楊慧慧,王秀珍

(廣東藥科大學(xué) 1.中藥學(xué)院； 2.藥學(xué)院,廣東 廣州 510006)

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柚皮苷體外抗腫瘤活性及其機(jī)制研究

楊慧慧1,王秀珍2

(廣東藥科大學(xué) 1.中藥學(xué)院； 2.藥學(xué)院,廣東 廣州 510006)

目的 研究柚皮苷的體外抗腫瘤活性。方法 采用MTT法測定柚皮苷對5種不同腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測柚皮苷對細(xì)胞凋亡、細(xì)胞活性氧水平及細(xì)胞線粒體膜電位水平的變化。采用單細(xì)胞凝膠電泳(SCGE)實(shí)驗(yàn)檢測柚皮苷對細(xì)胞DNA的損傷。結(jié)果 MTT實(shí)驗(yàn)得出柚皮苷對不同的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生不同的增殖抑制現(xiàn)象，并且對腫瘤細(xì)胞的抑制作用呈濃度依賴性。其對PC-12細(xì)胞作用24 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測得到柚皮苷能有效誘導(dǎo)PC-12細(xì)胞的凋亡，并且細(xì)胞內(nèi)活性氧水平升高，線粒體膜電位下降。SCGE實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)柚皮苷使細(xì)胞DNA斷裂，形成拖尾。結(jié)論 柚皮苷通過活性氧調(diào)控的線粒體途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞PC-12的凋亡。

柚皮苷； 流式細(xì)胞術(shù)； 單細(xì)胞凝膠電泳； 細(xì)胞凋亡

柚皮苷，雙氫黃酮類化合物，白色至淺黃色結(jié)晶性粉末，是一種天然的苦味劑，毒副作用較小[1]。研究表明其具有抗炎、抗氧化、抑菌、降血糖、抗腫瘤、防治心血管疾病、抗動(dòng)脈粥樣硬化[2-4]等多種生物活性。柚皮苷對肝癌、W256癌肉瘤、宮頸癌、結(jié)腸癌[5-8]等的抗腫瘤效果已得到證實(shí)，但其作用機(jī)制尚不明確。目前癌癥的發(fā)生已嚴(yán)重危害到人類的健康與生存，國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)已從放療化療等方面逐步向?qū)ふ议_發(fā)低毒有效的天然抗腫瘤藥物方面轉(zhuǎn)變。因此本實(shí)驗(yàn)研究柚皮苷對不同腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，進(jìn)一步闡明柚皮苷抗腫瘤的可能作用機(jī)制。柚皮苷的結(jié)構(gòu)如圖1。

圖1 柚皮苷的結(jié)構(gòu)

Figure 1 Structure of naringin

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

柚皮苷(上海晶純生化科技股份有限公司)； RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；新生牛血清(杭州四季青生物材料有限公司)；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、活性氧檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；MCO-15AC型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本松下電氣公司)；SW-CJ-2F型細(xì)胞培養(yǎng)超凈臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；Varioskan Flash型酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific公司)；DMI3000B型倒置熒光顯微鏡(德國LEICA公司)；Fasealibur型流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 柚皮苷對腫瘤細(xì)胞的體外增殖抑制作用采用MTT實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)[9]。柚皮苷分別作用于不同腫瘤細(xì)胞48 h后收集對數(shù)期的SGC-7901、Bel-7402、PC-12、SiHa、HepG-2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液，分別向96孔板中每孔加入100 μL CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度梯度的柚皮苷溶液(1.57～100 μmol/L)，37 ℃ 5%(φ)CO2繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入10 μL MTT溶液，培養(yǎng)4 h后加100 μL DMSO，酶標(biāo)儀490 nm 測吸光度值(A)。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 采用Annexin V-PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡[10]，取對數(shù)生長期的PC-12細(xì)胞接種6孔板，待細(xì)胞貼壁后，分別向每孔加入不同濃度的柚皮苷(20、40、60 μmol/L)作用24 h，并設(shè)置不加藥空白對照組。收集各孔細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗2遍，按Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書操作避光染色20 min，轉(zhuǎn)移至流式管中用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.3 單細(xì)胞凝膠電泳 單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)也稱彗星電泳實(shí)驗(yàn)[11]，取處于對數(shù)生長期的PC-12細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后分別向每孔加入不同濃度的柚皮苷(20、40、60 μmol/L)處理24 h，同時(shí)留空白對照孔。消化細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，顯微鏡下計(jì)數(shù)。采用三層制膠法依次制備瓊脂糖玻片，堿性細(xì)胞裂解液裂解70 min，預(yù)冷電泳液解旋20 min，電泳20 min，中和緩沖液中和30 min，EB染色10 min，倒置熒光顯微鏡拍照。

