張芬，吳燕燕，臧林泉，潘雪刁，王桂香

(廣東藥科大學(xué) 藥科學(xué)院，廣東 廣州 510006)

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精脒對(duì)SW620細(xì)胞增殖及糖酵解的影響

張芬，吳燕燕，臧林泉，潘雪刁，王桂香

(廣東藥科大學(xué) 藥科學(xué)院，廣東 廣州 510006)

目的 探討精脒對(duì)人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞增殖及糖酵解的影響。方法 以SW620細(xì)胞為研究對(duì)象，用0.625～2.5 μmoL/L精脒(SPD)作用于細(xì)胞，細(xì)胞密度以104個(gè)/mL接種于96孔培養(yǎng)板，分別培養(yǎng)24 h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況；同時(shí)，取6孔板培養(yǎng)24 h的細(xì)胞上清液，用試劑盒檢測(cè)SW620細(xì)胞葡萄糖消耗及乳酸水平；細(xì)胞密度以1.2×105個(gè)/mL接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后加入不同濃度SPD，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，Western blot檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)、乳酸脫氫酶(LDHA)及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(GLUT1)表達(dá)的變化。結(jié)果 與對(duì)照組比較，精脒各濃度組均能促進(jìn)SW620細(xì)胞的增殖(P<0.01)，且促進(jìn)作用呈劑量依賴性；精脒各濃度組作用后SW620細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的消耗及乳酸含量明顯增多(P<0.01)，呈劑量依賴性；與對(duì)照組比較，LDHA、HIF-1及GLUT1蛋白表達(dá)水平隨著精脒濃度的升高而增加(P<0.01)，且呈劑量依賴性。結(jié)論 精脒具有促進(jìn)人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞增殖及糖酵解的作用。

精脒； SW620細(xì)胞； 細(xì)胞增殖； 糖酵解

結(jié)腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，在全球惡性腫瘤的發(fā)生率和死亡率中，已躋身前3位，嚴(yán)重威脅到人類的健康[1]。對(duì)于細(xì)胞來說，能量主要來源于糖代謝。正常組織中大約有90%的ATP來源于線粒體的氧化磷酸化途徑，只有10%的ATP來源于糖酵解途徑。與之相反的是，腫瘤細(xì)胞中大約有50%的ATP是通過糖酵解途徑合成的,而且即便是在有氧環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞仍然偏好通過糖酵解途徑提供能量并生成乳酸，這被稱為瓦伯格效應(yīng)(Warburg effect)[2]。

腫瘤組織細(xì)胞通過缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia inducible factor 1,HIF-1)表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性的增強(qiáng)對(duì)其下游基因進(jìn)行調(diào)控，改變腫瘤細(xì)胞內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)換、新陳代謝、血管生成和細(xì)胞壽命[3]，受HIF-1調(diào)控的糖酵解相關(guān)基因包括葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(GLUT1)、乳酸脫氫酶A(LDHA)[4]等。腫瘤細(xì)胞內(nèi)HIF-1α蛋白水平的調(diào)控除了受到環(huán)境氧濃度影響外還存在其他調(diào)控機(jī)制，如c-myc能夠促進(jìn)HIF-1α蛋白表達(dá)、減少降解或激活其轉(zhuǎn)錄活性而影響糖酵解。

多胺是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的一類帶正電的烷基胺類小分子，包括腐胺(Putrescine，Pu)、精脒(Spermidine，SPD)和精胺(Spermine，Sm)。鳥氨酸脫羧酶(ODC)是多胺合成限速酶，同時(shí)ODC是致癌基因c-myc的靶基因，研究表明c-myc能夠通過促進(jìn)ODC的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞的增殖[5]。由于多胺促進(jìn)腫瘤細(xì)胞快速增殖的過程中勢(shì)必會(huì)造成腫瘤細(xì)胞內(nèi)部缺氧，而多胺同樣受c-myc的調(diào)節(jié)，多胺是否參與腫瘤細(xì)胞的糖酵解值得探討。本實(shí)驗(yàn)以人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620為模型，探討精脒對(duì)SW620細(xì)胞增殖及糖酵解的影響，為初步闡述多胺影響SW620結(jié)腸癌細(xì)胞糖酵解的機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞、藥物與試劑

