ATAGTCGACATGGACCTAGCTACTGCGG-3′,下游引物TM-R為5′-CTCCCTGCAGGCTATCCATCAATCTTG-G-3′，分別以提取的TMX質(zhì)粒為模板，按照PrimeSTAR?HS DNA Polymerase說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠檢測，用Axygen公司膠回收試劑盒純化目的基因片段。將目的基因連接到克隆載體pMD19-T上，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞transT1中經(jīng)菌落PCR檢測，挑取陽性菌落送Invitrogen公司測序。

1.3.2 pMAL-CaXMT-TMX表達(dá)載體的構(gòu)建 測序正確的單菌落和pMAL-CaXMT-TCS1進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒PMD19-TM1/2/3/4和pMAL-CaXMT-TCS1，用限制性內(nèi)切酶SalI和SbfI進(jìn)行雙酶切，回收目的基因片段TMX和表達(dá)載體片段pMAL-CaXMT。使用T4 DNA Ligase Polymerase 對兩個(gè)回收片段進(jìn)行過夜連接，并轉(zhuǎn)入E.colitransT1感受態(tài)細(xì)胞， 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，通過含氨芐青霉素的LB平板進(jìn)行篩選，挑取陽性菌落送Invitrogen公司測序。使用DNASTAR軟件對結(jié)果進(jìn)行序列對比分析。

圖 1 pMAL-CaXMT-TMX串聯(lián)表達(dá)載體構(gòu)建流程圖Fig. 1 Construction of tandem gene coexpression vector

圖 2 pMAL-CaXMT-TM1/2/3/4誘導(dǎo)蛋白SDS-PAGE電泳圖 A. pMAL-CaXMT-TM1/2誘導(dǎo)蛋白SDS-PAGE電泳圖 [1. 蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量(120 kD)； 2, 4, 8. pMAL-c5X、pMAL-CaXMT-TM1、pMAL-CaXMT-TM2誘前總蛋白； 3, 5, 9. MBP、pMAL-CaXMT-TM1、pMAL-CaXMT-TM2誘后總蛋白； 6, 10. pMAL-CaXMT-TM1、pMAL-CaXMT-TM2誘后可溶性蛋白； 7, 11. pMAL-CaXMT-TM1、pMAL-CaXMT-TM2誘后包涵體蛋白]。B. pMAL-CaXMT-TM3/4誘導(dǎo)蛋白SDS-PAGE電泳圖 [1. 蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量(120 kD)； 2, 6. pMAL-CaXMT-TM3、pMAL-CaXMT-TM4誘導(dǎo)前總蛋白； 3, 7. pMAL-CaXMT-TM3、pMAL-CaXMT-TM4誘導(dǎo)后總蛋白； 4, 8. pMAL-CaXMT-TM3、pMAL-CaXMT-TM4誘后可溶性蛋白； 5,9. pMAL-CaXMT-TM3、 pMAL-CaXMT-TM4誘后包涵體蛋白]。 Fig. 2 SDS-PAGE analysis of the induced pMAL-CaXMT-TM1/2/3/4 expression A. SDS-PAGE analysis of the induced pMAL-CaXMT-TM1/2 [1. Protein Marker Ⅱ 120 kD; 2, 4, 8. Total protein of pMAL-c5X, pMAL-CaXMT-TM1,pMAL-CaXMT-TM2 uninduced; 3, 5, 9. Total protein of MBP, pMAL-CaXMT-TM1, pMAL-CaXMT-TM2 induced; 6, 10. pMAL-CaXMT-TM1, pMAL-CaXMT-TM2 supernatant of lysate after sonication; 7, 11. pMAL-CaXMT-TM1, pMAL-CaXMT-TM2 precipitation of lysate after sonication]. B. SDS-PAGE analysis of the induced pMAL-CaXMT-TM3/4 expression [1. Protein Marker Ⅱ (120 kD); 2,6. Total protein of pMAL-CaXMT-TM3, pMAL-CaXMT-TM4 uninduced; 3, 7. Total protein of pMAL-CaXMT-TM3, pMAL-CaXMT-TM4 induced; 4, 8. pMAL-CaXMT-TM3, pMAL-CaXMT-TM4 supernatant of lysate after sonication; 5, 9. pMAL-CaXMT-TM3, pMAL-CaXMT-TM4 precipitation of lysate after sonication].