1.2.4 細(xì)胞活性氧水平的檢測 選擇生長狀態(tài)較佳的PC-12細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞鋪滿80%后加入不同濃度柚皮苷(20、40、60 μmol/L)處理24 h，留空白對照孔。消化細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗2遍，用熒光探針DCFH-DA進(jìn)行染色，染色完畢PBS洗2遍，重懸，轉(zhuǎn)移至流式管，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。其中檢測激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm。

1.2.5 細(xì)胞線粒體膜電位的檢測 取生長狀態(tài)佳的PC-12細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞鋪滿80%后加入不同濃度柚皮苷(20、40、60 μmol/L)處理24 h，預(yù)留空白對照孔。消化細(xì)胞，PBS洗2遍，JC-1染色工作液避光染色，染色完成后用預(yù)冷的JC-1染色緩沖液清洗2遍，PBS重懸，轉(zhuǎn)移至流式管，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

2 結(jié)果

2.1 柚皮苷對腫瘤細(xì)胞的體外增殖抑制作用

柚皮苷分別作用于不同腫瘤細(xì)胞48 h后，酶標(biāo)儀490 nm 測得吸光值，SPSS 19.0 處理MTT結(jié)果顯示，柚皮苷對PC-12細(xì)胞的增殖抑制作用較為明顯，IC50為40.8 μmol/L，對SGC-7901細(xì)胞作用較弱，IC50為383.7 μmol/L，細(xì)胞存活率隨柚皮苷的濃度增加而降低。另外對本次實(shí)驗(yàn)的其他腫瘤細(xì)胞無體外增殖抑制作用，其IC50值均大于1 000 μmol/L。因此本實(shí)驗(yàn)選取PC-12細(xì)胞作進(jìn)一步研究。

2.2 柚皮苷對PC-12細(xì)胞凋亡的影響

不同濃度柚皮苷作用于PC-12細(xì)胞24 h后，細(xì)胞凋亡情況如圖2。通過流式細(xì)胞儀檢測可以得出，與空白對照組比較，加藥組20 μmol/L的早期凋亡率增加至1.53%，柚皮苷濃度為40 μmol/L時(shí)，PC-12細(xì)胞早期凋亡率增加至2.31%、當(dāng)柚皮苷濃度為60 μmol/L 時(shí)，PC-12細(xì)胞早期凋亡率增加至4.00%。同時(shí)加入不同濃度柚皮苷(20、40、60 μmol/L)處理PC-12細(xì)胞24 h后，PC-12晚期凋亡率也分別增加至2.98%、3.51%、4.47%。數(shù)據(jù)表明，柚皮苷有效地誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡，并呈濃度依賴性。

A. PC-12細(xì)胞空白對照組細(xì)胞凋亡分布圖； B、C、D分別為濃度20、40、60 μmol/L柚皮苷誘導(dǎo) PC-12細(xì)胞凋亡分布圖。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測柚皮苷對PC-12細(xì)胞凋亡的影響

Figure 2 Effect of naringin on PC-12 cell apoptosis by FCM

2.3 單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)

單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)通過熒光顯微鏡拍照看出，空白對照組細(xì)胞DNA未受損，因此沒有出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。當(dāng)加入濃度為20 μmol/L的柚皮苷后，細(xì)胞DNA受損片段化，出現(xiàn)輕微拖尾現(xiàn)象。當(dāng)加入40 μmol/L的柚皮苷后，尾巴增長，并且亮度也有所增加。加入60 μmol/L的柚皮苷后，細(xì)胞DNA受損最嚴(yán)重，拖尾最長。不同濃度柚皮苷對DNA損傷程度見圖3。

