閆振，黃健垚，高路，王登良

1.廣東德高信食品加工有限公司，513000；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)系，510642

咖啡堿（1,3,7-三甲基黃嘌呤，Caffeine）是衍生于嘌呤核苷酸的一種嘌呤生物堿，已被發(fā)現(xiàn)存在于茶、咖啡和可可等60多種不同的植物中[1]。含咖啡堿植物一方面通過化感或自毒作用從種皮中釋放咖啡堿到土壤中從而抑制鄰近植物種子的萌發(fā)[2]；另一方面通過化學(xué)防御作用抵御捕食性動(dòng)物采食其嫩葉、果實(shí)等[3]。咖啡堿作為一種行為活性物質(zhì)被廣泛使用，并有很大一部分人在飲食中長(zhǎng)期使用咖啡堿?？Х葔A是茶葉滋味物質(zhì)的主要組成成分，除了其本身的苦味之外，還可與茶黃素、茶紅素以氫鍵締合形成絡(luò)合物提高茶湯品質(zhì)[4-5]。飲茶則有興奮神經(jīng)中樞、緩解疲勞、助消化、強(qiáng)心解痙和利尿等功效[6]。茶樹中的咖啡堿主要集中分布在新梢中，且以鮮嫩的芽葉含量最高，并隨芽葉的老化而逐漸減少，這種分布規(guī)律與咖啡堿在茶樹體內(nèi)的生物合成與代謝機(jī)制密切相關(guān)[7]。本文綜述了茶樹中咖啡堿的生物代謝研究進(jìn)展，包括咖啡堿在茶樹中的含量分布、生物合成與分解代謝途徑以及相關(guān)基因的表達(dá)研究。

一、咖啡堿在茶樹體內(nèi)的生物合成

1.咖啡堿在茶樹中的分布

茶樹中的咖啡堿主要分布在葉組織并集中在新梢中，尤其以一葉中含量最高并隨葉質(zhì)的老化而逐漸降低。除葉片外，茶花、茶樹莖梗、茶籽和根部也含有咖啡堿，但其含量甚微[8]。茶花的花瓣和雄蕊可以合成咖啡堿，且在茶花盛開前期的生物合成活性最高[9]；莖梗中的咖啡堿以莖上部分居多并隨著莖梗的硬化而呈下降趨勢(shì)，莖下部含量?jī)H為0.01%左右；在茶樹果實(shí)即茶籽完全成熟之前，咖啡堿的含量在顯著增加[10]，但茶籽中的咖啡堿只分布在種皮中，占鮮重的0.09%左右；根部不足0.01%（表1）。Ashihara 等[8]通過[8-14C]腺嘌呤示蹤實(shí)驗(yàn)證明咖啡堿的合成主要發(fā)生在茶樹幼葉中并在葉片中積累，并發(fā)現(xiàn)咖啡堿的合成前體可可堿主要存在于茶樹嫩梢中；大量的[8-14C]腺嘌呤在茶樹幼葉中合成可可堿并進(jìn)一步合成咖啡堿；茶樹體內(nèi)超過99%的咖啡堿存在于葉片中。

茶樹中咖啡堿的含量與茶樹品種、外部環(huán)境因子如季節(jié)、溫度、光照和土壤條件等有關(guān)。王紹梅等[11]對(duì)越南大葉、安溪水仙、黔湄等12份茶樹品種的烘干茶葉咖啡堿含量測(cè)定表明，越南大葉含咖啡堿含量最高（4.96%），安溪水仙最低（3.41%），從而證明大葉種茶樹一般比中小葉種茶樹的咖啡堿含量高，喬木型茶樹（4.54%）一般比小喬木型（4.16%）和灌木型茶樹（4.33%）的咖啡堿含量高。對(duì)春夏秋不同季節(jié)茶葉的咖啡堿含量測(cè)定表明，夏季鮮葉所制茶樣中的咖啡堿含量（4.7%）一般比春季茶葉（4.5%）和秋季茶葉（4.2%）含量高。這與夏季溫度高，茶樹體內(nèi)生物代謝旺盛密切相關(guān)[12]。生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)和科學(xué)研究表明，適當(dāng)遮陰一方面可抑制咖啡堿的分解，另一方面可促進(jìn)茶樹新梢中咖啡堿的合成，顯著提高茶葉中咖啡堿的含量[13]。礦質(zhì)元素是生命體生長(zhǎng)的必要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，鎂離子作為生物蛋白酶的激活劑在生物學(xué)反應(yīng)中起著重要的作用，S-腺苷蛋氨酸是生物堿合成過程中重要的甲基供體，而鎂離子則是促進(jìn)蛋氨酸活化酶催化合成S-腺苷蛋氨酸的必要激活因子。鉬離子是酸式磷酸酶的專一性抑制劑，也是硝酸還原酶的輔基，對(duì)氮代謝有明顯的影響，實(shí)驗(yàn)表明用較高濃度鉬離子處理后的茶苗其咖啡堿含量會(huì)明顯上升[7]。

