陳華譜， 李 臻， 鄧思平， 朱春華， 李廣麗??， 鐘鴻干

(1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，海洋生態(tài)與養(yǎng)殖環(huán)境湛江市重點實驗室,廣東 湛江 524088；2.三亞市海洋與漁業(yè)監(jiān)測中心,海南 三亞 572000)

研究簡報

斜帶石斑魚卷軸受體3基因的分離及表達(dá)分析研究?

陳華譜1， 李 臻1， 鄧思平1， 朱春華1， 李廣麗1??， 鐘鴻干2

(1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，海洋生態(tài)與養(yǎng)殖環(huán)境湛江市重點實驗室,廣東 湛江 524088；2.三亞市海洋與漁業(yè)監(jiān)測中心,海南 三亞 572000)

利用cDNA末端快速擴增技術(shù)(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆鑒定出斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)卷軸受體3(Frizzled 3,gFZD3)基因的cDNA序列全長，使用ClustalX(1.81)和MEGA4.0軟件分別進行了序列同源比對和系統(tǒng)進化樹分析；利用RT-PCR檢測gFZD3在成魚不同組織中的表達(dá)和gFZD3在胚胎發(fā)育及卵巢發(fā)育過程中的表達(dá)模式。研究顯示：gFZD3 cDNA序列全長為2278bp，其中開放讀碼框為2079bp，編碼692個氨基酸；序列同源性分析表明，gFZD3的氨基酸序列具有FZD家族保守的功能結(jié)構(gòu)域；脊椎動物的FZD3系統(tǒng)進化樹分析顯示，斜帶石斑魚與大黃魚(Larimichthyscrocea)的親緣關(guān)系最近；在成魚的組織分布中，只在腦區(qū)和性腺中檢測到gFZD3表達(dá)信號，其中在卵巢中表達(dá)量最高；在胚胎發(fā)育過程中，在未受精卵和受精卵中g(shù)FZD3的表達(dá)量最高，隨著胚胎的發(fā)育呈逐漸下降趨勢；在卵巢發(fā)育過程中，gFZD3的表達(dá)在早期卵巢中相對較低，在隨后的III和IV期卵巢中較高。研究結(jié)果表明，F(xiàn)ZD3序列在脊椎動物中具有較高的保守性；斜帶石斑魚gFZD3的表達(dá)具有明顯的組織特異性，并在胚胎和卵巢發(fā)育中，可能主要作用于胚胎發(fā)育的早期和卵巢發(fā)育的后期。本研究為進一步研究Wnt信號通路在斜帶石斑魚生殖調(diào)控中的作用提供了參考。

斜帶石斑魚；卷軸受體3基因；胚胎發(fā)育；卵巢發(fā)育;RT-PCR

Wnt(Wingless-type MMTV integration site family member)信號在細(xì)胞增殖、分化和凋亡等重要的生命活動過程中發(fā)揮著十分重要的調(diào)節(jié)作用[1-2]。目前，Wnt信號通路在性別分化與卵巢發(fā)育中的生理功能越來越受到關(guān)注。其中，Wnt4(Wingless-type MMTV integration site family member 4)作為Wnt家族中與性別及生殖調(diào)控最相關(guān)的成員，已被廣泛研究[3-6]。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt4主要通過參與調(diào)控繆勒氏管及其派生器官的形成，抑制雄性結(jié)構(gòu)的發(fā)育，促進雌性性腺的正常發(fā)育，從而成為了重要的雌性調(diào)節(jié)因子[3-4]。另外，Wnt4的缺失會導(dǎo)致雌性到雄性的性逆轉(zhuǎn)[5-6]。近年來，Wnt信號通路在魚類性別調(diào)控與性腺發(fā)育中的研究也相繼展開。研究表明，在黑鯛(Sparusmacrocephlus)中Wnt4參與了黑鯛雄到雌性逆轉(zhuǎn)的調(diào)控[7]，在虹鱒(Oncorhynchusmykiss)中Wnt4和哺乳類一樣，在早期的性腺發(fā)育中發(fā)揮著十分重要的作用[8]。目前，Wnt信號通路已被證實在性別與生殖調(diào)控中具有十分重要的作用，但其確切的信號通路尚不清楚，可能是由于Wnt信號分子的受體—卷軸受體FZD(Frizzled)種類繁多，信號調(diào)控錯綜復(fù)雜，導(dǎo)致通路難以鑒定[4]。

