張?jiān)?，史方園，唐 星

(沈陽(yáng)藥科大學(xué) 藥學(xué)院, 遼寧 沈陽(yáng) 110016)

角鯊烯化吉西他濱理化性質(zhì)的研究

張?jiān)?，史方園，唐 星*

(沈陽(yáng)藥科大學(xué) 藥學(xué)院, 遼寧 沈陽(yáng) 110016)

目的對(duì)角鯊烯化吉西他濱的理化性質(zhì)進(jìn)行研究，為制劑研究提供參考。方法合成角鯊烯化吉西他濱并用質(zhì)譜、氫譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證；利用紫外分光光度法、差示掃描量熱法和粉末X-射線衍射對(duì)吉西他濱及其前藥進(jìn)行表征，并用HPLC法測(cè)定角鯊烯化吉西他濱的溶解度和表觀油水分配系數(shù)。結(jié)果合成方法可行。合成的角鯊烯化吉西他濱與吉西他濱具有完全不同的晶型、溶解性能和油水分配系數(shù)。結(jié)論合成的前藥較吉西他濱有較好的脂溶性，且其具有兩親性，在水中可自發(fā)形成自組裝體。

藥劑學(xué)；前藥；理化性質(zhì)；吉西他濱；角鯊烯化吉西他濱；膠束

吉西他濱( gemcitabine, Gem) 為2'，2'-二氟-2'-脫氧胞苷類似物（化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1），用于肺、胰腺、卵巢、乳腺、膀胱和膽囊癌等的治療。該藥物為周期特異性抗腫瘤藥[1]，在細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)脫氧胞苷激酶的作用，由5'位的磷酸化激活，使其轉(zhuǎn)變成為三磷酸酯衍生物，該衍生物以復(fù)制方式嵌入DNA鏈終止鏈的生長(zhǎng)，從而阻斷癌細(xì)胞的增殖。目前，由禮來(lái)公司開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品—健擇，已在90多個(gè)國(guó)家獲得批準(zhǔn)使用，為治療非小細(xì)胞肺癌的一線藥物。然而，市售的吉西他濱腫瘤選擇性低、生物半衰期短、毒性高、易產(chǎn)生耐藥性，從而限制了其抗腫瘤作用的充分發(fā)揮。

近幾年，國(guó)內(nèi)外有大量關(guān)于吉西他濱結(jié)構(gòu)改造方面的研究[2]。例如Maria等通過(guò)將吉西他濱4位氨基與鏈狀烴共價(jià)偶合，形成高度脂溶性吉西他濱衍生物；連艷菊等制備了十八?；魉麨I自組裝體。

角鯊烯（squalene, Sq）是生物合成固醇類的中間物（化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1），可為機(jī)體供氧，能抑制致癌物質(zhì)的活性，輔助治療癌癥。同時(shí)，可以抑制癌細(xì)胞增殖，增加對(duì)癌癥的抗性。因其生物兼容性及安全性，將藥物角鯊烯化[3]成為藥脂生物共軛體，已成為目前研究的熱點(diǎn)。

作者利用角鯊烯對(duì)吉西他濱4位氨基進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，制備吉西他濱的衍生物—4-(n)-角鯊烯?；魉麨I(Sq-gem)（化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1），旨在延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間、提高藥效、降低毒性。利用核磁共振（MR）對(duì)吉西他濱衍生物進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，并且采用差示掃描量熱(DSC)、粉末X-射線衍射(XPRD)、紅外光譜(IR)及高效液相色譜（HPLC）等技術(shù)對(duì)吉西他濱及其衍生物性質(zhì)進(jìn)行對(duì)比研究。制備了角鯊烯化吉西他濱自組裝體，并對(duì)其體外性質(zhì)及穩(wěn)定性進(jìn)行初步研究。

Fig.1 The chemical structure of squalene(1), gemcitabine(2) and squalene-gemcitabine (3)圖 1 角鯊烯(1)、吉西他濱(2)和4-(n)-角鯊烯?；魉麨I(3)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 儀器與材料