SW620人結(jié)腸癌細(xì)胞(美國(guó)ATCC公司)；SPD(美國(guó)Sigma，Lot:BCBK3554V)；Anti-GLUT1、Anti-LDHA、Anti-HIF、ACTIN(Abcam公司)；乳酸檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程公司)；MTT(GENVIEW，Lot:3911020250)；H-DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；葡萄糖檢測(cè)試劑盒(上海榮盛生物藥業(yè)有限公司)；羊抗兔二抗、羊抗小鼠二抗(杭州華安生物技術(shù)有限公司)；PVDF膜(美國(guó)Millipore公司)；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

3111型恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；680型酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD公司)； TD5K-Ⅱ型臺(tái)式低速離心機(jī)(長(zhǎng)沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；Multiskan FC型酶標(biāo)儀、冷凍型多功能離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)；SW-CJ-1FD型潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)

SW620人結(jié)腸癌細(xì)胞培養(yǎng)于含10%(φ)FBS的H-DMEM高糖培養(yǎng)基中，于37 ℃ 、5%CO2(φ)細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)至12代時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞增殖率檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SW620細(xì)胞以104個(gè)/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，分為空白組(不含細(xì)胞)、對(duì)照組(Control)、SPD(0.625、1.25、2.5 μmoL/L)組，共5組，每組設(shè)5個(gè)平行孔。24 h后，棄去培養(yǎng)液，給藥組加入含不同濃度的藥物(空白組和Control加入無(wú)血清培養(yǎng)基)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，避光，繼續(xù)放入37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h；終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)的培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO溶液，搖床上振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解；酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)各孔吸光度A值。

細(xì)胞增殖率=(對(duì)照組A-給藥組A)/(對(duì)照組A-空白組A)×100%

2.3 SPD對(duì)細(xì)胞攝取葡萄糖的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SW620細(xì)胞鋪于6孔板中，分組同“2.2”，培養(yǎng)24 h后取上清液，加入各濃度SPD，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用葡萄糖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，計(jì)算各組細(xì)胞的葡萄糖消耗量。按說明書要求，將工作液混合均勻，置于37 ℃溫浴15 min，在波長(zhǎng)505 nm 處，以空白調(diào)零，讀取標(biāo)準(zhǔn)管和樣品管的吸光值：標(biāo)準(zhǔn)品濃度為5.55 mmol/L，計(jì)算各組細(xì)胞的葡萄糖消耗量。

葡萄糖(mmol/L)=樣品管吸光值(A)×標(biāo)準(zhǔn)液濃度/標(biāo)準(zhǔn)管吸光值(A)

2.4 細(xì)胞乳酸含量的檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SW620細(xì)胞鋪至6孔板中，分組同“2.2”，培養(yǎng)24 h后，加入各濃度SPD，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用PBS清洗2次后，將培養(yǎng)板置于冰上，裂解液裂解，12 000 r/min離心10 min，取上清，用試劑盒檢測(cè)乳酸含量，以空白組調(diào)零，在530 nm處檢測(cè)吸光值(A)。

乳酸含量(mmol/L)=(樣品A值/標(biāo)準(zhǔn)品A值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(3 mmol/L)

2.5 HIF-1、LDHA、GLUT1蛋白表達(dá)的檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SW620細(xì)胞以1.2×105個(gè)/mL密度接種于6孔培養(yǎng)板中，分為對(duì)照組、SPD(0.625、1.25、2.5 μmol/L)組，24 h后，棄去培養(yǎng)液，給藥組加入含不同濃度的藥物，對(duì)照組加入等量無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行總蛋白定量，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，顯影及定影。用WO-9413B 型凝膠成像系統(tǒng)自帶軟件Gelpro 32分析膠片中的蛋白條帶，以各組灰度面積的乘積/內(nèi)參(β-actin)灰度面積的乘積反映相對(duì)蛋白表達(dá)豐度。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 SPD對(duì)SW620細(xì)胞增殖的影響

細(xì)胞培養(yǎng)24 h，與對(duì)照組比較，不同濃度的SPD作用于SW620細(xì)胞后，能明顯促進(jìn)細(xì)胞的增殖，且隨著SPD濃度增大，其促進(jìn)作用越明顯(P<0.01)，呈劑量依賴性，見表1。