Wnt信號通路發(fā)現(xiàn)30多年來，研究熱點主要還是在配體Wnt信號分子上，而對Wnt信號通路中的真正傳導(dǎo)與執(zhí)行者—FZD受體的研究相對較少。因此，闡明Wnt信號通路的分子機制，務(wù)必要深入開展受體FZD的研究。FZD基因最早是在果蠅(Drosophilamelanogaster)中被發(fā)現(xiàn)。該基因的突變能破壞成年果蠅表皮細(xì)胞的極性[9-10]。目前，在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)10種FZD基因亞型[4]，而在斑馬魚(Daniorerio)中，通過NCBI數(shù)據(jù)庫搜索，只預(yù)測到9種FZD亞型。

哺乳類和魚類的FZD基因序列結(jié)構(gòu)差異較大，可能會導(dǎo)致其生理功能的差異。因此，開展魚類FZD受體的研究，對Wnt信號通路的研究有重要的補充作用。FZD3屬于FZD家族成員之一，在早期神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和色素細(xì)胞形成過程中具有十分重要的作用[11-12]，同時被作為神經(jīng)類疾病的標(biāo)記而受到廣泛的關(guān)注[13-14]。在魚類中，研究已表明FZD3對斑馬魚端腦和眼睛等器官的發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)功能[15-16]，但在其他組織中的生理功能尚無研究。

斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)是一種雌雄同體、先雌后雄魚類，但其性別調(diào)控的機制尚未清楚。斜帶石斑魚這種特別的生殖調(diào)控及性腺發(fā)育方式使其成為了研究性別調(diào)控與雌性發(fā)育的理想模型[17]。本研究以我國南方重要的海水養(yǎng)殖魚類斜帶石斑魚為研究對象，利用cDNA末端快速擴增技術(shù)(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)的方法克隆斜帶石斑魚Frizzled 3(gFZD3)基因的cDNA序列全長，并開展了序列分析。同時，檢測gFZD3基因在斜帶石斑魚成魚中各組織、不同胚胎及卵巢發(fā)育時期的表達(dá)模式。本研究初步探討了斜帶石斑魚gFZD3基因的表達(dá)模式，為后續(xù)研究Wnt信號通路在斜帶石斑魚生殖調(diào)控中的功能提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗魚 斜帶石斑魚雌性成魚活體(體長(36.00±3.00)cm;體重(1.40±0.20) kg；數(shù)量為3條)購自廣東省湛江市東風(fēng)市場。將嗅球、端腦、中腦、小腦、延腦、下丘腦、垂體、肝臟、卵巢、心臟、腎臟、脾臟、胃、腸、鰓和肌肉等組織器官取出后立即置于液氮中，并保存在-80℃超低溫冰箱備用；卵巢發(fā)育樣本取于海南陵水養(yǎng)殖基地。從1齡斜帶石斑魚(體長(13.00±1.50)cm)開始，到第二年4月(2齡，體長(25.00±2.00)cm)和第三年4月(3齡，體長(38.00±3.00)cm)連續(xù)跟蹤取樣3次。取樣時，先將實驗魚置于含丁香酚(30mg/L)的海水中深度麻醉，然后取出部分卵巢，置于凍存管中，液氮保存，同時取出一小塊卵巢置于波恩試液中固定過夜，然后石蠟組織超薄切片及蘇木素伊紅染色。每次取10條魚樣本，并根據(jù)卵巢的組織學(xué)特征進行分析與歸類[15]。

1.1.2 胚胎樣本 斜帶石斑魚胚胎收集于海南陵水養(yǎng)殖基地。首先，挑選健康和成熟度較好的斜帶石斑魚親魚提前一天進行人工催產(chǎn)，并通過人工擠卵，獲得未授精卵，并取大約50粒上浮的活卵于潔凈的凍存管中，置于液氮保存。然后，利用濕法人工授精的方法獲得斜帶石斑魚受精卵，并置于水溫25～28℃、鹽度30的孵化池中進行孵化，同時在體視顯微鏡下連續(xù)觀察與取樣。根據(jù)胚胎發(fā)育不同時期的形體特征[18]，分別取樣，包括受精卵、細(xì)胞期、4細(xì)胞期、8細(xì)胞期、16細(xì)胞期、32細(xì)胞期、多細(xì)胞期、桑葚期、囊胚期、原腸期、胚體形成期、視囊形成期、肌節(jié)形成期、聽囊形成期、腦泡形成期、心臟形成期、尾芽形成期、心臟跳動和晶體形成期和將孵期，每個時期取大約50個胚胎于凍存管，并由液氮凍存?zhèn)溆?。胚胎發(fā)育時期的樣本共取樣3個批次(n=3)。

