王建武，相微微

（榆林學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，陜西榆林719000）

過(guò)表達(dá)截形苜蓿液泡膜H+-PPase基因促進(jìn)擬南芥的生長(zhǎng)和根圍酸化

王建武，相微微

（榆林學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，陜西榆林719000）

在前期研究工作中，中國(guó)科學(xué)研究院西北高原生物研究所分子實(shí)驗(yàn)室已從豆科模式植物截形苜蓿（Medicago truncatula）中克隆到一種液泡膜焦磷酸酶（V-H+-PPase）基因MtVP1，并進(jìn)行了序列分析。在前期工作的基礎(chǔ)上，構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI121-MtVP1，把MtVP1基因轉(zhuǎn)入到擬南芥中，觀察轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型變化。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)MtVP1能使轉(zhuǎn)基因株系的根系更發(fā)達(dá)，主根數(shù)增多1～2條，地上部生物量增大，并且促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因株系的根圍酸化能力；但幼苗耐鹽性試驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)基因株系與對(duì)照沒(méi)有明顯差異。

液泡膜H+-PPase；根發(fā)育；根圍酸化；耐鹽性

液泡膜焦磷酸酶（H+-PPase）作為一種質(zhì)子泵，能水解PPi產(chǎn)生兩分子的Pi，并利用水解產(chǎn)生的能量酸化液泡。目前普遍認(rèn)為，液泡膜H+-PPase主要在幼嫩和生長(zhǎng)旺盛的組織中發(fā)揮功能，這些組織中由于ATP積累量減少，使得液泡膜H+-ATPase的活性降低[1-2]。對(duì)擬南芥液泡膜H+-PPase基因AVP1研究表明，AVP1主要定位到液泡膜上[3-4]，此外還能定位到質(zhì)膜上[5-6]。過(guò)表達(dá)AVP1能導(dǎo)致擬南芥質(zhì)膜H+-ATPase豐度和活性發(fā)生變化[5，7-8]。過(guò)表達(dá)AVP1擬南芥株系的質(zhì)膜H+-ATPase的豐度增大，導(dǎo)致了轉(zhuǎn)基因擬南芥的質(zhì)外體酸化，上述酸化作用的直接結(jié)果是加速了植物生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸，由此導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因株系側(cè)根增多，有機(jī)酸分泌增多，磷活化作用增強(qiáng)[4，7]。不管是在正常生長(zhǎng)條件還是低磷生長(zhǎng)條件下，過(guò)表達(dá)AVP1擬南芥和水稻株系表現(xiàn)出根系和地上部分更發(fā)達(dá)。過(guò)表達(dá)AVP1擬南芥株系表現(xiàn)出抗旱性和耐鹽性增強(qiáng)[9]。過(guò)表達(dá)AVP1D（AVP1的功能增強(qiáng)突變體，其氨基酸序列的第229位由E突變成D）番茄株系的PPi水解活性和質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性得到增強(qiáng)[10-11]，然而在正常生長(zhǎng)條件下，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因株系的地上部分和果實(shí)大小沒(méi)有明顯差異[7]；溫室條件下，過(guò)表達(dá)AVP1D番茄植株表現(xiàn)出地上部分和根系生物量增大，在低磷生長(zhǎng)條件下，果實(shí)產(chǎn)量也顯著增大，而在正常生長(zhǎng)條件下，根系生物量?jī)H稍微增大。大田試驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)AVP1D番茄植株的果實(shí)鮮質(zhì)量?jī)H比對(duì)照稍微高些，然而轉(zhuǎn)基因株系的單株成熟果實(shí)數(shù)量顯著高于對(duì)照植株（約高25%），這一結(jié)果與Mohammed等[12]報(bào)道的類型I液泡膜H+-PPase基因在果實(shí)發(fā)育中的功能相一致。與對(duì)照相比，過(guò)表達(dá)AVP1D番茄植株表現(xiàn)出更強(qiáng)的生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)活性和根圍酸化能力，而且在缺磷條件下，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出更高的從葉（源）到果實(shí)（庫(kù)）的磷轉(zhuǎn)運(yùn)活性。此外，在所有試驗(yàn)條件下，過(guò)表達(dá)類型I液泡膜H+-PPase基因均能顯著提高轉(zhuǎn)基因植株的移栽成活率[13]。