表1 不同濃度SPD對(duì)SW620細(xì)胞增殖的影響

組別劑量/(μmoL·L-1)A值細(xì)胞增殖率/%對(duì)照組-1.168±0.017-SPD0.6251.351±0.003**15.901.251.441±0.002**23.602.51.542±0.003**32.28

與對(duì)照組比較：**P<0.01。

3.2 SPD對(duì)SW620細(xì)胞葡萄糖消耗和乳酸含量的影響

不同濃度SPD作用于SW620細(xì)胞24 h后，SW620細(xì)胞的葡萄糖消耗量和乳酸含量明顯增加，與對(duì)照組比較，P<0.01，且隨著SPD濃度增加，細(xì)胞產(chǎn)生的乳酸含量也越高，其促進(jìn)葡萄糖消耗的作用也增強(qiáng)，呈劑量依賴性，見表2。

3.3 SPD對(duì)SW620細(xì)胞糖酵解相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果見圖1，不同藥物處理24 h后，對(duì)照組HIF-1、LDHA 和GLUT1蛋白表達(dá)量明顯低于SPD各濃度組，加入不同濃度SPD后，SW620細(xì)胞中HIF-1、LDHA和GLUT1各組的條帶顏色均比對(duì)照組深(見圖1A)。對(duì)條帶的灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，隨著SPD濃度增加，3種蛋白表達(dá)水平也逐漸升高，且呈劑量依賴性，其中2.5 μmoL/L的SPD作用效果最明顯，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1B～D。提示SPD可通過促進(jìn)糖酵解相關(guān)基因HIF-1、LDHA 和GLUT1的蛋白表達(dá)從而促進(jìn)SW620 細(xì)胞糖酵解。

表2 不同濃度SPD對(duì)SW620細(xì)胞葡萄糖消耗及乳酸含量的影響

組別劑量/(μmoL·L-1)葡萄糖消耗量/(mmol·L-1)乳酸含量/(mmol·L-1)對(duì)照組-5.428±0.0055.331±0.007SPD0.6255.731±0.007**6.176±0.009**1.256.915±0.007**7.215±0.012**2.57.503±0.003**7.665±0.012**

與對(duì)照組比較：**P<0.01。

4 討論

多胺是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育和促進(jìn)組織創(chuàng)傷愈合的細(xì)胞信號(hào)分子，是細(xì)胞生長(zhǎng)和分化過程中不可缺少的物質(zhì)，在快速增殖的組織細(xì)胞內(nèi)多伴有多胺含量的增加，其在腫瘤患者的體液及尿液中的含量明顯升高，已成為腫瘤的標(biāo)志物[6]。ODC為多胺合成的限速酶，在許多上皮組織相關(guān)癌癥如結(jié)腸癌和皮膚癌等的發(fā)生過程中，多胺濃度和多胺合成限速酶ODC表達(dá)顯著增加[7-8]。同時(shí)ODC是致癌基因c-myc的靶基因，c-myc水平增加時(shí)，ODC基因啟動(dòng)子可與Myc/Max轉(zhuǎn)錄復(fù)合物結(jié)合，從而使ODC水平的增加，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[9-10]。

研究發(fā)現(xiàn)，病理?xiàng)l件下如腫瘤環(huán)境中，缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)和c-myc有協(xié)同作用，c-myc在常氧和乏氧條件下都可以促進(jìn)HIF-1α的蛋白表達(dá)[11]。HIF-1是缺氧條件下廣泛存在于哺乳動(dòng)物和人體內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子，在大多數(shù)腫瘤組織及其轉(zhuǎn)移灶中高表達(dá)，且在缺氧誘導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)節(jié)中起著核心作用[12]。惡性腫瘤的最主要特征是腫瘤細(xì)胞難以控制的生長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞數(shù)不斷增加導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)供氧不定，造成癌組織內(nèi)乏氧微環(huán)境的形成，進(jìn)而導(dǎo)致HIF表達(dá)的增多。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)HIF-1可激活或誘導(dǎo)其下游靶基因如GLUT-1、LDHA、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等的表達(dá)[13]，以提高葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、糖酵解及血管生成，使腫瘤適應(yīng)缺氧環(huán)境而繼續(xù)增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。一方面GLUT-1是目前已知體內(nèi)分布最為廣泛的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體，是調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的主要因子[14]，HIF-1表達(dá)增加，激活葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因如GLUT1表達(dá)，促進(jìn)糖代謝，從而滿足腫瘤生長(zhǎng)的能量需求。另一方面，糖代謝途徑表明，一旦機(jī)體處于低氧代謝狀態(tài)，其無(wú)氧酵解就相對(duì)活躍，LDHA是無(wú)氧酵解中

