馬 麗，趙東磊，鄭曉冰，賀 瑩

（河北工業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院，天津 300130）

磁性Fe3O4/SiO2復(fù)合粒子固定化漆酶及催化去除酚類(lèi)污染物

馬 麗，趙東磊，鄭曉冰，賀 瑩

（河北工業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院，天津 300130）

利用溶膠凝膠法制備磁性 Fe3O4/SiO2復(fù)合粒子，并用 -氨丙基三乙基硅烷（3-APTES）對(duì)復(fù)合粒子進(jìn)行修飾，作為固定化漆酶的載體，研究了固定化漆酶適宜的催化條件．結(jié)果發(fā)現(xiàn)，固定化漆酶的最佳反應(yīng)溫度為30℃，pH為4.5，固定化酶的酶活為180 U/g，酶活回收率為68.45%．考察了固定化漆酶的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性，與游離酶相比，固定化漆酶更加穩(wěn)定，便于連續(xù)操作．將固定化漆酶用于去除廢水中的2,4-二氯酚，反應(yīng)12 h，去除率最高為68.35%，該固定化酶重復(fù)重復(fù)使用12次后，對(duì)2,4-二氯酚的去除率可保持在52.85%．

磁性復(fù)合粒子；漆酶；固定化；2,4-二氯酚

漆酶（EC 1.10.3.2）是一種結(jié)合多個(gè)銅離子的多酚氧化酶[1]，廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中，由于其在催化反應(yīng)過(guò)程中能夠?qū)⒎肿友踹€原成兩分子水，并同時(shí)催化各種酚類(lèi)燃料、取代酚、氯酚、硫酚芳香胺等，因而日益受到人們的關(guān)注[2]．已經(jīng)廣泛用于紡織工業(yè)、紙漿和造紙工業(yè)、印染污水處理、食品飲料行業(yè)、生物燃料以及構(gòu)建生物傳感器等[3-5]．但游離態(tài)的漆酶活性和穩(wěn)定性差，不能耐受高溫、強(qiáng)酸堿等反應(yīng)環(huán)境，而且難于回收重復(fù)利用，阻礙了其在工業(yè)上的大規(guī)模應(yīng)用[6-7]．固定化酶技術(shù)的使用可以克服游離態(tài)漆酶的上述缺點(diǎn)，擴(kuò)大漆酶的使用范圍．固定化漆酶的方法有很多，如包埋法、吸附法、共價(jià)結(jié)合和交聯(lián)等，研究表明，通過(guò)固定化后的漆酶可以保持較好的活性和穩(wěn)定性[8]．目前，采用固定化漆酶的載體有：殼聚糖、硅膠、多孔玻璃、介孔二氧化硅、納米材料等[9]，考慮到漆酶在工業(yè)使用時(shí)既要保持較高且穩(wěn)定的酶活性又要便于分離、回收，所以研究以磁性復(fù)合粒子作為載體固定化漆酶．

磁性粒子是近年來(lái)功能材料的研究熱點(diǎn)，在生物醫(yī)藥、傳感器、生物分離以及固定化酶載體等領(lǐng)域有很大的應(yīng)用潛力[10]，但磁性粒子易被氧化、聚集效應(yīng)強(qiáng)、穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)，限制了其在生物領(lǐng)域的應(yīng)用，為了提高酶的負(fù)載量和穩(wěn)定性，需要對(duì)磁性粒子進(jìn)行修飾或在表面包裹保護(hù)層，SiO2具有良好的生物相容性和化學(xué)穩(wěn)定性，是包覆磁性納米粒子的理想材料之一[11]．本文主要研究利用溶膠凝膠法與磁性納米粒子結(jié)合制備磁性Fe3O4/SiO2復(fù)合粒子，將其作為載體用于固定化漆酶，并研究了固定化漆酶對(duì)2,4-二氯酚的去除效果．