1.2 方法

1.2.1 引物 根據(jù)NCBI網(wǎng)站中GENBANK的魚類與其他脊椎動物FZD3基因cDNA序列的保守部分，設(shè)計克隆斜帶石斑魚gFZD3基因的簡并引物。引物見表l。

表1 斜帶石斑魚gFZD3基因克隆與定量RT-PCR分析所用引物

Note: ①Partail cDNA PCR; ②Adaptor Primers; ③ORF PCR; ④Tissue distribution PCR and quantitative RT-PCR

1.2.2 總RNA的提取 從-80℃超低溫冰箱取超低溫凍存的樣本，采用注射器抽提或液氮研磨方法進行組織搗碎勻漿?？俁NA提取參照Trizol ? reagent (Invitrogen, USA)試劑盒說明書操作?？俁NA提取后，利用紫外分光光度計進行濃度和純度檢測，最后吸取1μg總RNA進行0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分析，檢測RNA的完整性。

1.2.3 基因克隆與序列分析 利用卵巢和全腦的總RNA混合樣本作為合成第一鏈cDNA的模板，根據(jù)Smart-RCAE試劑盒(Clontech Takara，Japan)說明書，合成gFZD3基因5’端和3’端的第一鏈cDNA，并克隆獲得gFZD3的cDNA序列全長。利用DNAtools 6.0軟件將獲得的gFZD3序列進行預(yù)測并翻譯成相應(yīng)的氨基酸序列。采用DNASTAR軟件對脊椎動物不同物種的FZD3序列進行同源性比較。利用SignalIP 3.0網(wǎng)站上預(yù)測基因的信號肽，用TMHMM Server v. 2.0預(yù)測分析蛋白的跨膜區(qū)。以Mega 4.0的鄰位相鄰法構(gòu)建蛋白的系統(tǒng)進化樹[19-20]。

1.2.4 組織分布 吸取各個組織1μg總RNA，經(jīng)DNaseⅠ處理之后，按照First Strand cDNA Synthesis Kit ReverTra Ace-α(TOYOBO, Japan)的說明書進行cDNA第一鏈合成。其后利用斜帶石斑魚FZD3的特異引物(gFZD3-QF和gFZD3-QR)進行各組織的基因表達(dá)PCR檢測。PCR反應(yīng)體系為20μL，反應(yīng)條件為預(yù)變性94℃ 3min，變性94℃ 30s，退火58℃ 30s，延伸72℃ 30s，40個循環(huán)后72℃延伸10min。18s(18s ribosome RNA)基因作為內(nèi)參。吸取5μL的擴增產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用天能Tanon 2500R全自動數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)進行半定量表達(dá)分析。

1.2.5實時熒光定量RT-PCR分析 將斜帶石斑魚gFZD3和18s特異引物克隆獲得的特異基因片段，分別連接插入T載體中，構(gòu)建質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品，經(jīng)轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取后，再將質(zhì)粒逐級稀釋，構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線。參照SYBR?Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO, Japan)試劑盒說明書準(zhǔn)備反應(yīng)體系，利用RocheLight Cycler 480 real time PCR system進行基因表達(dá)的檢測。具體反應(yīng)程序為：首先95℃預(yù)變性1min；95℃變性5s，57℃退火10s，72℃延伸20s，84℃收集熒光10s，共40個循環(huán)；溶解曲線：95℃ 1min，52℃ 1min，95℃繼續(xù)。每個樣品3次重復(fù)，每次重復(fù)均用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量出相對應(yīng)的域值(Cp)和cDNA拷貝數(shù)。目的基因相對表達(dá)量以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)分析采用SPSS統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 斜帶石斑魚gFZD3 cDNA的克隆和序列分析