納米粒度分析儀（英國(guó)馬爾文儀器有限公司），F(xiàn)A–1104電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司），全掃描紫外分光光度計(jì)（Unico，美國(guó)），恒溫水浴培養(yǎng)搖床（上海智城分析儀器制造有限公司），DSC-60差示掃描量熱分析儀（日本島津公司），D/Max-2400 X-射線熒光光譜儀（日本理學(xué)株式會(huì)社），Bruker 6-55 紅外光譜儀（德國(guó)Bruker光譜儀器公司），DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器（鞏義英峪予華儀器廠），HITACHI L-2000 高效液相色譜儀、HITACHI 紫外分光光度計(jì)（日本Hitachi公司），ARX400核磁共振儀（美國(guó)Bruker公司），Thermo C18色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm,美國(guó)Thermo公司）。

原料角鯊烯（TCI化成工業(yè)發(fā)展有限公司），原料鹽酸吉西他濱（寧波天衡制藥有限公司），其他藥品或試劑（分析純或藥用輔料，市售）。

2 方法與結(jié)果

2.1 角鯊烯化吉西他濱的合成

角鯊烯化吉西他濱的合成路線參照文獻(xiàn)[4]設(shè)計(jì)，具體路線見(jiàn)圖2。簡(jiǎn)單地說(shuō)，是將角鯊烯制備成角鯊烯酸后，由吉西他濱4位的氨基與角鯊烯酸通過(guò)酰胺反應(yīng)共價(jià)結(jié)合得來(lái)的白色或類白色固體，通過(guò)硅膠柱分離純化得到精品角鯊烯化吉西他濱，收率50%左右。

Fig. 2 Synthesis routes of the sq-gem圖 2 角鯊烯化吉西他濱的合成路線

2.2 角鯊烯化吉西他濱的結(jié)構(gòu)確證

所得衍生物通過(guò)質(zhì)譜與氫譜確定結(jié)構(gòu)，數(shù)據(jù)如下：1H-NMR (400 MHz, DMSO) (圖3)：δ 10.99 (1H，s，NHCO)、8.24 (1H，d，J = 7.6 Hz，CH=CH)、7.27 (1H，d，J = 7.6 Hz，CH=CH)、6.31 (1H，d，J = 6.5 Hz，—CH—O—)、6.17 (1H，t, J = 7.4 Hz，CH—OH)、5.28 (1H，t, J = 5.4 Hz，O—CH—CH2OH)、 5.09 (5H，m，C—CH═)、4.19 (1H，m，CH2OH), 3.90 (1H，m，CH2CO)、3.88 (1H，m，CH2CO)、3.67 (1H，m，CH2OH)、2.22 (2H，m，CH2CH2CO)、2.03～1.92 (16H，m，CH2)、1.64～1.54 (18H，m，CH3)。ESI-MS(m/z)（圖4）：646.40 [M+H]+和668.38[M+Na]+。由上述數(shù)據(jù)確定所合成的化合物為角鯊烯化吉西他濱。

Fig. 3 The1H-NMR of squalene-gemcitabine圖 3 角鯊烯化吉西他濱的1H-NMR譜圖

Fig. 4 The mass spectra of squalene-gemcitabine圖 4 角鯊烯化吉西他濱的質(zhì)譜圖

2.3 角鯊烯化吉西他濱理化性質(zhì)的測(cè)定

2.3.1 紫外光譜特性

取角鯊烯化吉西他濱適量，分別制成角鯊烯化吉西他濱乙醇溶液，以乙醇作為空白對(duì)照，按《中華人民共和國(guó)藥典》2010 版二部附錄IV A中紫外分光光度法，在波長(zhǎng)200～400 nm內(nèi)進(jìn)行紫外掃描。吉西他濱前藥紫外光譜分析（UV）結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可見(jiàn)，角鯊烯化吉西他濱在242 nm 和250 nm 處吸收值最大，同時(shí)流動(dòng)相在此處無(wú)吸收，而據(jù)報(bào)道，吉西他濱檢測(cè)波長(zhǎng)為268 nm。