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶膠凝膠法制備磁性Fe3O4/SiO2復(fù)合粒子及其修飾與活化

利用共沉淀法制備Fe3O4粒子[12]，將FeCl3和FeCl2以摩爾比1.8：1與HCl混合，并加入到NH3·H2O （0.7mol/L）中，劇烈攪拌混合均勻，反應(yīng)30m in后，利用外加磁場(chǎng)進(jìn)行分離，充分洗滌后分散于蒸餾水中待用．用溶膠凝膠法制備Fe3O4/SiO2復(fù)合粒子：在三口燒瓶中加入38 m L乙醇，3 m L NH3·H2O（28%），38m LH2O以及10m L預(yù)分散的Fe3O4懸濁液．將35m L TMOS與乙醇的混合液（6%（V/V））滴加到連續(xù)攪拌的三口燒瓶中，反應(yīng)4 h后，利用外加磁場(chǎng)將產(chǎn)物分離，并用蒸餾水充分洗滌3次，真空冷凍干燥24 h，得到Fe3O4/SiO2復(fù)合粒子．

稱(chēng)取0.5g Fe3O4/SiO2復(fù)合粒子與25m L甲苯混合，20m in超聲振蕩后，轉(zhuǎn)移到三口燒瓶中，再加入5m L 的3-APTES和25m L甲苯混合均勻，在磁力攪拌下，加熱至120℃回流4 h，分離出產(chǎn)物，分別用丙酮和甲苯洗滌產(chǎn)物并離心三次，真空冷凍干燥12 h后得到氨基修飾的Fe3O4/SiO2復(fù)合粒子．

量取pH 7.0（0.2mol/L）的磷酸鹽緩沖溶液和戊二醛（8%（W/V））各10m L，加入125mg氨基修飾的Fe3O4/SiO2復(fù)合粒子，置于恒溫水浴搖床中，反應(yīng)溫度25℃，轉(zhuǎn)速150 r/m in，反應(yīng)時(shí)間8 h．產(chǎn)物用大量蒸餾水水洗滌，真空冷凍干燥，得到活化的磁性載體．

1.2.2 漆酶的固定化

分別稱(chēng)取20mg氨基修飾并活化的Fe3O4/SiO2復(fù)合粒子，加入9m L，pH 6.0磷酸鹽緩沖溶液，再加入一定濃度的漆酶溶液，在恒溫水浴搖床中，反應(yīng)溫度25℃，轉(zhuǎn)速150 r/m in，反應(yīng)時(shí)間6h．外加磁場(chǎng)分離固定化酶，并用pH 6.0磷酸鹽緩沖溶液洗滌，4℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

1.2.3 漆酶酶活的測(cè)定

將2m L游離漆酶或固定化酶與6m L鄰苯二酚混合（6mg/m L），放入恒溫水浴搖床，在30℃，150 r/min的條件下反應(yīng)30m in，在400 nm波長(zhǎng)下測(cè)定反應(yīng)液的吸光度，計(jì)算酶活[13]．

固定化酶酶活回收率=固定化酶酶活/游離酶酶活×100%．

考察溫度和pH對(duì)固定化漆酶酶活的影響時(shí)，分別改變溫度和pH，其他實(shí)驗(yàn)按上述條件進(jìn)行．

1.2.4 2,4-二氯酚的去除

根據(jù)水及污水檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[14]，將游離漆酶、固定化漆酶及等量的載體分別與3m L 2,4-二氯酚（0.4mg/m L）混合均勻，在30℃，150 r/m in的水浴搖床中反應(yīng)30m in．取出0.1m L反應(yīng)液，稀釋至20m L，加入一定量的氨水，利用磷酸鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)pH至7.9，再依次加入0.025 m L的六氰合鐵三鉀（80 g/L），0.025 m L的4-氨基安替比林（2%），反應(yīng)15m in，測(cè)定其在509nm波長(zhǎng)下的OD值，計(jì)算去除率．在重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，固定化漆酶重復(fù)使用12次，每次反應(yīng)后測(cè)定其去除率，同時(shí)將固定化漆酶及載體用緩沖液充分洗滌，進(jìn)行下一批次實(shí)驗(yàn)．