斜帶石斑魚gFZD3的cDNA全長序列長2278bp，開放閱讀框編碼692aa，其中前17個氨基酸殘基為信號肽。經(jīng)Expasy tools預(yù)測，gFZD3基因的前體蛋白分子量約為78.0 kDa。利用InterProScan對斜帶石斑魚gFZD3氨基酸序列進行分析預(yù)測，結(jié)果顯示gFZD3屬于G蛋白偶聯(lián)型受體蛋白家族，胞外N-末端是一個富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(Cysteinyl-rich Domain，CRD)，含有13個保守的半胱氨酸，其后是七次跨膜螺旋，胞內(nèi)部分包括了Loop1、Loop2和Loop3三個環(huán)，以及一個C-末端。2個胞外環(huán)之間形成了一個二硫鍵，是由第289位和第364位的半胱氨酸形成的。緊隨跨膜螺旋結(jié)構(gòu)后，胞內(nèi)部分含有一個保守的K-T-X-X-W結(jié)構(gòu)域(見圖1)。通過Kyte-Doolittle疏水性分析，gFZD3前體蛋白含有七個疏水性很強的區(qū)域，是潛在的跨膜區(qū)(見圖2)。斜帶石斑魚gFZD3氨基酸序列與大黃魚的相似性最高，為76.2%，與安樂蜥、非洲爪蟾和小鼠分別為71.5%、69.8%和69.7%。

2.2 斜帶石斑魚gFZD3的系統(tǒng)進化樹分析

利用MEGA4.0的鄰位相連算法(Neighbor-joining method)構(gòu)建斜帶石斑魚和其他脊椎動物FZD的系統(tǒng)進化樹(見圖3)。系統(tǒng)進化樹的結(jié)果顯示，斜帶石斑魚gFZD3與其他脊椎動物FZD3聚為一簇，成為一個獨立的進化分支，區(qū)別于其他FZD亞型，同時也表明斜帶石斑魚與大黃魚的親緣關(guān)系最近，與爬行動物蜥蜴以及小鼠、牛、馬和人類等哺乳動物的關(guān)系較遠(yuǎn)，符合動物進化地位的分類。

2.3 斜帶石斑魚gFZD3 mRNA在各組織中的表達(dá)分布

通過RT-PCR分析斜帶石斑魚gFZD3在成魚外周組織(肝臟、性腺、心臟、腎臟、脾臟、胃、腸、鰓和肌肉)和腦中(嗅球、端腦、中腦、小腦、延腦、下丘腦、垂體)的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，gFZD3廣泛表達(dá)于各腦區(qū)。在外周組織中，gFZD3只在卵巢和精巢中檢測到基因的表達(dá)信號，并且卵巢中的表達(dá)量最高(見圖4)。斜帶石斑魚gFZD3在不同組織中的表達(dá)顯示出明顯的組織表達(dá)特異性。

2.4 斜帶石斑魚gFZD3基因在胚胎發(fā)育中的表達(dá)模式分析

實時熒光定量RT-PCR分析結(jié)果顯示，在斜帶石斑魚未受精卵中，gFZD3 mRNA表達(dá)量較高，且在受精后的表達(dá)量達(dá)到最高。但在隨后的2-細(xì)胞期和4-細(xì)胞期中，表達(dá)量顯著下降。在4-細(xì)胞時期之后，gFZD3的表達(dá)量相對較低且沒有顯著差異，其中在將孵期的表達(dá)量最低?？v觀整個胚胎發(fā)育過程，gFZD3的表達(dá)隨著胚胎發(fā)育的過程，形成一個由高到低的表達(dá)趨勢(見圖5)。

(起始和終止密碼子用雙下劃線表示，信號肽用陰影表示，N-糖基化位點用星號★表示，半胱氨酸豐富區(qū)的13個半胱氨酸用外加圓圈表示，7個跨膜螺旋區(qū)用方框表示，在胞內(nèi)環(huán)用下劃線表示，二硫鍵的2個半胱氨酸用三角形△標(biāo)注，參與經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路的特有結(jié)構(gòu)域用斜粗體表示。Start and stop codons are double underlined; putative signal peptide is shaded, potential N-glycosylation site is indicated by asterisk; thirteen conserved cysteine residues in the CRD domain are marked by circle; seven transmembrane domains are in boxes; the potential particular domain of Frizzled involved in canonical Wnt/β-catenin pathway is in bold italic.)