在前期研究工作中，中科院西北高原生物研究所分子實(shí)驗(yàn)室已從豆科模式植物截形苜蓿（Medicago truncatula）中克隆到一種液泡膜焦磷酸酶（V-H+-PPase）基因MtVP1[14]。目前，尚未見(jiàn)用反向遺傳學(xué)手段研究豆科植物類型I液泡膜H+-PPase基因的報(bào)道。本試驗(yàn)在前期研究工作的基礎(chǔ)上，構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI121-MtVP1，轉(zhuǎn)化擬南芥，然后對(duì)轉(zhuǎn)化子表型進(jìn)行了相關(guān)分析，為研究類型I液泡膜H+-PPase基因的功能提供參考，也為截形苜蓿液泡膜焦磷酸酶基因MtVP1的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)截形苜蓿液泡膜焦磷酸酶基因MtVP1的擬南芥植株獲得過(guò)程及鑒定參照文獻(xiàn)[15]，轉(zhuǎn)GUS基因的對(duì)照植株由中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所王海慶課題組保存。

1.2 方法

1.2.1 過(guò)表達(dá)MtVP1基因擬南芥幼苗的表型觀察及耐鹽性鑒定 擬南芥幼苗在1/2 MS固體培養(yǎng)基上萌發(fā)7d，然后轉(zhuǎn)移到不含鹽和含0.15mol/L NaCl的MS固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)21 d后，觀察轉(zhuǎn)基因幼苗在不加鹽MS固體培養(yǎng)基上地上部分的形態(tài)和根的形態(tài)，測(cè)定幼苗地上部分鮮質(zhì)量，計(jì)數(shù)主根數(shù)，并觀察轉(zhuǎn)基因幼苗生長(zhǎng)在0.15 mol/L NaCl MS培養(yǎng)基上的表型。

1.2.2 根圍酸化分析 擬南芥幼苗在1/2 MS固體培養(yǎng)基上萌發(fā)7 d，然后轉(zhuǎn)移到含有1 mmol/L MES和0.04 g/L溴甲酚紫（bromocresol purple）的MS固體培養(yǎng)基（pH值6.8）上，培養(yǎng)10d。配制3種pH值（6.8，6.0，5.2）的上述培養(yǎng)基，以其顏色作為參照，來(lái)確定擬南芥幼苗的根圍酸化程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 過(guò)表達(dá)MtVP1擬南芥幼苗的表型觀察及耐鹽性鑒定

不同植物來(lái)源的類型I液泡膜焦磷酸酶的氨基酸序列是高度相似的[3]，表明截形苜蓿焦磷酸酶基因MtVP1轉(zhuǎn)入擬南芥中后應(yīng)該是有生理功能的。與轉(zhuǎn)GUS基因的對(duì)照株系相比，過(guò)表達(dá)MtVP1的擬南芥表現(xiàn)出葉片面積增大且葉片數(shù)目增多（圖1-a），地上部分的生物量增大，2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系（AtMtVP1-1和AtMtVP1-2）的平均地上部分鮮質(zhì)量比對(duì)照分別增加了58%和81%（圖1-b），2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系（AtMtVP1-1和AtMtVP1-2）的根系比對(duì)照要發(fā)達(dá)（圖1-d），更為有意思的結(jié)果是2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系（AtMtVP1-1和AtMtVP1-2）的主根增多了，對(duì)照株系的主根都是1個(gè)，而轉(zhuǎn)MtVP1株系在根莖結(jié)合的部位都長(zhǎng)出了2～3條根（圖1-f），這些根的粗細(xì)差不多，分不清主次，淡黃色，跟對(duì)照株系主根的顏色相近（圖1-e），所以，過(guò)表達(dá)MtVP1促進(jìn)了擬南芥主根的發(fā)育，使主根增多。然而幼苗耐鹽試驗(yàn)結(jié)果（圖1-c）表明，過(guò)表達(dá)MtVP1沒(méi)有顯著提高擬南芥的耐鹽性，2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系（AtMtVP1-1和AtMtVP1-2）均不能在含0.15 mol/L NaCl的MS培養(yǎng)基上完成生活史。

2.2 根圍酸化分析

已有文獻(xiàn)表明，過(guò)表達(dá)擬南芥液泡膜焦磷酸酶基因AVP1能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因株系的根系更為發(fā)達(dá)，并且導(dǎo)致根細(xì)胞的質(zhì)外體中的pH值下降0.5個(gè)單位[4]。由于以上這2個(gè)原因會(huì)使轉(zhuǎn)基因株系的根圍酸化能力增強(qiáng)，為了驗(yàn)證截形苜蓿液泡膜焦磷酸酶基因MtVP1是否具有上述功能，進(jìn)行了根圍酸化分析。結(jié)果表明，2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系（AtMtVP1-1和AtMtVP1-2）的根能使根際培養(yǎng)基的顏色由紫變?yōu)榈S色，而轉(zhuǎn)GUS基因的對(duì)照株系僅能使培養(yǎng)基的顏色變成深綠色（圖2），因此，過(guò)表達(dá)MtVP1也能增強(qiáng)擬南芥的根圍酸化能力。