1.2.5 表征

用掃描電子顯微鏡（SEM，JSM-6700F，JEOL，日本）表征Fe3O4/SiO2復(fù)合粒子的形貌特征；傅立葉變換紅外光譜儀（22型，Bruker，德國(guó)）測(cè)定Fe3O4/SiO2復(fù)合粒子及氨基修飾后的Fe3O4/SiO2復(fù)合粒子的紅外光譜；廣角X射線衍射（XRD）獲得Fe3O4粒子、Fe3O4/SiO2復(fù)合粒子、氨基修飾的Fe3O4/SiO2復(fù)合粒子晶型特征峰；用磁滯回線測(cè)定儀（7407，Lakeshore，美國(guó)）及示波器等測(cè)定并導(dǎo)出磁性粒子Fe3O4/SiO2復(fù)合粒子的磁滯回線．

2 結(jié)果與討論

2.1 磁性Fe3O4/SiO2復(fù)合粒子表征

2.1.1 磁性Fe3O4/SiO2復(fù)合粒子的形貌

圖1為磁性Fe3O4/SiO2復(fù)合粒子的SEM圖，由圖1可以看出，磁性Fe3O4/SiO2復(fù)合粒子呈現(xiàn)球形分布，大部分復(fù)合粒子的直徑在200～600 nm之間，部分粒子有團(tuán)聚的現(xiàn)象．

圖1 磁性Fe3O4/SiO2復(fù)合粒子的SEMFig.1 SEMimageof Fe3O4/SiO2magnetic composite

2.1.2 載體粒子的紅外光譜分析

紅外光譜分別檢測(cè)磁性Fe3O4/SiO2復(fù)合粒子和功能化的磁性Fe3O4/SiO2復(fù)合粒子，圖2中在574 cm1處有Fe-O鍵的吸收峰，F(xiàn)e-O-Si的特征吸收峰應(yīng)該在584 cm1處，但在紅外譜圖上并沒(méi)有明顯的吸收峰，是因?yàn)檫@個(gè)吸收峰與574 cm1處Fe-O鍵產(chǎn)生吸收峰重疊，在1 061 cm1處強(qiáng)的吸收峰是Si-OSi鍵對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)吸收峰，在457 cm1和800 cm1處是Si-OSi鍵的彎曲振動(dòng)吸收峰和搖擺振動(dòng)吸收峰[15]，966 cm1和1634 cm1分別代表了彎曲振動(dòng)的Si-OH鍵和-OH鍵，這些都說(shuō)明SiO2已經(jīng)包裹在Fe3O4粒子的表面．圖2a中3000 cm1左右出現(xiàn)的較大吸收峰，可歸屬于氨基硅烷的N-H鍵的伸縮振動(dòng)特征吸收峰，在1 547 cm1處的吸收峰是N-H鍵的變形振動(dòng)吸收峰．通過(guò)紅外譜圖分析，說(shuō)明氨基硅烷已經(jīng)被成功修飾到磁性Fe3O4/SiO2復(fù)合粒子上．

圖2 磁性Fe3O4/SiO2復(fù)合粒子紅外譜圖Fig.2 FT-IR spectraof Fe3O4/SiO2magnetic composite

2.1.3 磁性Fe3O4/SiO2復(fù)合粒子的XRD分析

圖3為廣角X射線衍射圖，曲線a、b、c分別對(duì)應(yīng)Fe3O4磁性粒子、磁性Fe3O4/SiO2復(fù)合粒子和氨基修飾的磁性Fe3O4/ SiO2復(fù)合粒子．圖3的b和c與a相比，明顯看出2 =22°處出現(xiàn)了一個(gè)較寬的峰，這是無(wú)定型二氧化硅的衍射峰，說(shuō)明二氧化硅層已經(jīng)成功包覆在磁性粒子表面．圖3中a、b、c 在2=30°，35°，43°，57°，62.5°處都有衍射峰，與Fe3O4的衍射卡一致[16]，對(duì)應(yīng)衍射峰位置不變，變化的只是特征峰強(qiáng)度和峰寬，表明二氧化硅的包覆及其氨基修飾不會(huì)改變磁性粒子的晶形．

