楊 華，王 倩，林 霞，唐 星*

(1. 沈陽藥科大學 藥學院，遼寧 沈陽 110016; 2. 江南大學 藥學院，江蘇 無錫 214122)

單分散型艾塞那肽緩釋微球的制備及體外評價

楊 華1，王 倩1，林 霞2，唐 星1*

(1. 沈陽藥科大學 藥學院，遼寧 沈陽 110016; 2. 江南大學 藥學院，江蘇 無錫 214122)

目的制備不同粒徑單分散型載艾塞那肽聚乳酸-羥基乙酸共聚物（polylactic-co-glycolic acid, PLGA）微球，考察粒徑對包封率及體外釋放的影響。方法采用快速膜乳化法結合復乳法制備微球，以10 μm SPG膜為例，單因素篩選優(yōu)化制備條件；掃描電子顯微鏡觀察微球形態(tài)，通過測定微球的粒徑分布、包封率、體外釋放等指標對微球進行評價和比較。結果優(yōu)化條件下制備了粒徑分別為1.917、3.869 和18.92 μm的單分散型微球，結果顯示粒徑越小，包封率越低，后期釋放越緩慢。結論采用快速膜乳化法可制備出不同粒徑的單分散型微球；不同粒徑微球的包封率、釋放行為差異較大，較大粒徑（約20 μm）的微球包封率較高，后期穩(wěn)定持續(xù)釋放，適合研制成長效緩釋微球產品。

藥劑學；單分散型微球；快速膜乳化法；艾塞那肽；包封率；體外釋放

以PLGA為骨架材料制備載蛋白、多肽類藥物緩釋微球，是近30多年來藥劑學領域研究的重點之一，其中亮丙瑞林微球、重組人生長激素微球和艾塞那肽微球制劑BYDUREON?已獲批準上市[1-2]。艾塞那肽是首個獲準上市的腸促胰島素類似物藥物，降糖機制包括抑制胰高血糖素的不適當分泌、葡萄糖依賴的促胰島素分泌、延緩胃排空、減少食物攝入以及保護 β細胞功能等[3]，其微球制劑BYDUREON?已成功上市，但其制劑本身存在一些問題，如相分離法制備工藝較繁瑣、有機溶劑去除困難及微球中藥物的釋放存在平臺期等。作者采用快速膜乳化法結合復乳法制備不同粒徑的單分散型載艾塞那肽PLGA緩釋微球，通過單因素考察優(yōu)化制備條件，并對不同粒徑的載藥微球進行體外評價和比較，對調整藥物的釋放行為具有一定的指導意義。

1 儀器與材料

IKA?T18 高速分散勻質機（德國IKA 公司），膜乳化器、Shirasu porous glass (SPG)膜（5.2 μm、10 μm和 40.1 μm）（日本SPG TECHNOLOGY CO., Ltd），EYELAN-1001 旋轉蒸發(fā)儀（日本Tokyo Rikakikai公司），VirTis advantage ES-53冷凍干燥機（美國SP Industries, Inc.），ZHWY-110X30 往復式水浴恒溫搖床（上海智誠分析儀器制造有限公司），KDC-28 低速離心機（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司），HC-3018高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司），HITACHI 高效液相色譜儀（日本日立公司），IKA Vortex Genius 3旋渦混合器（德國IKA公司），ATL-124分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司），BT-9300S激光粒度測定儀（丹東百特儀器有限公司）。

艾塞那肽原料藥（exenatide，陜西天森藥物研究開發(fā)有限公司，批號 20131121），聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA，RESOMER?RG503H，體積比50∶50，贏創(chuàng)特種化學（上海）有限公司），聚乙烯醇（PVA，水解度87%～89%，Mw=72.6～81.4 ku，日本可樂麗株式會社）,乙腈（色譜純，天津康科德科技有限公司），其他試劑（分析純，市售）。

