李嘉欣，錢多，解彩霞，蘇燕*

(1.包頭醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，內(nèi)蒙古包頭 014060；2.包頭市第四醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古包頭 014030)

維生素C對(duì)紅細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用研究

李嘉欣1，錢 多2，解彩霞1，蘇 燕1*

(1.包頭醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，內(nèi)蒙古包頭 014060；2.包頭市第四醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古包頭 014030)

為了利用血紅蛋白釋放試驗(yàn)(HRT)檢測生理濃度維生素C(VC)對(duì)生理濃度過氧化氫(H2O2)氧化損傷后紅細(xì)胞的保護(hù)作用，用終濃度為0、0.15、0.3、0.4、0.6、0.7、0.85 mmol/L的VC溶液處理紅細(xì)胞懸液并進(jìn)行HRT。再分別用0、1.25、2.50、3.75、5.00 mL/L的H2O2溶液處理0.4 mmol/L VC作用后紅細(xì)胞懸液(VC保護(hù)組)和VC未作用的紅細(xì)胞懸液(對(duì)照組)，測定紅細(xì)胞相對(duì)溶解度。結(jié)果表明，VC達(dá)到生理濃度時(shí)，血紅蛋白再釋放量逐漸減弱；VC保護(hù)組紅細(xì)胞相對(duì)溶解度與對(duì)照組差別不大。說明生理濃度的VC能減弱HRT的血紅蛋白再釋放，降低紅細(xì)胞破膜率，但不能顯著降低H2O2對(duì)細(xì)胞膜的氧化損傷。

維生素C；血紅蛋白釋放試驗(yàn)；過氧化氫;氧化損傷

維生素C(vitamin C, VC)是水溶性抗氧化物。已有研究表明，高濃度VC能夠有效維持紅細(xì)胞的功能和膜的完整性[1]，避免氧化劑對(duì)紅細(xì)胞的損傷。過氧化氫(H2O2)是體內(nèi)產(chǎn)生的一種活性氧，如果不被及時(shí)清除，可以引發(fā)紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致紅細(xì)胞膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和血紅蛋白(hemoglobin，Hb)的結(jié)構(gòu)改變，繼而引起紅細(xì)胞氧化溶血[2]。2007年，本研究組在進(jìn)行1例輕型β-地中海貧血患者的紅細(xì)胞電泳過程中偶然發(fā)現(xiàn)了Hb再釋放現(xiàn)象，依此創(chuàng)建了血紅蛋白釋放試驗(yàn)(hemoglobin releasing test，HRT)[3-5]，并證實(shí)再釋放的Hb是與膜結(jié)合的Hb[6]。本研究旨在通過HRT檢測生理濃度VC作用后Hb再釋放變化，探討生理濃度VC對(duì)紅細(xì)胞膜的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血液標(biāo)本 60份正常成人新鮮肝素抗凝靜脈血，取自包頭市第四醫(yī)院檢驗(yàn)科的年輕體檢者。4℃保存，24 h內(nèi)檢測。

1.1.2 主要儀器與試劑 高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；全波長多功能酶標(biāo)儀，美國Thermo公司產(chǎn)品；水平電泳槽(DYY-III型)、穩(wěn)壓穩(wěn)流電源(DYY-2C)，北京市六一儀器廠產(chǎn)品；17 cm×17 cm玻璃板等。EDTA、30%過氧化氫、硼酸、乙醇、四氯化碳、Tris、淀粉、氨基黑、冰醋酸等均為國產(chǎn)分析純；瓊脂糖，西班牙進(jìn)口分裝；維生素C注射液，0.25 g/mL，瑞陽制藥有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 紅細(xì)胞懸液和溶血液的制備 按照本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法制備紅細(xì)胞懸液和溶血液[7]，分別用終濃度為0、0.15、0.3、0.4、0.6、0.7、0.85 mmol/L的VC溶液處理紅細(xì)胞懸液并進(jìn)行HRT。再將紅細(xì)胞懸液分為2組，每組5份。VC保護(hù)組加入等體積VC至終濃度為0.4 mmol/L，作用2 h后，兩組分別加入0，1.25、2.50、3.75、5.00 mL/L的等體積H2O2作用2 h。