表1 茶樹幼苗不同組織中咖啡堿含量%

2.咖啡堿在茶樹體內(nèi)的合成途徑

（1）從黃苷到咖啡堿的合成

研究者們通過14C同位素示蹤、底物專一性和重組N-甲基轉(zhuǎn)移酶等實(shí)驗(yàn)對(duì)茶樹、咖啡等植物體內(nèi)的咖啡堿代謝反應(yīng)研究證明，咖啡堿的骨架——黃嘌呤來自于嘌呤核苷，咖啡堿的主要合成過程由1步核苷酶反應(yīng)和3步甲基化反應(yīng)完成，其主要合成途徑為：黃苷→7-甲基黃苷→7-甲基黃嘌呤→可可堿（3,7-二甲基黃嘌呤）→咖啡堿（1,3,7-三甲基黃嘌呤）（圖1）[14-15]。

圖1 咖啡堿合成途徑

在黃苷-N-甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，黃苷的7-N-甲基化并轉(zhuǎn)化為7-甲基黃苷；7-甲基黃苷在黃苷酶的催化下水解生成7-甲基黃嘌呤；7-甲基黃嘌呤經(jīng)可可堿合成酶（單甲基黃嘌呤-N-甲基轉(zhuǎn)移酶）的作用進(jìn)一步甲基化轉(zhuǎn)化成可可堿；最后，可可堿在咖啡堿合成酶（二甲基黃嘌呤-N-甲基轉(zhuǎn)移酶）的催化作用下進(jìn)行第三步甲基化最終生成咖啡堿。

Ashihara 等[16]發(fā)現(xiàn)在茶樹幼葉中還存在另外2條咖啡堿合成路徑，其一為：黃嘌呤→3-甲基黃嘌呤→茶堿→咖啡堿；其二為：黃苷→7-甲基黃苷→7-甲基黃嘌呤→副黃嘌呤→咖啡堿。體外研究發(fā)現(xiàn)，以副黃嘌呤為底物，咖啡堿合成酶的催化活性最高，表明相對(duì)于可可堿和7-甲基黃嘌呤，副黃嘌呤是咖啡堿合成酶的最佳底物。但是，同位素示蹤實(shí)驗(yàn)表明，在茶樹體內(nèi)，咖啡堿的合成以催化可可堿為主，幾乎不經(jīng)過副黃嘌呤[17]。

（2）黃苷的合成

黃苷是嘌呤生物堿合成的起始底物，目前已發(fā)現(xiàn)4條合成途徑：腺嘌呤核苷酸合成途徑（AMP途徑）、鳥嘌呤核苷酸途徑（GMP途徑）、S-腺苷-L-蛋氨酸循環(huán)途徑（SAM途徑）以及二次利用途徑（De novo途徑）[18]（圖1）。

用于咖啡堿合成的黃苷有一部分來自于腺嘌呤和鳥嘌呤核苷酸池，這些核苷酸池是通過二次利用和補(bǔ)救途徑產(chǎn)生的。

AMP途徑：AMP（腺嘌呤核苷酸）→IMP（副黃苷酸）→XMP（黃苷酸）→黃苷，其過程為AMP 在脫氨酶的作用下脫去氨基轉(zhuǎn)化為IMP，IMP在脫氫酶的作用下生成XMP，繼而在5'-核苷酶的作用下生成黃苷[17]。