A.空白對照組PC-12細(xì)胞核； B. 20 μmol/L柚皮苷；C. 40 μmol/L柚皮苷； D. 60 μmol/L柚皮苷。

圖3 不同濃度柚皮苷對PC-12細(xì)胞核損傷實(shí)驗(yàn)(200×)

Figure 3 Effect of naringin on DNA damage in PC-12 cells(200×)

2.4 細(xì)胞活性氧水平變化的檢測

不同濃度柚皮苷作用PC-12細(xì)胞24 h后，空白對照組活性氧水平熒光強(qiáng)度為6.17，加入20、40、60 μmol/L柚皮苷處理后產(chǎn)生的活性氧水平熒光強(qiáng)度分別為464、467和543。與空白對照比較，活性氧水平熒光強(qiáng)度增加75.2、75.7、88.0倍?；钚匝跛綗晒鈴?qiáng)度的增加暗示細(xì)胞內(nèi)活性氧水平提高，而且活性氧水平隨柚皮苷濃度增加而提高?；钚匝跛綗晒鈴?qiáng)度變化如圖4。

A. 空白對照組PC-12細(xì)胞內(nèi)DCF熒光強(qiáng)度；B、C、D.分別為20、40、60 μmol/L柚皮苷引起細(xì)胞內(nèi)DCF熒光變化。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測柚皮苷對PC-12細(xì)胞活性氧水平的影響

Figure 4 Effect of naringin on cell ROS levels in PC-12 cells by FCM

2.5 細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位變化的檢測

不同濃度柚皮苷作用PC-12細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位變化結(jié)果見圖5。柚皮苷組與空白對照組比較，F(xiàn)L1-H通道的紅色熒光減弱，F(xiàn)L2-H通道的綠色熒光增強(qiáng)?？瞻讓φ战M紅色與綠色熒光比值(Q2/Q3)為4.07。加入20、40、60 μmol/L柚皮苷作用PC-12細(xì)胞24 h，其紅綠比分別為2.96、1.44、1.04。紅綠比值的下降，表明紅色熒光強(qiáng)度逐漸減少，綠色熒光強(qiáng)度增加。說明柚皮苷能夠誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位降低。

A.空白對照組JC-1發(fā)出的紅色和綠色熒光； B、C、D分別為20、40、60 μmol/L 柚皮苷處理PC-12細(xì)胞誘導(dǎo)JC-1發(fā)出的紅色和綠色熒光。

圖5 流式細(xì)胞儀檢測柚皮苷對PC-12細(xì)胞線粒體膜電位的影響

Figure 5 Effect of naringin on the mitochondrial membrane potential in PC-12 cells by FCM

3 討論

柚皮苷作為黃酮類化合物的一種，已有大量研究報(bào)道表明其具有多種生物活性，但是近年來的研究報(bào)道主要趨向于抑菌、抗氧化等方面，對于其體外抗腫瘤方面的報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)研究以柚皮苷為考察目標(biāo)，采用MTT法測定其對不同腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)柚皮苷對腫瘤細(xì)胞PC-12具有良好的增殖抑制作用，因此，選取該細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象來探究柚皮苷體外抗腫瘤的作用機(jī)制。

研究表明柚皮苷的抗腫瘤活性與其苯環(huán)取代基有關(guān)，A酚環(huán)上的糖結(jié)合物的類型起重要作用，羥基連在B環(huán)上同樣也有強(qiáng)的抗腫瘤活性，B環(huán)上3、4和5連有羥基或B環(huán)有一鄰位酚結(jié)構(gòu)和飽和的C環(huán)都顯示出很強(qiáng)的抗腫瘤活性[12]。文獻(xiàn)[13]表明柚皮苷主要抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，抑制癌基因表達(dá)等。