圖1 斜帶石斑魚gFZD3基因cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

Fig.1 Compiled full-lengthgFZD3 cDNA sequence and putative amino acid

(SP:信號肽；CRD：半胱氨酸豐富區(qū)；TM1～TM7：跨膜螺旋1～7。Protein domains of gFZD3.SP: Signal peptide; CRD: Cysteine-rich domain; TM1-TM7: Transmembrane spanning segments.)

圖2 斜帶石斑魚gFZD3的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析

Fig.2 Analysis of gFZD3 protein domains

(本進化樹采用MEGA 4.0軟件(鄰位相連算法)構(gòu)建，系統(tǒng)樹中結(jié)點處數(shù)值代表10 000次評估的自舉檢驗置信度, ▲代表斜帶石斑魚。 The phylogenetic tree was constructed by MEGA 4.0 software (the neighbor-joining method) with 10 000 bootstrap replicates. The orange-spotted grouper was marked by “▲” . 人類(Homosapiens)：(HoFZD3: NP_059108.1)；牛(Bosmutus):(BoFZD3: XP_005900134.1)：大鼠(Rattusnorvegicus):(RaFZD3: NP_703204.1)：爪蟾(Xenopuslaevis):(XeFZD3：AAI69915.1)；青鱂(Oryziaslatipes):(OrFZD3:XP_004083717.1)；虹鱒(Oncorhynchusmykiss):(OnFZD3:CDQ59954.1)；斑馬魚(Daniorerio):(DaFZD3:NP_001036226.1；ZeFZD1: NM_001130614.1; ZeFZD2:BC056524.1; ZeFZD6: NM_200561.2; ZeFZD7:BC068322.1; ZeFZD8:AF060697.1; ZeFZD9:BC163365.1)；半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis):(CyFZD3:XP_008335388.1);大黃魚(Larimichthyscrocea):(LaFZD3:KKF28197.1);孔雀魚(Poeciliaformosa):(PoFZD3:XP_007567852.1);麗魚(Maylandiazebra):(MaFZD3:XP_004542349.1)。

圖3 脊椎動物FZD3的系統(tǒng)進化樹

Fig.3 Phylogenetic tree construction with FZD3 amino acid sequences

(從左到右依次為：Ob：嗅球；Te：端腦；Mb：中腦；Hb：小腦；Mo：延腦；Hy：下丘；P：垂體；L：肝臟；O：卵巢；K：腎臟；H：心臟；S：胃；I：腸；Sp：脾臟；Gi：鰓；M：肌肉；T: 精巢；NC：陰性對照。18s rRNA基因作為內(nèi)部參照。n=3。From left to right, Ob: olfactory bulb ; Te: telencephalon; Mb:midbrain; Hb:hindbrain; Mo: medulla oblongata; Hy: hypothalamus; P:pituitary; L:liver; O:ovary; K:kidney; H:heart; S:stomach; I: intestine; Sp:spleen; Gi:gill; M:muscle; T:testis；NC:negative control. 18s rRNA was used as the internal control.n=3.)

圖4 RT-PCR分析斜帶石斑魚gFZD3基因的mRNA在不同組織中的表達(dá)模式

Fig.4 RT-PCR analysis ofgFZD3 expression in different tissues

(目的基因相對表達(dá)量用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n=3)，柱形圖上的字母的不同表示組間具有顯著性差異(P<0.05)?？v坐標(biāo)代表目的基因的表達(dá)量與對應(yīng)18s的比值，橫坐標(biāo)表示不同的胚胎發(fā)育時期，數(shù)字1～20分別對應(yīng)了20個不同的時期：1：未受精卵；2：受精卵；3：2細(xì)胞期；4：4細(xì)胞期；5：8細(xì)胞期；6：16細(xì)胞期；7：32細(xì)胞期；8：多細(xì)胞期；9：桑葚期；10：囊胚期；11：原腸期；12：胚體形成期；13：視囊形成期；14：肌節(jié)形成期；15：聽囊形成期；16：腦泡形成期；17：心臟形成期；18：尾芽形成期；19：心臟跳動和晶體形成期；20：將孵期。Data is represented as means ± S.E.M. (n=3 pools of animals). For a given gene, groups with different letters are significantly (P<0.05) different.1: Unfertilized eggs; 2:Fertilized eggs; 3:2-cell stage; 4:4-cell stage; 5:8-cell stage; 6:16-cell stage; 7:32-cell stage; 8:Multi-cell stage; 9:Morula stage; 10:Blastula stage; 11: Gastrulation stage; 12: Embryo body stage; 13: Optic capsule appearance; 14: Muslce burl appearance; 15: Otocyst appearance; 16: Brain vesicle appearance; 17: Heart formation stage; 18: Tail-bud appearance; 19: Heart-beating and Crystal formation stage; 20: Pre-hatching stage.)