1.2.2 血紅蛋白釋放試驗(yàn) 按照本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法配制淀粉瓊脂糖混合凝膠[7]，分別吸取各樣品紅細(xì)胞懸液10 μL加在1 cm×0.2 mm 濾紙條上，再依次插入凝膠，第1次電泳120 V，65 min，斷電5 min，120 V再次電泳60 min。泳畢，將膠板浸入氨基黑10 B中染色過夜，次日用50 g/L冰醋酸溶液反復(fù)漂洗至背景無色，觀察結(jié)果并拍照留圖。

1.2.3 紅細(xì)胞相對(duì)溶解度 經(jīng)H2O2處理2 h后的樣品以3 000 r/min離心5 min，各取50 μL上清液，用生理鹽水稀釋6倍，測定540 nm處的吸光度，以溶血液50倍稀釋液的吸光度作為參照吸光值，計(jì)算各樣品的相對(duì)溶解度。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Graphpad Prism 5.0軟件處理，用Two-way Anova檢驗(yàn)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度VC作用后紅細(xì)胞懸液的血紅蛋白釋放比較

隨著VC濃度逐漸升高，到達(dá)生理濃度(0.3、0.4、0.5 mmol/L)后，紅細(xì)胞再釋放量逐漸減弱，當(dāng)VC濃度超過生理濃度，達(dá)到0.6 mmol/L時(shí)，再釋放量增多,VC濃度繼續(xù)升高時(shí)，再釋放量又呈現(xiàn)降低趨勢(圖1、圖2)。

1～7.0、0.15、0.3、0.4、0.6、0.7、0.85 mmol/L維生素C

1-7.0,0.15,0.3,0.4,0.6,0.7,0.85 mmol/L vitamin C

圖1 不同濃度VC作用后紅細(xì)胞懸液的Hb再釋放

Fig.1 Hb release of erythrocytes suspension treated by different concentrations of VC

圖2 凝膠電泳圖譜中釋放Hb的半定量分析

2.2 紅細(xì)胞相對(duì)溶解度

2.2.1 參照吸光值 溶血液的50倍稀釋液在540 nm處4次測得的吸光值平均值為0.626，以此為參照吸光值。相對(duì)溶解度=吸光值/參照吸光值×100%。

2.2.2 不同濃度過氧化氫處理后對(duì)紅細(xì)胞膜的作用 用等體積0、1.25、2.50、3.75、5.00 mL/L的H2O2處理VC保護(hù)組和對(duì)照組紅細(xì)胞懸液，結(jié)果顯示，無H2O2處理時(shí)，VC保護(hù)組破膜程度低于對(duì)照組(P<0.05)，差異顯著。隨H2O2濃度增大，對(duì)照組破膜率雖有增強(qiáng)，但變化不明顯；VC保護(hù)組破膜率較無H2O2處理時(shí)增強(qiáng)(P<0.05)，差異顯著，但變化并不隨H2O2濃度的增大而改變，也沒有明顯低于對(duì)照組，兩組破膜率均在8.5%左右(圖3)。

圖3 不同濃度H2O2處理紅細(xì)胞對(duì)細(xì)胞膜的相對(duì)溶解度

3 討論

紅細(xì)胞血紅蛋白釋放試驗(yàn)(HRT)是將未裂解的完整紅細(xì)胞懸液借助濾紙片加在淀粉-瓊脂糖混合凝膠中進(jìn)行電泳，電泳過程中進(jìn)行“通電-斷電-再通電”，就會(huì)出現(xiàn)Hb的再釋放區(qū)帶。在前期試驗(yàn)中，研究了高濃度VC對(duì)氧化損傷紅細(xì)胞的保護(hù)作用，結(jié)果顯示，高濃度VC對(duì)紅細(xì)胞膜氧化損傷具有保護(hù)作用，并能減弱Hb再釋放，降低氧化損傷后紅細(xì)胞的破膜率，發(fā)揮了VC對(duì)紅細(xì)胞膜的保護(hù)作用[8]。本研究進(jìn)一步將HRT應(yīng)用于觀察生理濃度VC對(duì)紅細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。HRT結(jié)果表明，當(dāng)無H2O2存在時(shí)，VC濃度到達(dá)生理濃度時(shí)，能夠降低Hb再釋放量；生理濃度VC作用后的紅細(xì)胞懸液的相對(duì)溶解度也低于對(duì)照組，說明缺乏VC會(huì)降低紅細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，增大破膜率。當(dāng)VC濃度超過生理濃度繼續(xù)升高時(shí)，Hb再釋放量呈現(xiàn)不穩(wěn)定增高或降低，原因尚不明確，有待于進(jìn)一步增加樣本量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