3 討論

理論上，存在3種可用于減少植物細(xì)胞Na+過(guò)度積累造成傷害的策略：（1）確定質(zhì)膜上轉(zhuǎn)運(yùn)Na+通道蛋白或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白后，降低這些蛋白的活性；（2）Na+區(qū)隔化，這依賴于植物體內(nèi)有較大的液泡，且需要多種蛋白（酶）的配合，如位于液泡膜上的陽(yáng)離子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、陰離子通道蛋白以及負(fù)責(zé)建立跨液泡膜電化學(xué)梯度的H+-ATPase或H+-PPase。然而，陽(yáng)離子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如AtNHX1在一些對(duì)生長(zhǎng)非常重要的細(xì)胞內(nèi)（如根的分生組織）不表達(dá)。所以，這種提高植物耐鹽性的策略存在一定的局限性。（3）Na+外排，如利用質(zhì)膜上的陽(yáng)離子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SOS1，把吸收到細(xì)胞內(nèi)的Na+再排到植物體外[16-17]。（4）滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，如海藻糖[18]、脯氨酸[19]，這些物質(zhì)的積累可以提高轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性和抗旱性。本試驗(yàn)克隆得到的截形苜蓿液泡膜H+-PPase基因MtVP1轉(zhuǎn)入到擬南芥后，轉(zhuǎn)基因植株的幼苗沒(méi)有表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐鹽性，可能跟AtNHX1在根的分生組織不表達(dá)以及細(xì)胞內(nèi)的液泡較小有關(guān)。因此，植物的耐鹽機(jī)制是1種由多基因參與調(diào)控的非常復(fù)雜的機(jī)制，在植物體內(nèi)只過(guò)表達(dá)1種外源基因，有時(shí)不能到達(dá)預(yù)期效果。目前，有些實(shí)驗(yàn)室已在嘗試選用組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子或逆境誘導(dǎo)啟動(dòng)子以及把多個(gè)耐鹽相關(guān)基因同時(shí)轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)，得到了比轉(zhuǎn)單一耐鹽相關(guān)基因耐鹽性更強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因株系。

液泡膜H+-PPase除了具有質(zhì)子泵的作用外，還能控制植物生長(zhǎng)素的運(yùn)輸。通過(guò)對(duì)擬南芥AVP1基因的深入研究表明，AVP1表達(dá)的變化能夠影響質(zhì)膜上的三磷酸腺苷酶（P-ATPase）和植物生長(zhǎng)素外流介體（如PIN1）的分布和數(shù)量。過(guò)表達(dá)AVP1能夠使具有調(diào)節(jié)器官形成功能的生長(zhǎng)素的外流變得更為容易，促進(jìn)植物生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸，進(jìn)而促進(jìn)器官開(kāi)始形成時(shí)的細(xì)胞分裂，最終使植物的生物量均顯著增大[4]。本試驗(yàn)得到的轉(zhuǎn)基因擬南芥，與對(duì)照相比，地上部分生物量明顯增大，主根數(shù)增多，整個(gè)根系也更發(fā)達(dá)，說(shuō)明MtVP1也具有AVP1同樣的功能，能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸，進(jìn)而影響生長(zhǎng)素介導(dǎo)的器官發(fā)育。

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Improved Growth and Rhizosphere Acidification inArabidopsis Overexpressing Medicago truncatulaVacuolar H+-PPase Gene

WANG Jianwu，XIANG Weiwei
（CollegeofLifeSciences，YulinUniversity，Yulin719000，China）

In preliminary research work,a kind of vacuolar H+-PPase gene,named MtVP1,was cloned from the legume model plant Medicago truncatula,and characterized.On the basis of preliminary work,plant expression vector were constructed,then transferred MtVP1 intoArabidopsis and observed transgenic Arabidopsis phenotypic changes.The phenotype of transgenic Arabidopsis suggested that MtVP1 overexpression resulted in more robust root system,increased primary root number（1-2）,increased biomass of shoot and enhanced rhizosphere acidification.However,seedling salt tolerance experiments showed that there was noobvious difference betweentransgenic linesandCK plants.

vacuolarH+-PPase;rootdevelopment;rhizosphereacidification;salttolerance

Q789

A

1002-2481（2016）07-0907-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.07.04

2016-03-10

榆林學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（14GK39）

王建武（1983-），男，山東滕州人，講師，主要從事植物分子生物學(xué)研究工作。相微微為通信作者。