圖5 斜帶石斑魚gFZD3基因在胚胎發(fā)育不同時期的表達(dá)水平變化

Fig.5 Changes ofgFZD3 mRNA levels during embryonic development.gFZD3 mRNA levels were examined by quantitative real-time RT-PCR

2.5 斜帶石斑魚gFZD3基因在卵巢發(fā)育過程中的表達(dá)模式

根據(jù)石斑魚雌雄同體先雌后雄的卵巢發(fā)育特征，結(jié)合本次樣本的卵巢切片分析，獲得的斜帶石斑魚II、III和IV期卵巢樣本：1.II期卵巢—初級卵母細(xì)胞(Primary-growth stage oocyte，O1)的卵巢時期；2.III期—皮層小泡形成時期(Cortical-alveolus stage oocyte，O2)的卵巢時期；3.IV期—卵黃形成(Vitellogenic stage oocyte，O3)的卵巢時期(見圖6)。實時熒光定量PCR檢測斜帶石斑魚gFZD3基因在卵巢發(fā)育過程的表達(dá)，結(jié)果顯示斜帶石斑魚gFZD3 mRNA在卵巢發(fā)育早期表達(dá)量較低，然后隨著卵巢的發(fā)育，在III期達(dá)到最高，在卵黃形成時期中的表達(dá)量有所下降，但仍維持在較高的表達(dá)水平(見圖7)。

(A.II期—初級卵母細(xì)胞時期(Primary-growth stage oocyte，O1)的卵巢時期；B.III期—皮層小泡形成(Cortical-alveolus stage oocyte，O2)的卵巢時期；C.IV期—卵黃形成(Vitellogenic stage oocyte，O3)的卵巢時期。標(biāo)稱為200μm。A. The II ovarian stage with the primary-growth stage oocyte O1;B. The III ovarian stage with the cortical-alveolus stage oocyte O2;C.The IV ovarian stage with the vitellogenic stage oocyte O3. Scale bar=200μm.)

圖6 斜帶石斑魚卵巢的發(fā)育組織切片圖

Fig.6 Photomicrograph of ovarian development in orange-spotted grouper

(上標(biāo)不同的字母表示組間的顯著性差異(P<0.05,n=5)。Data is represented as means±S.E.M. For a given gene, groups with different letters are significant different (P<0.05,n=5).)

圖7 斜帶石斑魚gFZD3基因在卵巢發(fā)育過程中的表達(dá)情況

Fig.7 Changes ofgFZD3 mRNA levels during ovarian development

3 討論

斜帶石斑魚gFZD3的氨基酸序列比對分析表明，F(xiàn)ZD3基因在脊椎動物中具有較高的保守性。斜帶石斑魚gFZD3與其他物種的FZD一樣，均屬于G蛋白偶聯(lián)型受體蛋白家族，并具有該家族成員保守的分子結(jié)構(gòu)和功能區(qū)[4,21]。斜帶石斑魚gFZD3的氨基酸序列均含有K-T-X-X-W結(jié)構(gòu)域，該胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域是Frizzled蛋白參與Wnt/β-Catenin經(jīng)典信號通路必需的特異結(jié)構(gòu)域[21-22]，因此，斜帶石斑魚gFZD3基因可能參與Wnt/β-Catenin經(jīng)典信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。另外，斜帶石斑魚gFZD3在膜內(nèi)側(cè)的肽鏈C-末端沒有S/T-X-V域，而在其他FZD亞型中含有此結(jié)構(gòu)域[23]。S/T-X-V域能夠與帶有PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白發(fā)生相互作用，介導(dǎo)Wnt非經(jīng)典信號通路，比如蓬亂蛋白(Dishevelleds，Dsh)[24-25]。斜帶石斑魚gFZD3缺失該功能結(jié)構(gòu)域，表明斜帶石斑魚gFZD3可能不參與Wnt非經(jīng)典信號通路的傳導(dǎo),其信號通路的介導(dǎo)主要通過Wnt經(jīng)典的信號通路來發(fā)揮調(diào)控作用。