2 方法

2.1 快速膜乳化法制備PLGA空白微球和艾塞那肽載藥微球

采用快速膜乳化技術結合W1/O/W2復乳溶劑揮發(fā)法制備PLGA空白微球和艾塞那肽載藥微球。

空白PLGA微球的制備：量取純化水0.4 mL作為內水相W1，稱取PLGA 400 mg溶于4 mL二氯甲烷（PLGA的質量濃度為100 g·L-1）作為有機相O，冰浴條件剪切攪拌下，將內水相緩慢注入到有機相中，1.2×104r·min-1均質勻化2 min 即得W1/O初乳。然后將初乳快速倒入15 mL外水相（10 g·L-1PVA，10 g·L-1NaCl）中，冰浴條件下剪切攪拌，得W1/O/W2預復乳。迅速將預復乳轉移至膜乳化裝置中，以一定的氮氣壓力通過SPG 膜（預先用外水相充分浸潤），將所得乳液分散至一定體積NaCl質量濃度為10 g·L-1的水溶液中，40 ℃旋轉蒸發(fā)15 min，完全去除二氯甲烷使微球固化，3 000 r·min-1離心10 min收集微球，蒸餾水洗滌3 次，冷凍干燥即得PLGA空白微球。

載艾塞那肽PLGA微球的制備：載藥微球與PLGA空白微球的制備過程基本一致，不同的是載藥微球的內水相為質量濃度為50 g·L-1艾塞那肽的水溶液0.4 mL，其余的制備條件與步驟均與PLGA空白微球一致。

2.2 微球粒徑及粒度分布的測定

取適量凍干后微球分散至一定體積的蒸餾水中，采用激光粒度儀測定微球的粒徑及其分布。具體步驟如下：設置測定參數，樣品折射率實部1.52，虛部0.01，避光率為10%，將微球樣品均勻分散至蒸餾水中后，滴加到粒度測定儀的樣品槽中，通過進樣系統(tǒng)帶動樣品吸入激光通道中，共測定3次，由測試軟件自動擬合給定粒徑d50及粒徑分布系數Span值。Span值越小的樣品均一性越好。

式中，d10、d50和d90分別為微球體積累積達10%、50%和90%時的粒徑。

2.3 微球表面形態(tài)觀察

將雙面導電膠帶粘附于銅錠上，取適量微球適量均勻涂布在導電膠上，噴金后進行掃描電子顯微鏡觀察。

2.4 包封率及載藥量的測定

稱取艾塞那肽載藥微球約10 mg，加入乙腈1 mL，渦旋震蕩30 min，使PLGA 充分溶解，1.2×104r·min-1離心10 min，移除乙腈，40 ℃吹干殘余乙腈，殘余物加入適量純化水，渦旋震蕩30 min，充分溶解，1.2×104r·min-1離心10 min，取上清液作為樣品溶液，采用HPLC法測定艾塞那肽的藥物濃度。微球的實際載藥量（drug loading efficiency，wLE）和包封率(entrapment efficiency, wEE)按下式計算：

實際載藥量（wLE）= 微球中艾塞那肽含量/微球總質量×100%；包封率（wEE）=實際載藥量 /理論載藥量×100%

2.5 微球體外釋放的測定

稱取艾塞那肽載藥微球約10 mg置于樣品管中，加入pH值7.4的磷酸鹽緩沖液1 mL，其中含有質量濃度為0.2 g·L-1的疊氮鈉（抑菌劑）和0.2 g·L-1的吐溫80（微球聚集抑制劑）。樣品管置于37 ℃水浴恒溫搖床中，100 r·min-1振搖，1.2×104r·min-1離心分離10 min，取出全部上清液，再重新加入新鮮釋放介質1 mL。采用HPLC法測定上清液中的藥物含量。