GMP途徑：GMP（鳥嘌呤核苷酸）→鳥苷→黃苷，其過程為GMP 經(jīng)5'-核苷酶的催化生成鳥苷，繼而在脫氨酶的作用下生成黃苷。鳥苷除了生成黃苷進(jìn)入嘌呤堿合成途徑，還有一部分在鳥苷核苷酶的作用下轉(zhuǎn)化為鳥嘌呤進(jìn)入鳥嘌呤核苷酸池[19]。

SAM途徑：腺苷→AMP→IMP→XMP→黃苷，SAM是咖啡堿合成途徑中3步甲基化反應(yīng)的甲基供體。在此過程中，SAM被轉(zhuǎn)化為S-腺苷-L-半胱氨酸（SAH），然后水解為半胱氨酸和腺苷。半胱氨酸通過SAM 循環(huán)途徑來補(bǔ)救SAM 水平，腺苷則從循環(huán)中釋放出來繼而直接轉(zhuǎn)化為AMP，AMP進(jìn)入黃苷合成途徑或先經(jīng)腺苷核苷酶作用轉(zhuǎn)化為腺嘌呤，再經(jīng)腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶作用轉(zhuǎn)化為AMP進(jìn)入黃苷合成途徑。腺苷除了生成AMP進(jìn)入嘌呤堿合成途徑，還有一部分在腺苷核苷酶的作用下轉(zhuǎn)化為腺嘌呤進(jìn)入腺嘌呤核苷酸池[18]。

De novo途徑：IMP→XMP→黃苷，在茶樹嫩葉中，5'-核苷酶催化甘氨酸生成IMP，IMP在脫氫酶的作用下生成XMP，繼而在5'-核苷酶的作用下生成黃苷。其中，IMP脫氫酶是該途徑的控速因子，決定了De novo途徑的效率[20]。

二、咖啡堿在茶樹體內(nèi)的分解代謝

咖啡堿的分解代謝最早發(fā)現(xiàn)于咖啡植物體內(nèi)，隨后大量的14C同位素標(biāo)記示蹤實(shí)驗(yàn)證明咖啡堿在茶樹等植物體中的分解首先經(jīng)過3步脫甲基化轉(zhuǎn)化為黃嘌呤，即咖啡堿→茶堿→3-甲基黃嘌呤→黃嘌呤；繼而，黃嘌呤通過傳統(tǒng)的嘌呤代謝途徑最終分解為CO2和NH3，即黃嘌呤→尿酸→尿囊素→尿囊酸→尿素→CO2和NH3[20]（圖2）。

咖啡堿（1,3,7-三甲基黃嘌呤）首先在7-N-脫甲基酶的作用下脫去7-甲基轉(zhuǎn)化為茶堿（1,3-二甲基黃嘌呤）；茶堿經(jīng)1-N-脫甲基酶的催化再脫去1-甲基生成3-甲基黃嘌呤；在3-N-脫甲基酶的作用下，3-甲基黃嘌呤脫去3-N-甲基后轉(zhuǎn)化為黃嘌呤?？Х葔A轉(zhuǎn)化為黃嘌呤的分解途徑在茶樹等植物體和動(dòng)物體中是相同的，但黃嘌呤的進(jìn)一步分解因物種的不同而存在差異。在茶樹等植物體內(nèi)，黃嘌呤最初經(jīng)黃嘌呤脫氫酶氧化生成尿酸；尿酸繼而被尿酸氧化酶氧化成尿囊素；在尿囊素酶的催化下，尿囊素水解為尿囊酸；進(jìn)一步在尿囊酸酶的作用下，水解生成尿素和乙醛酸；尿素在尿酶的作用下最終分解生成CO2和NH3。咖啡堿等嘌呤生物堿在茶樹體內(nèi)的分解代謝主要發(fā)生在老葉中，產(chǎn)生的尿酸、尿囊素可以從茶葉中轉(zhuǎn)運(yùn)出來，作為儲(chǔ)備物質(zhì)供再次利用。而人和動(dòng)物體內(nèi)因缺少尿囊素酶、尿囊酸酶和尿酶等一系列酶，故分解尿酸的能力不及植物，常以尿酸為代謝產(chǎn)物排出體外[17]。