1.3.3 串聯(lián)融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 表達(dá)過程參考金璐(2012)，操作過程為提取重組表達(dá)載體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株E.coliBL21(DE3)pLysS中，涂布到含氨芐青霉素(50 μg·mL-1)和氯霉素(50 μg·mL-1)的 LB平板上。篩選陽性菌落于3 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩過夜培養(yǎng)。取800 μL過夜菌液接種于40 mL LB培養(yǎng)基，繼續(xù)37 ℃振蕩培養(yǎng)，至檢測 OD值為0.6～0.8，取1 mL菌液作為誘前對照，然后加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG，16 ℃下振蕩培養(yǎng)20 h。誘導(dǎo)結(jié)束后，取菌液在4 ℃，6 000 r·min-1條件下離心20 min，制樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。

1.3.4 體外酶促反應(yīng)活性的檢測 誘導(dǎo)結(jié)束經(jīng)冷凍離心得菌體，加4 mL Lysis Buffer(現(xiàn)加DTT,終濃度為5 mmol·L-1) 重懸菌體。冰浴條件下超聲破碎后，4 ℃，12 000 r·min-1離心15 min,得上清即為粗酶液。1.5 mL酶反應(yīng)體系：156 μmol·L-1黃嘌呤核苷，749 μmol·L-1S-腺苷甲硫氨酸，200 μmol·L-1MgCl2,加粗酶液補(bǔ)至1.5 mL。反應(yīng)在30 ℃下進(jìn)行，分別于2、4、8 h取反應(yīng)液500 μL，通過0.22 μm水相濾膜，進(jìn)行HPLC檢測。以pMAL-c5X空載體相同處理做對照。

高效液相色譜檢測條件：流速1 ml·min-1；流動(dòng)相中，A相為0.2 %乙酸，B相為純乙腈；線性變化范圍為0～4 min，A相95%，B相5%；4～10 min，A相40%，B相60%；10～13 min，A相95%，B相5%；13～30 min，A相95%，B相5%。紫外檢測器吸收波長為274 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 TM1/2/3/4基因的克隆

以質(zhì)粒為模板，用引物TM-F和TM-R對TMX基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1.2%的瓊脂糖凝膠檢測。分子量在1 000 bp 偏上出現(xiàn)一條較為明亮的條帶，為目的產(chǎn)物條帶，其大小與TCS1基因ORF的長度1 110 bp相符。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、測序，測序結(jié)果同原TMX相同。

2.2 pMAL-CaXMT-TM1/2/3/4串聯(lián)表達(dá)載體的構(gòu)建

提取PMD19-TM1/2/3/4質(zhì)粒和pMAL-CaXMT-TCS1質(zhì)粒，分別用限制性內(nèi)切酶SalI和SbfI進(jìn)行雙酶切，并對目的基因片段TMX和表達(dá)載體片段pMAL-CaXMT進(jìn)行膠回收。其中分子量在1 000 bp偏上的條帶為TMX條帶，分子量在2 000 bp以上的條帶為表達(dá)載體片段條帶。

將目的基因片段連接到表達(dá)載體，得重組質(zhì)粒pMAL-CaXMT-TM1/2/3/4(圖1)，并轉(zhuǎn)化至transT1感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR檢測，篩選陽性菌落送公司測序。結(jié)果通過軟件分析，正確即構(gòu)成pMAL-CaXMT-TM1/2/3/4串聯(lián)表達(dá)載體，可用于之后融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。

2.3 串聯(lián)表達(dá)載體融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

重組質(zhì)粒pMAL-CaXMT-TM1/2/3/4轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)pLysS，經(jīng)初步培養(yǎng)和擴(kuò)大培養(yǎng)，利用IPTG誘導(dǎo)目的蛋白和載體標(biāo)簽子MBP的融合表達(dá)，16 ℃時(shí)可使誘導(dǎo)后融合蛋白大量表達(dá)在上清中。融合蛋白的SDS-PAGE檢測(圖2)顯示在81 kD左右位置有明顯的外源蛋白條帶，減去誘導(dǎo)后蛋白大小為40 kD的表達(dá)載體pMAL-c5X標(biāo)簽子MBP，可推算出實(shí)際蛋白大小為41 kD，與已知CaXMT和TMX的蛋白理論值大小41.8 kD和41.3 kD相符。由于兩個(gè)串聯(lián)基因蛋白大小相近，兩個(gè)目的基因蛋白條帶疊加在一起，表現(xiàn)出一條較粗的條帶。