圖3 XRD衍射圖譜Fig.3 XRD patterns

2.1.4 載體粒子的磁學(xué)性能分析

圖4為 Fe3O4復(fù)合粒子及磁性Fe3O4/SiO2復(fù)合粒子在室溫下的磁滯回線．由圖4可知，磁滯回線呈可逆“S”型，F(xiàn)e3O4粒子與磁性Fe3O4/SiO2復(fù)合粒子的矯頑力和剩余磁化強(qiáng)度接近0，說(shuō)明兩種載體粒子都具有超順磁特性．但磁性Fe3O4/SiO2復(fù)合粒子的飽和磁化強(qiáng)度比Fe3O4粒子低，這可能是因?yàn)榘判粤Ｗ拥腟iO2層本身不具有磁性，包裹之后復(fù)合粒子的飽和磁化強(qiáng)度降低．

2.2 磁性Fe3O4/SiO2復(fù)合粒子固定化漆酶的性質(zhì)

20mg磁性Fe3O4/SiO2復(fù)合粒子為載體，漆酶濃度4mg/m L，交聯(lián)劑戊二醛濃度為8%（V/W），固化溫度25℃，固化pH 6.0，固化時(shí)間8 h的條件下，固定化漆酶的酶活為180U/g，酶活回收率為68.45%．

圖5和6分別為反應(yīng)溫度和pH對(duì)游離酶和固定化酶的酶活影響．由圖5，圖6可以看出，反應(yīng)溫度為30℃時(shí)，pH為4.5時(shí)表現(xiàn)出較高的酶活，而且明顯看出與游離酶相比固定化漆酶的溫度、pH適用范圍更大，這是因?yàn)槔么判訤e3O4/SiO2復(fù)合粒子為載體固定化漆酶，漆酶分子與載體之間相互作用，與酶分子多位點(diǎn)連接，增大了酶分子的剛性，抑制了酶分子的伸展變形和非特異性聚集，天然構(gòu)象不易發(fā)生改變[17]，更好的抵抗反應(yīng)溫度和pH變化的影響，提高了固定化酶的穩(wěn)定性．

圖4 磁性粒子（a）和磁性Fe3O4/SiO2復(fù)合粒子（b）的磁滯回線Fig.4 Hysteresis loop ofmagnetic particles(a)and Fe3O4/SiO2magnetic composite particles(b)

圖5 溫度對(duì)游離漆酶和固定化漆酶酶活的影響Fig.5 Effectof temperatureon theactivity of freeand immobilized

圖6 pH值對(duì)游離漆酶和固定化漆酶酶活的影響Fig.6 EffectofpH on theactivity of freeand immobilized laccase

分別將固定化酶和游離酶放入磷酸鹽緩沖溶液中（pH 4.0），4℃下保存28 d，每隔一段時(shí)間考察其相對(duì)活性（圖7）．28 d后固定化酶相對(duì)活性為62.23%，而游離酶僅保留了初始活性的41.01%，表明固定化漆酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性要優(yōu)于游離酶．這是因?yàn)槠崦冈诠潭ɑ?，從一定程度上保護(hù)了其天然構(gòu)象，而且與載體之間的相互作用使酶分子不易從載體上脫落[18]，從而保持了較好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，有利于后期工業(yè)化的應(yīng)用．

圖7 固定化漆酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性Fig.7 Storagestability of immobilized laccase