3 結果和討論

3.1 快速膜乳化法制備空白PLGA微球的處方工藝優(yōu)化

與常規(guī)膜乳化不同，快速膜乳化速度很快，液滴受力主要涉及過膜壓力，而常規(guī)膜乳化過程中液滴主要受到 4種力的平衡[4]?？焖倌と榛ǎ紫韧ㄟ^常規(guī)乳化方式如機械攪拌、超聲粉碎、均質等方法制備預乳液，然后將預乳液快速倒入膜乳化裝置的儲存罐中，在一定的氮氣壓力下迅速通過SPG膜形成最終的乳滴，旨在制備粒徑較均一、可控、批間重現(xiàn)性好的微球。快速膜乳化過程中，外水相中PVA濃度、有機相與外水相體積比、過膜壓力和過膜次數是影響乳滴大小和均一性的主要因素，因此，作者以10 μm SPG膜為例，對以上因素進行單因素篩選，優(yōu)化空白PLGA微球的制備條件。

3.1.1 外水相中PVA質量濃度對微球粒徑分布的影響

研究考察了外水相中PVA質量濃度分別為2.5、5、10和30 g·L-1時對微球粒徑的影響，其粒徑分布圖見圖1。

Fig. 1 The effects of PVA concentrations on the particle distributions of blank PLGA microspheres圖1 PVA質量濃度對空白PLGA微球粒徑分布的影響

所得微球的粒徑d50分別為3.592、4.057、3.717和3.495 μm，分布系數Span分別為5.525、1.364、1.271和1.44。結果表明，隨著外水相中PVA質量濃度的增加，微球的粒徑變小、粒徑均一性變好。外水相中足夠的穩(wěn)定劑，不僅可以有效降低油水界面間張力，而且還可以有效防止乳滴間的凝聚，提高乳液穩(wěn)定性，從而保證微球粒徑的均一性[5]。研究中采用含2.5 g·L-1PVA的外水相制備微球時，粒徑分布圖顯示有大于SPG膜孔徑的粒子存在，原因是過低質量濃度的PVA對乳滴的穩(wěn)定作用較差，導致膜乳化過程后乳滴合并，造成微球粒徑分布不均且成球性較差。然而，當PVA質量濃度過高時，會使小粒徑微球的比例增加，影響粒徑的均一性，同時PVA質量濃度過大時，預復乳的制備及膜乳化過程中會產生較多的泡沫，導致微球的洗滌困難，因此最終選擇外水相中PVA質量濃度為10 g·L-1。

3.1.2 有機相與外水相的體積比對微球粒徑分布的影響

快速膜乳化過程中，有機相與外水相的體積比與預復乳液滴的黏度密切相關，因而會影響液滴通過膜孔時的形變程度，從而影響乳滴的破碎程度。固定有機相體積為4 mL，研究考察不同有機相與外水相的體積比對微球粒徑均一性的影響，結果見表1。

Table 1 The particle distributions of blank PLGA microspheres prepared with different volume ratios of organic solvent to water表1 不同有機相與外水相的體積比對空白PLGA微球粒徑分布的影響

結果表明，不同比例有機相與外水相下制備的微球粒徑d50約為3.5 μm，微球的粒徑隨著外水相比例的增大而稍有降低，同時Span值有所增大。說明微球的均一性變差，主要原因是外水相比例的增加使乳滴間碰撞的機會變少，同時乳液體系的乳化能力提升，更傾向于生成小粒徑的微球，從而使整體的分散系數變大。因此，有機相與外水相的最優(yōu)體積比為1∶3.75。

3.1.3 不同過膜壓力對空白PLGA微球粒徑分布的影響

分別在60、90和120 kPa的過膜壓力下制備空白PLGA微球，考察過膜壓力對微球粒徑的影響，結果見圖2。

所得的微球的粒徑d50分別為3.817、3.63和3.19 μm，分散系數分別為1.281、1.329和1.282。結果表明，過膜壓力對微球的粒徑均一性影響不大，但對粒徑d50的大小有一定的影響，隨著過膜壓力的增大d50減小，因為較大的過膜壓力下，乳滴與膜孔壁間的剪切力增大，乳滴易破碎成更小的乳滴。當過膜壓力過大時，過膜過程中產生較多的泡沫，影響過膜效率和產品收率，因此選用60 kPa的過膜壓力來制備空白PLGA微球。