A.各組條帶; B. HIF-1和β-actin 蛋白表達(dá)比值; C. LDHA和β-actin 蛋白表達(dá)比值; D. GLUT1和β-actin 蛋白表達(dá)比值。

與對(duì)照組比較：**P<0.01。

圖1 不同濃度SPD對(duì)SW620細(xì)胞HIF-1、LDHA和GLUT1蛋白表達(dá)的影響

Figure 1 Effect of different concentrations of SPD on the expression of HIF-1,LDHA and GLUT1 in SW620 cells

一個(gè)重要酶系，據(jù)報(bào)道，胃癌患者組織中的的LDHA明顯高于普通人[15]，同時(shí)HIF-1能夠調(diào)控LDHA基因的表達(dá)，且致癌基因c-myc能結(jié)合并激活LDHA啟動(dòng)子，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄水平的增高和促進(jìn)乳酸的形成[16-17]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SPD能夠明顯促進(jìn)SW620細(xì)胞的增殖及葡萄糖的消耗，隨著SPD的濃度升高，其促進(jìn)作用越明顯，且呈劑量依賴性。同時(shí)，各濃度的SPD均能夠明顯增加細(xì)胞中乳酸含量，促進(jìn)HIF-1、GLUT1及LDHA蛋白水平的表達(dá)，且隨著精脒濃度越高，其促進(jìn)作用越明顯，呈劑量依賴性。結(jié)合c-myc可激活ODC的表達(dá)從而促進(jìn)多胺的生成，而c-myc同樣可以促進(jìn)HIF-1α蛋白表達(dá)的理論依據(jù)，筆者認(rèn)為多胺能夠通過促進(jìn)HIF-1基因的表達(dá)，從而促進(jìn)糖酵解過程，加快腫瘤細(xì)胞的增殖。

結(jié)腸癌是我國(guó)常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，本實(shí)驗(yàn)通過多胺對(duì)HIF-1等糖酵解相關(guān)基因的影響的初步探討，能夠?yàn)閺捏w外控制多胺的攝入從而控制腫瘤的發(fā)展提供了一個(gè)方向，也為結(jié)腸癌的預(yù)防及治療提供新的思路。但多胺對(duì)在c-myc水平增加誘導(dǎo)HIF-1α蛋白上調(diào)、促進(jìn)糖酵解的作用機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯：幸建華)

Effect of spermidine on the growth and glycolysis of SW620 cells

ZHANG Fen,WU Yanyan,ZANG Linquan,PAN Xuediao,WANG Guixiang

(CollegeofPharmacy,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

Objective To investigate the effect of spermidine (SPD) on the growth and glycolysis of SW620 cells. Methods SW620 cells were culturedinvitroroutinely with different concentrations (0.625-2.5 μmol/L). Cell proliferation was detected by MTT. Glucose consumption and lactate concentrations were detected by test kit. The expression of HIF-1,LDHA and GLUT1 was detected by western blot. Results Compared with the control group,SPD promoted the proliferation of SW620 cells (P<0.01). SPD with different concentrations increased the glucose consumption and lactate concentrations in SW620 cells (P<0.01). Meantime,the expression of HIF-1,LDHA and GLUT1 was increased with the increased concentrations of SPD (P<0.01). Conclusion SPD could promote the proliferation and glycolysis of SW620 cells.

SPD; SW620cell; cell proliferation; glycolysis

2016-09-13

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81302895；81102465)

張芬(1990—)，女，2014級(jí)碩士研究生，Email：1083920874@qq.com；通信作者：王桂香(1975—)，女，副教授，主要從事藥理學(xué)研究，Email：wgx306 @qq.com。

時(shí)間：2016-12-12 11:28

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161212.1128.001.html

R965

A

1006-8783(2016)06-0767-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016091307