圖 3 pMAL-CaXMT-TMX體外酶活性的HPLC分析A. 對照組； B. pMAL-CaXMT-TM1； C. pMAL-CaXMT-TM2；D. pMAL-CaXMT-TM3； E. pMAL-CaXMT-TM4。Fig. 3 In vitro activity analysis of pMAL-CaXMT-TMX by HPLC A. Control group; B. pMAL-CaXMT-TM1; C. pMAL-CaXMT-TM2; D. pMAL-CaXMT-TM3; E. pMAL-CaXMT-TM4.

2.4 體外酶活性的HPLC檢測

CaXMT基因和TMX基因串聯(lián)表達(dá)的體外酶促反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)HPLC檢測，結(jié)果見圖3。對照標(biāo)品，對照組CK既無7-甲基黃嘌呤生成，也無咖啡堿生成(圖3：A)。與對照組相比，樣品組添加的XR均減少。樣品組pMAL-CaXMT-TM1體外酶促反應(yīng)產(chǎn)物僅有7-甲基黃嘌呤生成(圖3：B)，由圖3：C、D、E可以看出樣品組pMAL-CaXMT-TM2/3/4體外酶促反應(yīng)產(chǎn)物均有可可堿(Tb)生成，但是產(chǎn)物未見咖啡堿(Cf)生成。

3 討論

咖啡堿合成酶突變體TMX的單獨(dú)表達(dá)中，體外活性檢測結(jié)果顯示，TM1只能催化7-甲基黃嘌呤生成可可堿，TM2/3/4均能催化7-甲基黃嘌呤生成可可堿和咖啡堿，但是咖啡堿含量較低(李萌萌等，2014)。本研究構(gòu)建的pMAL-CaXMT-TMX大腸桿菌串聯(lián)表達(dá)系統(tǒng)，成功誘導(dǎo)雙基因融合蛋白表達(dá)后，HPLC檢測活性結(jié)果顯示，體外酶促反應(yīng)產(chǎn)物均無咖啡堿生成，但pMAL-CaXMT-TM2/3/4體外酶促反應(yīng)產(chǎn)物均有可可堿生成。這與預(yù)期的結(jié)果有一定偏差，可能存在以下原因：一是兩個(gè)基因的表達(dá)不均衡引起，即兩個(gè)基因串聯(lián)在同一表達(dá)載體中，前一個(gè)基因被選擇性過表達(dá)，后一個(gè)基因表達(dá)偏低造成的(Lee & khosla, 2007)。Lee & khosla (2007)成功實(shí)現(xiàn)了多個(gè)基因在大腸桿菌中的共表達(dá)，并且通過添加底物和誘導(dǎo)劑進(jìn)行低溫誘導(dǎo)后檢測到目的產(chǎn)物，但是產(chǎn)量偏低。劉新平等(1996)構(gòu)建的雙順反子表達(dá)載體，通過減小第一順反子基因的大小來增加目的蛋白的表達(dá)量。二是兩個(gè)基因串聯(lián)共用一個(gè)啟動(dòng)子，無法實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的分別調(diào)控。何彰華等(2011)構(gòu)建的多基因串聯(lián)共表達(dá)載體，每個(gè)基因帶有各自的啟動(dòng)子，利用同尾酶組合實(shí)現(xiàn)四個(gè)基因串聯(lián)共表達(dá)，且可以通過改變各基因啟動(dòng)子的強(qiáng)弱，進(jìn)而調(diào)節(jié)各基因的表達(dá)量。

共表達(dá)系統(tǒng)包括多質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和多順反子系統(tǒng)(趙志虎等，2000)，該研究中雙基因串聯(lián)共表達(dá)系統(tǒng)屬于多順反子系統(tǒng)，是將兩個(gè)基因通過一個(gè)共用酶切位點(diǎn)先后串聯(lián)到pMAL-c5X表達(dá)載體上。該系統(tǒng)中兩個(gè)基因有各自的翻譯起始及終止信號，能獨(dú)立翻譯，實(shí)現(xiàn)了雙基因在大腸桿菌中融合蛋白的可溶性表達(dá)，避免了多質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中需要添加多種抗生素來篩選標(biāo)記。