Fig. 2 The effect of transmembrane pressure (ptm) on particle size distribution of blank PLGA microspheres圖2 不同過膜壓力所制PLGA空白微球的粒徑分布

3.1.4 不同膜乳化次數對空白PLGA微球粒徑分布的影響

選擇60 kPa作為跨膜壓力，考察過膜次數對微球粒徑分布的影響，掃描電鏡照片及粒度分布見圖3。膜乳化次數由1次增加到2次時，微球粒徑由3.817 μm減小到3.027 μm，分散系數Span由1.281減小到1.078，增加到3次時，粒徑和分散系數無明顯變化。但當循環(huán)次數增加時，微球收率明顯下降，原因可能是循環(huán)過膜后，部分PLGA固化沉積于SPG膜孔道中，有效孔徑減小，導致收率降低。因此，最終將預復乳過膜1次以制備單分散型PLGA微球。

Fig. 3 SEM micrographs and size distribution of blank PLGA microspheres prepared with different membranehomogenized cyles圖3 不同膜乳化次數制備的空白PLGA微球的SEM圖（A、B、C）和粒徑分布（D）

綜上所述，采用10 μm SPG膜制備單分散型空白PLGA微球的優(yōu)化條件如下：外水相中PVA質量濃度為10 g·L-1，有機相與外水相體積比為1∶3.75，過膜壓力為60 kPa，過膜1次。

3.2 不同粒徑PLGA空白微球的制備

SPG膜孔徑大小和過膜壓力是影響微球粒徑的主要因素，在上述優(yōu)化條件下，分別采用5.2、10.0 和40.1 μm孔徑的SPG膜，在不同的跨膜壓力下制備了不同粒徑的單分散型空白PLGA微球，結果見表2，粒徑分布圖見圖4。結果表明，預復乳液滴粒徑一致的條件下，SPG膜孔徑越小，需要的過膜壓力越大，微球粒徑也趨于均勻。因為大孔徑的SPG膜會使粒徑小于膜孔徑的液滴直接過膜，從而導致微球的粒徑均一性稍差。分析結果得知，SPG膜孔徑與微球粒徑有較好的線性關系（R2= 0.999），因此，可以選取合適孔徑的SPG膜較快捷地制備出所需要孔徑的單分散型微球。

Table 2 The particle size of blank PLGA microspheres prepared with SPG membrane different pore size表2 不同孔徑SPG膜制備空白PLGA微球的粒徑數據

Fig. 4 The particle size distribution of blank PLGA microspheres prepared using SPG membrane with different pore size圖4 不同孔徑SPG膜制備空白PLGA微球的粒徑分布圖

3.3 快速膜乳化法制備單分散型載艾塞那肽PLGA微球的處方優(yōu)化

基于優(yōu)化后的空白PLGA微球的處方工藝，以10 μm SPG膜為例，通過單因素實驗進一步優(yōu)化裝載艾塞那肽PLGA微球的制備條件。

3.3.1 內水相與有機相的體積比對包封率及突釋的影響

采用復乳法制備微球過程中，內水相體積是影響微球包封率的重要因素[6]。固定有機相體積為4 mL，考察內水相與有機相體積比為1∶5、1∶8和1∶10對微球性質的影響。從圖5可知，隨著內水相體積的減小，微球包封率由內水相與有機相體積比為 1∶5時的 36.46%提高到體積比為 1∶10時的67.74%。內水相體積增大，導致更多的內水相液滴分布于油水界面附近，使隔離內外水相的油膜變薄，從而使內外水相融合幾率變大，藥物更容易擴散到外水相使微球包封率下降，突釋變大[7]。因此，選擇內水相與有機相體積比1∶10為最優(yōu)條件。

Fig. 5 The effect of volume ratio of internal water phase to organic phase on the encapsulaiton efficiency and burst release of exenatide-loaded PLGA microspheres圖5 內水相與有機相的體積比對載藥微球包封率及突釋的影響