機(jī)體氧化代謝產(chǎn)生的活性氧包括超氧陰離子(O2-)、H2O2、羥自由基(OH·)、單線態(tài)氧(1O2)等[9]。適量的活性氧是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的通路，而過量的活性氧則可導(dǎo)致DNA突變，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的改變，細(xì)胞膜脂質(zhì)的過氧化損害，以致造成機(jī)體免疫損傷[10-11]。紅細(xì)胞內(nèi)有多種抗氧化成分，包括NADH、NADPH、谷胱甘肽等，它們與VC一起對(duì)抗細(xì)胞的各種活性氧，保護(hù)細(xì)胞膜蛋白、Hb和酶蛋白的巰基等不被氧化，從而維持紅細(xì)胞的正常功能。本研究表明，向紅細(xì)胞懸液中加入生理濃度范圍內(nèi)的H2O2作用時(shí)，VC保護(hù)組破膜率與對(duì)照組相比并沒有明顯差別，且與H2O2濃度沒有相關(guān)性，說明在生理濃度條件下，單純的添加VC不能明顯改變氧化劑對(duì)紅細(xì)胞膜的氧化損傷作用。在紅細(xì)胞的抗氧化體系中，VC是否與其他抗氧化成分相互作用，提高紅細(xì)胞自身的抗氧化能力，值得進(jìn)一步研究。

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Protective Effect of Vitamin C on Oxidative Damage of Erythrocytes

LI Jia-xin1, QIAN Duo2, XIE Cai-xia1, SU Yan1

(1.DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,BaotouMedicalCollege,Baotou，InnerMongolia，014060,China; 2.ClinicalLaboratoryofTheFourthHospitalofBaotou,Baotou，InnerMongolia，014030,China)

In order to use hemoglobin releasing test (HRT) to detect the protective effect of physiological concentration of vitamin C on erythrocytes treated by physiological concentration of hydrogen peroxide (H2O2), The final concentrations of 0, 0.15, 0.3, 0.4, 0.6, 0.7, 0.85 mmol/L vitamin C solution, were used to treat erythrocyte suspensions and HRT was conducted.Then 0, 1.25,2.50,3.75,5.00 mL/L H2O2solutions were used to treat 0.4mmol/L vitamin C treated erythrocyte suspension (vitamin C protection groups) and vitamin C untreated erythrocyte suspension (control groups) respectively,and the relative solubility of erythrocytes was measured.The results showed that the release of hemoglobin decreased gradually when the concentration of vitamin C reached to the physiological level.The relative solubility of erythrocytes in vitamin C protection groups had no significant difference from that of the control groups.It showed that the physiological concentration of vitamin C can decrease the release of hemoglobin by HRT,and decrease the rate of erythrocyte membrane breaking rate,but it can not significantly reduce the oxidative damage of H2O2on the cell membrane.

vitamin C;hemoglobin releasing test;hydrogen peroxide;oxidative damage

2015-10-13

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81160214)；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2010BS1101)；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目(NJZY14265)；秦文斌科技教育基金項(xiàng)目(201309)；內(nèi)蒙古衛(wèi)生廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(2010056)

李嘉欣(1982-)，女，遼寧鞍山人，講師，碩士，主要從事血液保護(hù)研究。*通訊作者

S852.21

A

1007-5038(2016)05-0060-03