斜帶石斑魚gFZD3的在不同組織中的表達(dá)結(jié)果與先前的研究報道相似[15-16]。gFZD3在神經(jīng)系統(tǒng)中的廣泛表達(dá)，表明gFZD3在神經(jīng)系統(tǒng)中具有保守的調(diào)控生理功能。有趣的是，除了中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織外，gFZD3均在卵巢和精巢中均有表達(dá)。從中表明gFZD3除在神經(jīng)系統(tǒng)中具有生理功能外，在性腺發(fā)育中同樣具有潛在作用。在虹鱒和黑鯛的研究中已表明,Wnt信號通路在魚類性腺發(fā)育及性別調(diào)控中具有十分重要的生理調(diào)節(jié)功能，但這些結(jié)果均基于Wnt信號通路的配體分子的研究來推斷，對受體FZD的介導(dǎo)功能研究尚未清楚。已有研究報道，gFZD3在性腺中的表達(dá)具有明顯的性別差異，在卵巢中的表達(dá)比在精巢中更顯著。在牙鲆(Paralichthysolivaceus)、劍尾魚(XiphophorusMaculatus)和褐菖鲉(Sebastiscusmarmoratus)等魚類的性腺轉(zhuǎn)錄組分析中發(fā)現(xiàn)FZD3在卵巢中的表達(dá)顯著高于精巢[26-28]。這預(yù)示了FZD3介導(dǎo)的Wnt信號通路在雌性性腺發(fā)育中的作用可能更加顯著。

斜帶石斑魚gFZD3隨胚胎發(fā)育呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，表明斜帶石斑魚gFZD3主要作用于胚胎發(fā)育的早期。細(xì)胞極化對胚胎細(xì)胞的分化及形態(tài)建成具有十分重要的作用[7]。已有研究表明，F(xiàn)ZD3在早期胚胎及表皮細(xì)胞的極化中具有重要的調(diào)控作用[23]。在斜帶石斑魚中，gFZD3在胚胎發(fā)育早期的高表達(dá)，也可能與細(xì)胞的極化相關(guān)。另外，斜帶石斑魚gFZD3在未受精卵中的具有較高的表達(dá)量，這可能來自母源供給，作用于受精之后的胚胎，保障胚胎的正常發(fā)育。在斜帶石斑魚卵巢發(fā)育過程中，斜帶石斑魚gFZD3基因主要在III和IV期卵巢中高表達(dá)，提示了斜帶石斑魚gFZD3可能主要作用于卵巢發(fā)育的后期。另外，結(jié)合斜帶石斑魚gFZD3基因在胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)情況。在未受精卵中，gFZD3表達(dá)量較高，因此，gFZD3在卵巢后期的高表達(dá)，可能也是為早期的胚胎發(fā)育提供母源性的gFZD3積累。

4 結(jié)語

本研究首次從斜帶石斑魚中克隆鑒定了卷軸受體gFZD3的cDNA序列全長，并開展了斜帶石斑魚gFZD3的序列分析。結(jié)果表明,斜帶石斑魚gFZD3與其他物種的FZD類似，都屬于G蛋白偶聯(lián)型受體蛋白家族，并具有保守的分子結(jié)構(gòu)和功能區(qū)。由于斜帶石斑魚gFZD3在膜內(nèi)側(cè)的肽鏈C-末端缺少S/T-X-V域，因此推測斜帶石斑魚gFZD3可能不介導(dǎo)Wnt/β-Catenin非經(jīng)典信號通路。斜帶石斑魚gFZD3組織分布的結(jié)果表明了gFZD3具有明顯的組織表達(dá)特異性，并預(yù)示了斜帶石斑魚gFZD3除在神經(jīng)系統(tǒng)中具有傳統(tǒng)生理功能外，可能在性腺發(fā)育中同樣具有重要的生理功能，特別是在卵巢的發(fā)育。另外，檢測了斜帶石斑魚gFZD3在胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)模式，結(jié)果表明斜帶石斑gFZD3可能主要作用于胚胎發(fā)育的早期，其中g(shù)FZD3 mRNA可能主要是母源性的積累。根據(jù)斜帶石斑魚gFZD3基因在卵巢發(fā)育過程的表達(dá)模式，該基因主要作用于卵巢發(fā)育的后期。但gFZD3在卵巢發(fā)育后期的高表達(dá)，是卵子本身需要還是后續(xù)早期胚胎發(fā)育的需要，目前尚未清楚。本文開展了斜帶石斑魚gFZD3基因的cDNA序列克隆鑒定及相關(guān)表達(dá)模式的研究,將對Wnt信號通路在性腺發(fā)育中的功能闡明進一步補充和完善。