2.3 固定化漆酶去除2,4-二氯酚

為了考察固定化漆酶作為生物催化劑的效果，選擇2,4-二氯酚為模型物系，考察固定化酶對(duì)2,4-二氯酚的去除效果，圖8為反應(yīng)時(shí)間對(duì)游離酶、載體和固定化漆酶去除2,4-二氯酚去除率的影響．由圖8可知，固定化漆酶的去除效果優(yōu)于游離酶，反應(yīng)達(dá)到8h去除率增漲不明顯，基本達(dá)到平衡，12h去除率最高達(dá)到68.35%，而游離酶在長(zhǎng)時(shí)間的反應(yīng)過(guò)程中可能有因?yàn)闃?gòu)象變化發(fā)生部分酶的失活現(xiàn)象．

圖9為固定化酶和載體吸附去除2,4-二氯酚的重復(fù)使用性，固定化漆酶重復(fù)使用12次后該固定化酶對(duì)2,4-二氯酚去除率降低15.50%，顯示了較好的重復(fù)使用性，而且固定化漆酶可以快速和反應(yīng)體系分離，能夠大大提高了操作效率．

圖8 反應(yīng)時(shí)間對(duì)2,4-二氯酚去除的影響Fig.8 Effectof reaction timeon 2,4-dichlorophenoldegradation

圖9 固定化酶去除2,4-二氯酚的重復(fù)使用Fig.9 Repeated useof immobilized enzymeon 2,4-dichlorophenol degradation

3 結(jié)論

共沉淀法制備Fe3O4粒子，通過(guò)溶膠凝膠法在其表面成功包覆SiO2后，用3-APTES對(duì)Fe3O4/SiO2復(fù)合粒子進(jìn)行氨基修飾，并用于漆酶的固定化．通過(guò)SEM、紅外光譜、XRD及磁力回線檢測(cè)儀對(duì)Fe3O4粒子、Fe3O4/ SiO2復(fù)合粒子、氨基修飾的Fe3O4/SiO2復(fù)合粒子進(jìn)行表征，制備的磁性復(fù)合粒子為球形，且具備超順磁性，并且在粒子表面成功修飾了氨基．研究表明，固定化漆酶與游離酶相比對(duì)溫度和pH的耐受范圍更廣，儲(chǔ)藏穩(wěn)定性好，便于連續(xù)操作，且對(duì)2,4-二氯酚具有良好的去除效果（12h去除率最高達(dá)到68.35%）重復(fù)使用12次后仍保持52.85%的去除率．磁性Fe3O4/SiO2復(fù)合粒子為載體固定化漆酶在工業(yè)催化領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用價(jià)值．

[1]Rivera-HoyosCM，Morales-álvarez ED，Poutou-PialesRA，etal．Fungal laccases[J]．FungalBiolRev，2013，27（3-4）：67-82．

[2]張敏，肖亞軍，龔為民．真菌漆酶的結(jié)構(gòu)和功能 [J]．生物學(xué)雜志，2003，20（5）：6-8．

[3]Lim K T，Hu C，KittsD D．Antioxidantactivity of rhusvernicifluastokesethanolextract[J]．Food Chem Toxico，2001，39（3）：229-237．

[4]Harald Claus．Laccases：structure，reactions，distribution[J]．Micron，2004，35（1-2）：93-96．

[5]Baldrain P．Fungal lacease-occurrenceand properties[J]．FemsMierobiolRev，2005，30（2）：215-242．

[6]Hu X，Zhao X，Hwang H．Comparativestudyof immobilized Trametesversicolor laccaseonnanoparticlesand kaolinite[J]．Chemosphere，2007，66（9）：1618-1626．

[7]Reku A，Jastrzembska B，Liesiene J，etal．Comparativestudieson immobilized laccasebehaviour in packed-bed and batch reactors[J]．JMol CatalB：Enzym，2009，57（1-4）：216-223．