目前，有關(guān)研究已經(jīng)明確了咖啡堿在植物中的生物合成途徑，但是鮮有關(guān)于生物合成咖啡堿應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)的報(bào)道。本研究初步探索了通過添加底物XR和甲基供體SAM，應(yīng)用大腸桿菌雙基因共表達(dá)系統(tǒng)來生物合成咖啡堿和可可堿，但是并未達(dá)到預(yù)期結(jié)果，反應(yīng)產(chǎn)物只檢測到可可堿。因此，要達(dá)到生物合成咖啡堿的目的，還需要做很多后續(xù)研究。接下來可以從改造現(xiàn)有的表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)多基因共表達(dá)，并且促進(jìn)各基因均衡表達(dá)等進(jìn)行深入研究。

ASHIHARA H, SANO H, CROZIER A, 2008. Caffeine and related purine alkaloids：biosynthesis, catabolism, function and genetic engineering [J]. Phytochemistry, 69:841-856.

ASHIHARA H, CROZIER A, 1999. Biosynthesis and metabolism of caffeine and related purine alkaloids in plants [J]. Adv Bot Res, 30: 117-205.

ASHIHARA H, MONTERIO AM, GILLIES FM, et al, 1996. Biosynthesis of caffeine in leaves of coffee [J]. Plant Physiol, 111: 747-753.

HE ZH, WANG Y, ZHAO J, et al, 2011. Construction of a vector suitable for the tandem coexpression of multiple genes by a single plasmid [J]. Chin Biotechnol, 31(1): 40-45. [何彰華, 王洋, 趙珺, 等, 2011. 一種多基因串聯(lián)共表達(dá)載體的構(gòu)建 [J]. 中國生物工程雜志, 31(1): 40-45.]

JIN L, 2012. Research on caffeine biosynthesis and molecular regulation of tea [D]. Hefei: Anhui Agricultural University: 20-22. [金璐, 2012. 茶樹咖啡堿生物合成途徑研究及其分子調(diào)控 [D]. 合肥: 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士畢業(yè)論文: 20-22.]

KOSHIISHIA C, KATOA A, YAMAB S, et al, 2001. A new caffeine biosynthetic pathway in tea leaves: utilisation of adenosine released from the S-adenosyl-L-methionine cycle [J]. FEBS Lett, 499: 50-54.

KATO M, KANEHARA T, SHIMIZU H, et al, 1996. Caffeine biosynthesis in young leaves ofCamelliasinensis:invitrostudies on N-methyltransferase activity involved in the conversion of xanthosine to caffeine [J]. Physiol Plant, 98: 629-636.

KATO M, MIZUNO K, FUJIMURA T, et al, 1999. Purification and characterization of caffeine synthase from tea leaves [J]. Plant Physiol, 120(2): 579-586.

LU JIN, BHUIYA MW, MENGMENG LI, et al, 2014. Metabolic engineering of saccharomyces cerevisiae for caffeine and theobromine production [J]. PLoS ONE, 9(8): 1-11.

LI MM, DENG WW, JIN L, et al, 2014. Site-directed mutagenesis for caffeine synthase gene(tcs1) ofCamelliasinensisand expressioninvitro[C]//SI ZM. The 16th annual meeting of China association for science and technology——proceedings of the 12th forum of young tea science scientists. Kunming: China Association for Science and Technology. [李萌萌, 鄧威威, 金璐, 等, 2014. 茶樹咖啡堿合成酶基因TCS1的定點(diǎn)突變及體外表達(dá)分析) [C]//司智敏. 第十六屆中國科協(xié)年會(huì)——分12茶學(xué)青年科學(xué)家論壇論文集. 昆明: 中國科學(xué)技術(shù)協(xié)會(huì).]

LEE H Y, KHOSLA C, 2007. Bioassay-guided evolution of glycosylated macrolide antibiotic in escherichia coli [J]. PLoS Biol, 5(2): 243-250.

LIU XP, CHEN SM, CHEN NC, et al, 1996. Construction and application of a dicistronic expression vector [J]. Prog Biochem Biophys, 23(2): 156-159. [劉新平, 陳蘇民, 陳南春, 等, 1996. 一種雙順反子表達(dá)載體的構(gòu)建及應(yīng)用的研究 [J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展), 23(2): 156-159.]