3.3.2 有機相中PLGA質量濃度對微球性質的影響

有機相中的PLGA質量濃度對微球的包封率、粒徑及體外釋放行為有重要的影響[8-9]。因此考察不同PLGA質量濃度對微球性質的影響，結果見表3。

Table 3 The effects of PLGA concentration on the characteristics of exenatide-loaded PLGA microspheres表3 有機相中PLGA質量濃度對載藥微球性質的影響

結果顯示，隨著有機相中PLGA質量濃度的增加，微球包封率變大，突釋百分數降低。這是由于PLGA質量濃度越高，有機相黏度變大，聚合物沉淀速度變快，大大減小了內水相藥物擴散到外水相的幾率，使分散在微球表面的藥物比例減小，從而使包封率提高，突釋降低。然而，當有機相中PLGA質量濃度過高時，預復乳乳滴與SPG膜孔壁摩擦力變大， SPG膜上有大量的PLGA固化，對膜材和藥物的損失較嚴重，影響快速膜乳化的過膜效率，使微球產品的收率較低。綜合考慮包封率、突釋百分數和產品收率的因素，最終確定PLGA的質量濃度為100 g·L-1。

3.3.3 外水相中NaCl質量濃度對微球性質的影響

復乳法制備微球過程中，內外水相的滲透壓梯度是影響載藥微球包封率的重要因素。外水相中添加低質量濃度的NaCl后，減小了內外水相的滲透壓差值，阻礙了水分向微球內部的滲透及藥物向外水相擴散，從而可使包封率明顯提高，但是如果NaCl質量濃度過高，內水相的水分有向外擴散的趨勢，也不利于包封率的提高；而且隨著外水相中NaCl的增加，二氯甲烷在水中的溶解度隨之降低，溶劑揮發(fā)速率減緩，微球固化過程變慢，增加了藥物向外水相擴散的可能性，從而使包封率降低[3]。因此考察外水相NaCl質量濃度分別為0、10 、30和60 g·L-1時對微球性質的影響，結果見圖6。

Fig. 6 The effects of the NaCl concentrations in external water phase on the characteristics of exenatide-loaded PLGA microspheres圖6 外水相中NaCl質量濃度對載藥微球性質的影響

結果顯示，與外水相中不加入NaCl相比, 當外水相中NaCl的質量濃度為10 g·L-1時，包封率增加了28.31%，突釋百分數也有所下降；繼續(xù)增大NaCl質量濃度，包封率明顯下降，突釋百分數也明顯增加。掃描電鏡照片顯示，外水相中不加氯化鈉及氯化鈉質量濃度較高（30 g·L-1NaCl、60 g·L-1NaCl）時制備的微球表面有塌陷和孔洞，加入10 g·L-1NaCl水溶液制備的微球表面致密光滑無空洞，微球的形態(tài)特征也從側面驗證了上述的包封率和突釋百分數數據。因此外水相中NaCl質量濃度的最優(yōu)條件為10 g·L-1。

3.3.4 初乳的制備方式的考察

總結上述實驗數據，最優(yōu)處方制備的載藥微球包封率為 67.74%，仍低于同類文獻報道的數值[3,10]。初乳的處方工藝是影響包封率的重要因素，因此作者又考察了W1/O初乳的制備方式，以上處方是將溶有藥物的內水相先直接倒入溶有PLGA的二氯甲烷中，然后再立即剪切制備初乳，此種方法內水相與有機相接觸不充分，乳化效果不好，且會造成內水相的損失，因此包封率較低。將初乳的制備方法改良，先在較低的剪切速度下，將內水相緩慢注入有機相液面以下，然后再調至所需轉速，此種方法制備的微球的包封率提高至88.04%。

通過單因素考察，得到以10 μm SPG膜制備載艾塞那肽PLGA微球的最優(yōu)條件為：內水相與有機相的體積比為1∶10，有機相中PLGA的質量濃度為100 g·L-1，外水相中NaCl質量濃度為10 g·L-1，初乳的制備方式為注入式。