Fig. 5 The UV spectra of the Sq-gem in alcohol (A) and the alcohol (B)圖 5 角鯊烯化吉西他濱乙醇溶液（A）和無(wú)水乙醇（B）的紫外掃描圖譜

2.3.2 差示掃描量熱 (DSC)法

取吉西他濱或角鯊烯化吉西他濱適量，置于分析儀的鋁盤(pán)中，以氧化鋁為參比物，置氮?dú)饬髦?，?5 ℃到200 ℃，以10 ℃·min-1的速率升溫掃描。吉西他濱以及角鯊烯化吉西他濱差示掃描量熱分析測(cè)試(DSC)結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，吉西他濱在168.6 ℃有1個(gè)明顯的吸熱峰，為藥物結(jié)晶峰，而角鯊烯吉西他濱不存在結(jié)晶峰。

Fig. 6 The DSC maps of Gem and Sq-gem圖 6 吉西他濱和角鯊烯化吉西他濱的DSC圖譜

2.3.3 X-射線粉末衍射(XPRD)法

工作條件：CuKa 靶石墨單色器衍射束單色比，高壓 56 kV，單流 182 mA，掃描 2θ 角度為 5°～60°，掃描速度為 0.2°·min-1。

吉西他濱以及角鯊烯化吉西他濱的 XPRD 測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖 7。圖7說(shuō)明，吉西他濱為典型的晶體化合物，在8°～36° 內(nèi)存在明顯的晶體衍射峰，而在角鯊烯化吉西他濱中，藥物的衍射峰消失。

Fig. 7 The x-ray diffraction patterns of Gem and Sq-gem圖 7 吉西他濱和角鯊烯化吉西他濱的XPRD圖譜

2.3.4 液相分析法

角鯊烯化吉西他濱的色譜條件如下[4]：色譜柱為Thermo C18柱（250 mm × 4.6 mm, 5 μm），流動(dòng)相為乙腈-水 （體積比85∶15)，柱溫為室溫，流速為0.8 mL·min-1，波長(zhǎng)為254 nm，進(jìn)樣量20 μL。

2.3.5 油中溶解度的測(cè)定

取大豆油、中鏈油、大豆油與中鏈油質(zhì)量比1∶1的混合油各1 g，分別置于5 mL西林瓶中，再分別加入過(guò)量的角鯊烯化吉西他濱，用N2密封后置于恒溫水浴培養(yǎng)搖床中，以25 ℃、100 r·min-1振搖約72 h以上，至溶解平衡。所得混合物放至室溫后，離心，取上清液用無(wú)水乙醇稀釋，過(guò)0.22 μm濾膜，取續(xù)濾液進(jìn)高效液相色譜儀，分別記錄峰面積，利用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算前藥在不同油中的溶解度。吉西他濱前藥在不同油中溶解度結(jié)果如表1所示。結(jié)果顯示，角鯊烯化吉西他濱在油中溶解度大小排序?yàn)椋褐墟溣停净旌嫌停敬蠖褂汀?/p>

Table 1 The solubility of Sq-gem in different oils at room temperature (± s, n=3)表1 室溫下角鯊烯化吉西他濱在不同油中的溶解度 (± s, n=3)

Table 1 The solubility of Sq-gem in different oils at room temperature (± s, n=3)表1 室溫下角鯊烯化吉西他濱在不同油中的溶解度 (± s, n=3)

Species w(solubility) / % Soybean oil 0.747±6×10-3Medium chain triglycerides 1.226±5×10-3Mixed oil 1.006±8×10-3