LI HX, CHEN R, ZHOU D, et al, 2011. Research progress on synthesis and pharmacological effects of caffeine [J]. W Chin J Pharm Sci, 43(3):243-253. [李海霞, 陳榕, 周丹, 等, 2011. 咖啡因的合成及其藥理作用的研究進(jìn)展 [J]. 華西藥學(xué)雜志, 26(2): 182-187.]

PLATRITIS P, ANDREOU E, PAPANDREOU D, 2013. Caffeine effect on exercise performance and disease issues: an updated mini review [J]. Nutri Food Sci, 43(3):243-253.

WALDHAUSER SSW, GILLIES FM, CROZIER A, et al, 1997. Separation of the N-7 methyltransferase, the key enzyme in caffeine biosynthesis [J]. Phytochemistry, 45(7): 1407-1414.

WAN XC, XIA T, ZHANG ZZ, et al, 2015. Secondary metabolism of tea plant [M]. Beijing: Science Press: 65-67. [宛曉春, 夏濤, 張正竹, 等, 2015. 茶樹次生代謝 [M]. 北京:科學(xué)出版社: 65-67.]WU MY, FAN FY, LIANG YR, et al, 2010. The physiological functions of caffeine and their related mechanisms [J]. Tea Sci, 30(4): 235-242. [吳命燕, 范方媛, 梁月榮, 等, 2010. 咖啡堿的生理功能及其作用機(jī)制 [J]. 茶葉科學(xué), 30(4): 235-242.]

ZHAO ZH, ZHANG YS, LIU CX, et al, 2000. New strategy for soluble expression of heterologous proteins inEscherichiacoli[J]. Lett Biotechnol, 11(3): 164. [趙志虎, 張用書, 劉傳暄, 等, 2000. 外源蛋白在大腸桿菌中可溶性表達(dá)的新策略 [J]. 生物技術(shù)通訊, 11(3): 164.]

Tandem coexpression of CaXMT and mutants ofTCS1 and analysis of enzyme activityinvitro

WU Xin, LI Meng-Meng, DENG Cheng, DENG Wei-Wei, ZHANG Zheng-Zhu*

( State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization， Anhui Agricultural University， Hefei 230036， China )

Caffeine and theobromine as the major component of alkaloids in tea, while caffeine is the important taste compound. As the application of caffeine increased extensively in the fields of food and medicine, caffeine biosynthesis becomes a new hotspot. Nowadays, exploring the method of caffeine biosynthesis is of great significance, when caffeine synthesis mainly relies on chemical synthesis on the market. This research concatenated coffee xanthosine methyltransferase gene (CaXMT) and four mutants of tea caffeine synthase gene (TCS1) respectively in the same expression vector pMAL-c5X, then induced coexpression of the fusion protein, which was analyzed by SDS-PAGE gel electrophoresis, and chromatography were added into the crude enzyme solution by sonication methionine. At last,invitroenzymatic reaction products were detected by high performance liquid. The results showed that only theobromine generated in the products of pMAL-CaXMT-TM2/3/4 without caffeine. This research provides the information for establishing tandem gene coexpression vector which was used for the biosynthesis of caffeine and theobromine and new ideas to study on caffeine biosynthesis.

caffeine, tandem gene coexpression,invitroactivity

10.11931/guihaia.gxzw201510003

2015-10-07

2015-12-08

國家自然科學(xué)基金 (31170649, 31570692) [Supported by the National Natural Science Foundation of China(31170649, 31570692)]。

武鑫(1989-)，女，陜西潼關(guān)人，碩士研究生，主要從事茶葉生物化學(xué)與天然產(chǎn)物研發(fā)方面的研究，(E-mail)348778774@qq.com。

*通訊作者： 張正竹，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事茶葉化學(xué)與加工、食品風(fēng)味化學(xué)領(lǐng)域的研究，(E-mail)zzz@ahau.edu.cn。

Q571.1

A

1000-3142(2016)12-1505-06

武鑫， 李萌萌， 鄧騁， 等.CaXMT和TCS1突變體基因串聯(lián)共表達(dá)及體外酶活檢測分析 [J]. 廣西植物， 2016， 36(12):1505-1510

WU X, LI MM, DENG C， et al. Tandem coexpression ofCaXMTand mutants ofTCS1 and analysis of enzyme activityinvitro[J]. Guihaia， 2016， 36(12):1505-1510