3.4 不同粒徑單分散型載艾塞那肽PLGA微球的制備及體外評價

參照“3.2”條和“3.3”條所確定的優(yōu)化處方工藝條件，制備了不同粒徑單分散型載藥微球（表4），并考察粒徑對微球包封率及釋放行為的影響（圖7）。

固定預復乳的處方工藝，采用不同孔徑的SPG膜制備不同粒徑的載藥微球，微球表面光滑無孔洞（圖7），粒徑分布較均勻，且隨著SPG膜孔徑的減小，微球粒徑趨于均勻。數據顯示，微球包封率隨著粒徑的減小而降低。在微球的制備過程中，內外水相的融合是導致藥物泄漏的主要因素之一[6]，粒徑較小的微球內外水相間的距離較短，因此藥物更容易擴散至外水相，從而導致包封率降低。

微球的釋放曲線顯示，粒徑不同，微球的體外釋放行為差異較大。粒徑較小的微球，雖然突釋較低，但后期釋放速率太慢，釋放不完全。而粒徑較大的微球突釋稍大，但后期穩(wěn)定持續(xù)釋放，粒徑不同導致突釋有差異的其中一個原因是微球的載藥量不同，小粒徑微球的載藥量較低，因此突釋百分數較小。

Table 4 Characterization of exenatide-loaded PLGA microspheres with different sizes表4 不同粒徑載艾塞那肽PLGA微球的體外評價

Fig. 7 SEM photographs(A、B、C) and drug release profiles（D） of exenatide-loaded PLGA microspheres with different sizes圖7 不同粒徑載艾塞那肽PLGA微球的SEM圖（A、B、C）和體外釋放曲線（D）

4 結論

快速膜乳化法結合復乳法可制備不同粒徑的單分散型空白及載艾塞那肽PLGA微球。粒徑大小對微球的包封率及體外釋放行為有重要影響。粒徑較小的微球包封率低、后期釋放緩慢、釋放不完全，相比之下，粒徑較大（18.92 μm）的微球包封率較高，且釋放行為良好，適合制備長效緩釋微球。

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Preparation of monodisperseexenatide-loaded microspheres and in vitro evaluation

YANG Hua1, WANG Qian1, LIN Xia2, TANG Xing1*
(1. School of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China; 2. School of Pharmacy, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

ObjectiveThe aim of this study was to prepare monodisperse exenatide-loaded polylactic-co-glycolic acid (PLGA) microspheres with different size and investigate the size effect on the entrapment efficiency and in vitro release rate of the exenatide-loaded microspheres.MethodsThe microspheres with different sizes were prepared by premix membrane emulsification. By using single-factor test, the preparation conditions of the microspheres were optimized with the 10 μm SPG membrane. The surface morphology of PLGA microspheres was assessed by scanning electron microscope (SEM). The microspheres were evaluated and compared by particle size distribution, entrapment efficiency (EE) and in vitro release.Results The monodisperse microspheres were prepared respectively with size of 1.917 μm, 3.869 μm, 18.92 μm under the optimized conditions. The results revealed that the microspheres with smaller size obtained lower EE and lower release rate.Conclusions Premix membrane emulsification method could be used to prepare monodisperse microspheres with different sizes. There are apparent discrepancies on the EE and released behavior among the microspheres with different sizes. The microspheres with larger size (about 20 μm) are fitted to be developed into long-term release products, which possessed higher EE and better in vitro release behavior than the others in this study.

pharmaceutics; monodisperse microspheres; premix membrane emulsification; exenatide; entrapment efficiency; in vitro release

R94

A

（2016）06–0193–11

10.14146/j.cnki.cjp.2016.06.002

(本篇責任編輯：趙桂芝)

2015-05-20

楊華(1989-), 女(漢族), 河南新鄉(xiāng)人, 碩士研究生,E-mailyanghua36275@163.com;*通訊作者：唐星(1964-), 男(漢族), 陜西商縣人, 教授, 博士, 博士生導師, 主要從事藥劑學研究,Tel.024-23986343,E-mailtangpharm@sina.com。