2.3.6 油水分配系數(shù)的測(cè)定

取pH值為4.8、6.8、7.0、7.8的磷酸鹽緩沖液（詳見(jiàn)《中華人民共和國(guó)藥典》2010版附錄）各10 mL置于錐形瓶中，分別加入正辛醇10 mL，置恒溫空氣浴振蕩器中，以100 r·min-1的速度振搖至分配平衡 （約72 h），靜置至分層后，分離出兩相均為飽和溶液。精密稱取吉西他濱前藥置于EP 管內(nèi)，加入不同pH值的正辛醇飽和水相各1 mL，置恒溫空氣浴振蕩器中振搖2 h，再分別加入水飽和的正辛醇溶液1 mL，再用恒溫空氣浴振蕩約72 h至平衡。將溶液靜置后，分離出水相與正辛醇相，取續(xù)濾液按“2.3.4“條色譜條件分別測(cè)定兩相中的藥物濃度，計(jì)算吉西他濱前藥在25 ℃不同pH值條件下的表觀油水分配系數(shù)[5]，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，吉西他濱前藥在不同pH值介質(zhì)下的表觀油水分配系數(shù)均較高，而且其值大小相差不大。

Table 2 The partition coefficient of Sq-gem in different pH media at room temperature表 2 室溫下，角鯊烯化吉西他濱在不同pH值介質(zhì)中的表觀油水分配系數(shù)

2.4 角鯊烯化吉西他濱自組裝體的制備

角鯊烯化吉西他濱自組裝體通過(guò)納米沉淀法制備。過(guò)程如下，將角鯊烯化吉西他濱溶于無(wú)水乙醇制成2 g·L-1的乙醇溶液。取所得溶液1 mL，在1 000 r·min-1的機(jī)械攪拌下逐滴加至1 mL雙蒸水中，形成自組裝體。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將所得自組裝體中的乙醇于37 ℃揮去，即得自組裝體樣品。在5 ℃冷藏保存，備用。

2.5 自組裝體的表征

2.5.1 自組裝體粒度的測(cè)定

將上述樣品用注射用水稀釋，立即放入樣品池內(nèi)，將光強(qiáng)度 (intensity) 調(diào)節(jié)至300 kHz 左右，光源為HeNe激光 (λ0=633 nm)，將操作參數(shù)中溫度設(shè)為測(cè)定時(shí)的室溫，開(kāi)始測(cè)定，保持測(cè)定至Time history曲線趨于直線時(shí)停止，保存數(shù)據(jù)。膠束粒徑為120 nm左右, 其分布較均勻, 跨度窄。

2.5.2 掃描電鏡(TEM)法

取吉西他濱前藥自組裝體稀釋后樣品滴在銅網(wǎng)表面，使液滴盡量鋪滿整個(gè)銅網(wǎng)，1 min后用濾紙輕輕吸去邊緣多余液體，再滴一滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%磷鎢酸溶液（pH值約為6.5）使液滴盡量鋪滿整個(gè)銅網(wǎng)，1 min后過(guò)0.45 μm濾膜并用濾紙輕輕吸去邊緣多余液體，自然干燥后，上鏡觀察，并進(jìn)行拍照。結(jié)果如圖8所示，為球形，粒徑約80 nm。

Fig. 8 The TEM images of the micelle dilution 100 times (A) and the dilution2 000 times (B)圖 8 膠束稀釋100倍（A）和稀釋2 000倍（B）透射電鏡圖