圖2 咖啡堿分解代謝途徑

[8-14C]示蹤實(shí)驗(yàn)證明茶堿分解代謝的速度比咖啡堿快，這說明咖啡堿轉(zhuǎn)化為茶堿的過程是咖啡堿分解代謝途徑中主要的控速因子，也是咖啡堿在茶葉中積累的重要原因。另一方面，從咖啡堿的合成和分解過程可以明確咖啡堿的代謝與核酸特別是嘌呤核苷酸、蛋白質(zhì)的代謝密切相關(guān)，故而在核酸、蛋白質(zhì)代謝旺盛的茶樹新梢中，咖啡堿合成代謝旺盛、分解代謝緩慢，故含量高。隨著葉質(zhì)的老化，核酸、蛋白質(zhì)的分解代謝加強(qiáng)，咖啡堿的合成代謝減慢并以分解代謝為主，因此，老葉中的咖啡堿含量比新梢中的低。

三、咖啡堿合成酶基因

S-腺苷-L-蛋氨酸（SAM）廣泛分布在生物體內(nèi)，是嘌呤堿發(fā)生甲基化的甲基供體。而保守結(jié)構(gòu)域A、B和C是大多數(shù)植物中甲基供體SAM的靶基因結(jié)合位點(diǎn)，在識(shí)別嘌呤環(huán)N-甲基化位置和催化甲基化反應(yīng)中起著重要的作用[21]?？Х葔A的生物合成包括3步甲基化過程，由3種不同的SAM依賴型N-甲基轉(zhuǎn)移酶催化完成。根據(jù)其底物特異性可分為3種類型[22]：7-甲基黃苷合成酶（催化黃苷形成7-甲基黃苷）、可可堿合成酶（3,7-二甲基黃嘌呤合成酶，催化7-甲基黃嘌呤形成可可堿）、咖啡堿合成酶（1,3,7-三甲基黃嘌呤合成酶，催化可可堿形成咖啡堿）。

7-甲基黃苷合成酶是一類底物專一性的酶，參與第一步甲基化反應(yīng)催化黃苷形成7-甲基黃苷。Mizuno 等[23]第一次從咖啡葉片中克隆得到7-甲基黃苷合成酶基因（CmXRS1），其編碼cDNA序列長(zhǎng)1 307對(duì)堿基，編碼372個(gè)氨基酸。

第二步甲基化反應(yīng)是7-甲基黃嘌呤轉(zhuǎn)化為可可堿，由可可堿合成酶催化完成。Suzuki 等[24]在茶葉粗提取物中首次發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了7-甲基黃嘌呤N-甲基轉(zhuǎn)移酶（可可堿合成酶）和可可堿N-甲基轉(zhuǎn)移酶（咖啡堿合成酶）的催化活性。可可堿合成酶也具有底物專一性，僅催化7-甲基黃嘌呤發(fā)生3-N-甲基化并轉(zhuǎn)化為可可堿。在咖啡植物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的可可堿合成酶編碼基因有CTS1、CaMXMT1、CTS2、CaMXMT2和BTS1等，其氨基酸序列相似度達(dá)80%，均具有保守的SAM 結(jié)合位點(diǎn)A、B'、C和YFFF等結(jié)構(gòu)域[14,25]。CgcTS基因是從廣西大瑤山禿房茶品種（Camellia gymnogynaChang）茶樹幼葉中克隆得到的1個(gè)可可堿合成酶基因，當(dāng)以不同的嘌呤衍生物為底物時(shí)，CgcTS蛋白酶催化7-甲基黃嘌呤的活性最高，其次是黃苷，而以可可堿、咖啡堿和茶堿為底物時(shí)，該酶未顯示出活性。另外，CgcTS基因在mRNA 水平和蛋白水平的表達(dá)模式是一致的，兩者均在幼嫩的一葉中表達(dá)水平高而在老化的第四葉中表達(dá)水平低，這與可可堿在禿房茶中的分布規(guī)律也是一致的[26]。