促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡是抗癌藥物發(fā)揮作用的重要方式，細(xì)胞活性氧水平的變化與細(xì)胞線粒體膜電位的變化在腫瘤細(xì)胞的死亡和凋亡過程中均起著重要作用[14-15]。當(dāng)PC-12細(xì)胞加入20 μmol/L柚皮苷作用24 h后，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平急劇增加，是空白對照組活性氧水平的75.2倍。由于細(xì)胞內(nèi)活性氧的主要來源為線粒體，線粒體膜電位的檢測熒光探針能快速靈敏地檢測細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的變化。在高點(diǎn)位時(shí)發(fā)出紅色熒光，而在低細(xì)胞膜電位時(shí)發(fā)出綠色熒光[16]。本研究在流式細(xì)胞儀中也檢測到線粒體膜電位水平下降，紅色綠色熒光比值由空白對照組的4.07降至2.96，線粒體膜電位的下降是細(xì)胞早期凋亡的重要標(biāo)志。并且通過流式細(xì)胞儀檢測柚皮苷對PC-12細(xì)胞的凋亡作用可知，當(dāng)PC-12細(xì)胞加入20 μmol/L柚皮苷作用后，細(xì)胞凋亡率由空白對照組的0.033%增加至4.51%。由此可知，本研究所采取的3種實(shí)驗(yàn)方法均得出相同結(jié)果：柚皮苷濃度為20 μmol/L時(shí)已引起了PC-12細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PC-12細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)濃度依賴性。

目前已知抗腫瘤藥物作用靶點(diǎn)較多集中在細(xì)胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體等[17]。單細(xì)胞凝膠電泳(SCGE)實(shí)驗(yàn)用于檢測單鏈DNA斷裂，在堿性條件下解旋電泳，斷鏈或碎片向陽極遷移，形成拖尾。細(xì)胞核DNA損傷愈嚴(yán)重，產(chǎn)生的斷鏈或短片也就愈小，在電場作用下遷移的DNA量多，表現(xiàn)為彗星尾巴長度的增加和尾部熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。因此，通過測定DNA遷移部分的吸光度或遷移長度就可定量測定單個(gè)細(xì)胞DNA損傷程度[11]。本研究中空白對照組細(xì)胞核DNA正常，加藥組均出現(xiàn)拖尾，并且隨著藥物濃度的增加尾巴長度與熒光強(qiáng)度均有所增加，由此可知柚皮苷作用于PC-12細(xì)胞促使其發(fā)生凋亡的作用靶點(diǎn)主要集中在細(xì)胞核。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明柚皮苷可以有效地抑制PC-12細(xì)胞的體外增殖，并誘導(dǎo)其產(chǎn)生凋亡，這為柚皮苷體的外抗腫瘤機(jī)制提供了依據(jù)，但是藥物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的主要作用靶點(diǎn)尚不清晰，是否存在靶點(diǎn)轉(zhuǎn)移現(xiàn)象有待進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯：幸建華)

Effect and mechanism of naringin on antitumor activity in vitro

YANG Huihui1,WANG Xiuzhen2

(1.SchoolofTraditionalChineseMedicine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.SchoolofPharmacy,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

Objective To study the anticancer activity of naringininvitro. Methods MTT assay was used to detect the growth inhibition of naringin on human cancer cell lines. Flow cytometry was used to analyze the cell apoptosis,reactive oxygen species and the changes of mitochondrial membrane potential. DNA damage was investigated by single cell gel electrophoresis (SCGE). Results Treatment with naringin inhibited the proliferation of PC-12,SGC-7901,Bel-7402,HepG-2 and SiHa cells in a dose-dependent way. Naringin induced cell apoptosis,increased ROS levels and decreased the mitochondrial membrane potential in PC-12 cells. Additionally,naringin induced DNA damage in PC-12 cells. Conclusion Naringin may induce PC-12 cell apoptosis through modulation of ROS-mediated mitochondrial pathway.

naringin; flow cytometry; single cell gel electrophoresis; apoptosis

2016-09-21

楊慧慧，女，2014級(jí)碩士研究生，Email:yanghuicd@126.com；通信作者：王秀珍，女，博士，副教授，主要從事小分子藥物設(shè)計(jì)合成及抗腫瘤活性研究，Email:wxzqq1234@163.com。

時(shí)間：2016-11-29 10:03

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161129.1003.004.html

R965

A

1006-8783(2016)06-0757-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016091201