3 討論

a. 經(jīng)結(jié)構(gòu)確證，確定合成產(chǎn)物為角鯊烯化吉西他濱。紫外分光光度法發(fā)現(xiàn)，合成前藥的最大吸收峰位置發(fā)生了藍(lán)移，可能是角鯊烯與吉西他濱發(fā)生反應(yīng)后，由于角鯊烯的空間位阻太大，從而導(dǎo)致吉西他濱的共軛度受到了影響。同時(shí)，對(duì)最大吸收波長(zhǎng)進(jìn)行確定，考慮末端吸收，選擇248～252 nm作液相測(cè)定方法的檢測(cè)波長(zhǎng)。差示熱掃描法研究發(fā)現(xiàn)，在角鯊烯化吉西他濱中，結(jié)晶峰消失，說(shuō)明其以無(wú)定型狀態(tài)存在。而X射線衍射結(jié)果中，吉西他濱角鯊烯化形成的前藥中無(wú)結(jié)晶峰存在，同樣證明其以無(wú)定形狀態(tài)存在。對(duì)角鯊烯化吉西他濱不同油中的溶解度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示其在不同油中均有較好的溶解度。而據(jù)報(bào)道吉西他濱為水溶性藥物[6]，在油中幾乎不溶。由此可知，角鯊烯的引入大大改變了藥物在油中的溶解性能，分析其原因主要是角鯊烯鏈為親油基團(tuán)，大大提高了藥物的疏水性，并且其存在同時(shí)改變了藥物的晶型使其變?yōu)闊o(wú)定型，在溶解過(guò)程中，無(wú)需破壞晶格。角鯊烯化吉西他濱的油水分配系數(shù)測(cè)定結(jié)果顯示，log P為4.96±0.14，而吉西他濱的油水分配系數(shù)是0.05。結(jié)果表明，吉西他濱前藥在不同 pH值介質(zhì)下表觀油水分配系數(shù)均較高，說(shuō)明其親脂性高，而且其值大小相差不大，說(shuō)明其表觀油水分配系數(shù)無(wú)pH值依賴性。

b. 因角鯊烯化吉西他濱具有兩親性，可用納米沉淀法制成自組裝體。動(dòng)態(tài)散射法測(cè)得的角鯊烯化吉西他濱自組裝體粒徑為120 nm左右, 其分布較均勻, 跨度窄。與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本一致。使用TEM觀察自組裝體形態(tài)，與文獻(xiàn)報(bào)道的形態(tài)一致[7]，為球型。觀察其粒徑大約為80 nm，較粒度測(cè)定結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果均要小，可能由于制樣時(shí)有干燥的過(guò)程，且測(cè)定過(guò)程中的高真空條件使得自組裝體殼層吸附的水分子完全喪失，因而觀察到的粒徑較水化徑大幅減小。

4 結(jié)論

本研究成功合成了前景良好的吉西他濱前藥角鯊烯化吉西他濱。采用紫外分光光度法、差示掃描量熱法和X-射線粉末衍射，鑒別前藥為無(wú)定型，以完全不同于吉西他濱的狀態(tài)存在。油中溶解度試驗(yàn)結(jié)果表明，前藥在大豆油中溶解度小于中鏈油。油水分配系數(shù)測(cè)定結(jié)果表明，角鯊烯化吉西他濱具有較好的親脂性。此外，其具有兩親性，在水中可自發(fā)形成自組裝體。說(shuō)明合成的前藥較吉西他濱有不同的理化性質(zhì)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Study on the physicoch emical characterizations of squalenegemcitabine

ZHANG Yuanyuan, SHI Fangyuan, TANG Xing*
(School of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China)

ObjectiveTo characterize squalene-gemcitabine in order to be a good reference in studying pharmaceutics.MethodsSqualene-gemcitabine was synthetized, and then the structure was confirmed; UV, DSC, and PXRD were applied to characterize the gemcitabine prodrug. Moreover, the solubility and the apparent octanol/water partition coefficients were determined by HPLC, respectively.Results It was feasible to synthetize the targeted compound, which was totally different with the plain drug-gemcitabine in the crystal form, solubility and the apparent octanol/water partition coefficients.Conclusions The synthetized prodrug is more lipophilic, compared with gemcitabine. And it is amphiphilic, which make it form spherical micelles spontaneously in water.

pharmaceutics; prodrug; properties; gemcitabine; squalene-gemcitabine; micelle

R943

A

（2016）06–0204–09

10.14146/j.cnki.cjp.2016.06.003

(本篇責(zé)任編輯：趙桂芝)

2015–05–11

張?jiān)?1991–), 女(漢族), 浙江金華人, 碩士研究生,E-mailjuranmo1991@163.com; *

：唐星(1964–), 男(漢族), 陜西商縣人, 教授, 博士, 博士生導(dǎo)師, 主要從事藥劑學(xué)及中藥現(xiàn)代化研究,Tel.024-23986343,E–mailtangpharm@sina.com.cn。