[8]Sheldon RA．Enzyme immobilization：thequest foroptimum performance[J]．Adv Synth Catal，2007，349（8-9）：1289-1307．

[9]Rogalski J，Daw idow icz A，Jozw ik E．Immobilization of laccase from gerrenaunicoloron controlled porosity glass[J]．JMolCatalB：Enzym，1999，6（1-2）：29-39．

[10]柯詩(shī)劍，計(jì)劍．萬(wàn)古霉素修飾磁性納米粒子的制備及其細(xì)菌分離功能 [J]．高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)，2007，28（1）：26-28

[11]婁敏毅，王德平，黃文旵，等．單分散核殼結(jié)構(gòu)SiO2磁性微球的制備及性能 [J]．硅酸鹽學(xué)報(bào)，2006，34（3）：277-283．

[12]Hsieh H C，Kuan IC，Lee SL，etal．Stabilization of dam inoacid oxidase from Rhodosporidium toruloidesby immobilizationontomagnetic nanoparticles[J]．Biotechnol Lett，2009，31（4）：557-563．

[13]Karimpil JJ，Melo JS，D'Souza SF．Hen eggwhiteasa feederprotein for lipase immobilization[J]．JMolCatalB：Enzym，2011，7（3-4）：113-118．

[14]ISBN-10/ASIN：0875532357，Standardmethods for theexam ination ofwaterandwastewater[S]．

[15]Zhang Y，KohlerN，ZhangM Q．Surfacemodificationofsuperparamagneticmagnetitenanoparticlesand their intracellularuptake[J]．Biomaterials，2002，23（7）：1553-1561．

[16]Liu XQ，Ma ZY，Xing JM，etal．Preparation and characterization of am ino-silanemodified superparamagnetic silicananospheres[J]．JMagn Magn Mater，2004，270（1-2）：1-6．

[17]ParkaSI，Kimb JH，Limc JH，etal．Surfacemodifiedmagneticnanoparticleswith lecithin forapplicationsinbiomedicine[J]．CurrApplPhys，2008，8（6）：706-709．

[18]Wang F，Guo C，Yang LR，et al．Magnetic mesoporous silica nanoparticles：fabrication and their laccase immobilization performance[J]．Bioresour Technol，2010，101（23）：8931-8935．

[責(zé)任編輯 田 豐 夏紅梅]

Immobilizationof laccaseon Fe3O4/SiO2magnetic compositeparticlesand itsapplication in phenolic pollutantsdegradation

MA Li，ZHAO Donglei，ZHENG Xiaobing，HEYing

(Schoolof Chemical Engineering,HebeiUniversity and Technology,Tianjin 300130,China)

Magnetic silica compositeparticleswere prepared by using sol-gel reaction.The composite particleswere functionalizedwith 3-Am inopropyltriethoxysilane(APTES)and used to immobilize laccase.Theeffectsofcatalytic condition wereoptim ized.The resultsshowed thatcatalytic pHwas4.5,catalytic temperaturewas30℃,thehighestspecific activity of immobilized laccase reached to 182U/gand theactivity recoverywas68.45%.Comparedwith free laccase,the thermal, pH,storage stabilitiesof the immobilized laccasewere improved significantly.The catalytic activity of the immobilized laccase was also demonstrated by the degradation of 2,4-dichlorophenol.Itwas found that the removal rate of 2,4-dichlorophenolwas68.35%in about12 hours;and after12 consecutive cycles,the removal ratewas52.85%.

magnetic composite particles;laccase;immobilization;2,4-dichlorophenol

Q814.2

A

1007-2373(2016)01-0085-05

10.14081/j.cnki.hgdxb.2016.01.016

2015-08-23

河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目（13273607，13274314）

馬麗（1983-），女（漢族），實(shí)驗(yàn)師．

：趙東磊（1981-），男（滿族），講師．

數(shù)字出版日期：2016-02-27數(shù)字出版網(wǎng)址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/13.1208.T.20160227.1613.008.htm l