咖啡堿合成酶參與咖啡堿生物合成的最后兩步，既可催化7-甲基黃嘌呤轉(zhuǎn)化為可可堿，也可催化可可堿形成咖啡堿。TCS1是最初從茶樹（Camellia sinensis）幼葉中提取純化得到的咖啡堿合成酶，其編碼cDNA 由1 483對(duì)堿基組成，編碼369個(gè)氨基酸。體外實(shí)驗(yàn)證明TCS1的底物特異性與純化的天然酶十分相似，主要催化單甲基黃嘌呤和二甲基黃嘌呤的3-N-甲基化和1-N-甲基化，即以7-甲基黃嘌呤為底物催化發(fā)生3-N-甲基化形成可可堿，以可可堿為底物催化發(fā)生1-N-甲基化形成咖啡堿。此外，TCS1基因在幼葉中的轉(zhuǎn)錄水平很高，而在老葉中的轉(zhuǎn)錄水平極低，TCS1的基因表達(dá)模式和TCS1酶活特性與咖啡堿在茶葉中的含量分布是一致的[27-29]。

此外，一些茶種體內(nèi)的生物堿以可可堿為主，如可可茶、后軸茶、紅芽茶和禿房茶，這些茶樹體內(nèi)的咖啡堿含量顯著低于可可堿的含量。Yoneyama 等[30]在這些高可可堿低咖啡堿茶樹中發(fā)現(xiàn)盡管其咖啡堿合成酶氨基酸序列與咖啡植物有高達(dá)80%的相似性，但同源性較低，咖啡堿合成酶在這些茶種中可能只具有3-N-甲基化活性而不具有1-N-甲基化活性。HycCS1和CctCS1分別是從低咖啡堿的紅芽茶品種和可可茶品種中克隆得到的咖啡堿合成酶基因，其cDNA序列均為1 098 bp，編碼365個(gè)氨基酸，僅第227位（Glu227Lys）和第287位（Arg287His）氨基酸不同。其編碼蛋白酶HycCS1和CctCS1均只能催化可可堿的形成而不能以可可堿為底物合成咖啡堿，而HycCS1的催化活性要高于CctCS1[31]。與TCS1相比，HycCS1和CctCS1的第221位氨基酸均為組氨酸，TCS1的為精氨酸，而組氨酸在茶樹體中扮演著重要的底物識(shí)別作用[31]，這與HycCS1和CctCS1只具有3-N-甲基化活性催化7-甲基黃嘌呤形成可可堿而無法進(jìn)一步形成咖啡堿有著重要的關(guān)系。

四、展望

咖啡堿對(duì)人類的精神運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知能力有積極的影響，包括在習(xí)慣性攝入低至中等劑量咖啡堿的情況下提高警覺性、能量和興奮；相反，高劑量的咖啡堿會(huì)引起諸如血壓升高、緊張、心悸、焦燥不安、失眠和胚胎畸形等負(fù)面影響，且長(zhǎng)期食用會(huì)使人產(chǎn)生依賴感，不適于兒童、孕婦、老人及神經(jīng)衰弱者[6,32]。而低咖啡堿茶產(chǎn)品可以滿足這些特殊人群對(duì)茶葉的需求，也可充分發(fā)揮茶葉的保健功效。因此，低咖啡堿茶產(chǎn)品越來越受到茶葉市場(chǎng)的重視。目前國(guó)內(nèi)外主流的脫茶葉咖啡堿的方法是利用物理、化學(xué)、生化等加工工藝，但這些方法多用于深加工茶產(chǎn)品，加工成本較高且存在一定的溶劑殘留，在很大程度上影響成品茶的感官品質(zhì)[33]。而福建南部山區(qū)的紅芽茶、廣東南昆山的可可茶、廣西大瑤山的禿房茶等則是天然的低咖啡堿高可可堿茶樹資源，其成品茶不僅可以避免過多攝入咖啡堿帶來的負(fù)面影響還省去了脫咖啡堿的加工成本[26,31]。此外，這些低咖啡堿茶樹因其又富含可可堿和非表型兒茶素而具有較突出的抗氧化等生物活性和抗炎等保健功效。茶樹等植物體內(nèi)包括嘌呤核苷酸代謝、細(xì)胞間易位和在特定細(xì)胞部位（如葉綠體和液泡）積累的咖啡堿合成與分解的細(xì)胞代謝機(jī)制已經(jīng)明確。這為研究天然低咖啡堿茶樹資源的咖啡堿代謝機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)，同時(shí)為繁育天然低咖啡堿茶樹品種提供了技術(shù)支持。