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責(zé)任編輯 朱寶象

Isolation and Expression Analysis of Frizzled 3 Gene of Orange-Spotted Grouper (Epinepheluscoioides)

CHEN Hua-Pu1, LI Zhen1, DENG Si-Ping1, ZHU Chun-Hua1, LI Guang-Li1, ZHONG Hong-Gan2

(1.Fishery Collegel, Municipal Key Laboratory of Marine Ecology and Environment of Zhanjiang, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China; 2.Sanya Marine Environment and Fisher Monitoring Center, Sanya 572000, China)

In this study, the cDNA of orange-spotted grouper(Epinepheluscoioides) frizzled 3 (FZD3) gene was isolated with its expression analyzed. The full length cDNA sequence of grouperFZD3(gFZD3)gene was isolated by using rapid-amplification of cDNA ends (RACE) method. The amino acid alignment and phylogenetic tree construction were performed by using ClustalX (1.81) and MEGA4.0, respectively. Tissue distribution ofgFZD3 transcript was examined thorough RT-PCR. The abundance ofgFZD3 transcript during embryonic and ovarian developments was detected by qRT-PCR. The isolatedgFZD3 cDNA was 2 255 bp in length and contained a 2 079 bp ORF encoding a deduced protein of 692 amino acids. Amino acid sequence analysis revealed that gFZD3 presented all typical structural characteristics of FZD family. Phylogenetic analysis showed that gFZD3 clustered with the evident subclade of FZD3, and showed a close relationship to that ofLarimichthyscrocea. In orange-spotted grouper,gFZD3 was found to express only in brain and two gonads, ovary and testis, with the highest abundance of its transcript detected in ovary. During embryonic development,FZD3 is highly expressed in unfertilized and fertilized eggs, but such expression gradually decreased at subsequent embryonic development stages. Furthermore, the abundance of its transcriptwas low at early ovarian stage, and high at subsequent III (cortical-alveolus) and IV (vitellogenic) ovarian stages. In conclusion,gFZD3 was isolated from orange-spotted grouper and FZD3 was highly conservative among different species in structure. The specific expression ofgFDZ3 in brain and gonads suggested an evident tissues-specific distribution pattern of gFZD3. The expression ofgFZD3 during the embryonic and ovarian developments indicated that gFDZ3 may play important roles at early stages of embryonic development and late stages of ovarian developments of orange-spotted grouper. The present study supplied the preliminary information for the further evaluation of Wnt pathway in fish reproduction.

Epinepheluscoioides; Frizzled 3; embryonic development; ovarian development; RT-PCR

廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項(A201408A06)；海南省科技合作專項(KJHZ2015-08)資助 Supported by Guangdong Province Marine Fishery Science and Technology Promotion Project (A201408A06); Hainan International Science and Technology Cooperation Project (KJHZ2015-08)

2015-11-06；

2016-05-20

陳華譜(1983-)，男，講師，研究方向：魚類生理與繁殖。

?? 通訊作者：E-mail：guangli211@163.com

S917.4

A

1672-5174(2017)01-068-08

10.16441/j.cnki.hdxb.20150384

陳華譜， 李臻， 鄧思平， 等. 斜帶石斑魚卷軸受體3基因的分離及表達(dá)分析研究[J]. 中國海洋大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2017, 47(1): 68-75.

CHEN Hua-Pu, LI Zhen, DENG Si-Ping, et al. Isolation and expression analysis of frizzled 3 gene of orange-spotted grouper (Epinepheluscoioides)[J]. Periodical of Ocean University of China, 2017, 47(1): 68-75.