何 真，張麗君，張曉玲

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學院，山西太原030031；2.山西省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)作物品種資源研究所，農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點實驗室，山西太原030031；3.大同市西韓鄉(xiāng)農(nóng)技推廣站，山西大同037000）

普那菊苣再生體系的優(yōu)化

何 真1，張麗君2，張曉玲3

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學院，山西太原030031；2.山西省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)作物品種資源研究所，農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點實驗室，山西太原030031；3.大同市西韓鄉(xiāng)農(nóng)技推廣站，山西大同037000）

以普那菊苣葉片、葉柄、莖段為外植體，比較了在含不同激素濃度配比的MS培養(yǎng)基上愈傷組織、芽分化以及根再生的情況，優(yōu)化普那菊苣組織培養(yǎng)再生體系。結(jié)果表明，0.1%HgCl2滅菌8 min時，能有效地去除外植體表面上的微生物，而且對外植體的傷害較輕；葉片、葉柄和莖段均能通過組織培養(yǎng)獲得再生植株，其中，葉片外植體誘導效果最佳，莖段外植體誘導效果最差；普那菊苣葉片的極性對愈傷組織的形成以及不定芽的產(chǎn)生沒有顯著影響；外植體類型是影響愈傷組織、芽分化以及根再生的主要因素。優(yōu)化的普那菊苣再生體系為：使用葉片外植體，愈傷組織和芽分化誘導培養(yǎng)基為MS＋6-BA 1.5 mg/L＋IBA 0.2 mg/L＋AgNO30.5 mg/L＋Vc 0.3 mg/L或MS+KT 1.0mg/L＋IAA 0.3mg/L＋CH 100mg/L，生根培養(yǎng)基為MS＋NAA 0.2mg/L或MS＋IBA 0.2mg/L。

普那菊苣；外植體；離體再生；優(yōu)化

菊苣（Cichorium intybus L.cv.Puna） 為菊科（Asteraceae）菊苣屬（Cichorium）多年生宿根雙子葉草本植物，為藥食兩用植物，原產(chǎn)于歐洲。普那菊苣是利用生長在俄羅斯外高加索地區(qū)的菊苣株系選育出的飼用品種，1997年全國牧草飼料品種審定委員會登記其為引進牧草新品種[1]。普那菊苣的地下部分可用作制糖原料、咖啡替代品等，地上部分可用作葉類蔬菜或飼料。其主要分布在我國西北、華北等地區(qū)。由于干旱、鹽堿對普那菊苣的產(chǎn)量造成一定的限制，所以，通過基因工程手段，提高普那菊苣的耐旱、耐鹽能力，對改善西北、華北等地區(qū)土壤鹽堿化具有較大的應用價值。菊苣在美國已被批準為可商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物[2-4]，目前利用基因工程手段對菊苣的遺傳改造已有報道，國外主要采用發(fā)根培養(yǎng)及葉盤轉(zhuǎn)化進行遺傳轉(zhuǎn)化[5-9]，我國主要采用農(nóng)桿菌介導的外植體進行遺傳轉(zhuǎn)化[10-18]。進行遺傳轉(zhuǎn)化體研究，首先要建立普那菊苣組織培養(yǎng)植株再生體系。良好的受體系統(tǒng)是普那菊苣遺傳轉(zhuǎn)化研究的基礎，可顯著提高轉(zhuǎn)化效率[19-21]。但普那菊苣在組織培養(yǎng)方面仍存在一些問題，如愈傷組織易玻璃化、褐化，生芽生根率不高。

本研究在前人的工作基礎上，以普那菊苣為試驗材料，優(yōu)化普那菊苣的再生體系，提高再生轉(zhuǎn)化率，為下一步提高遺傳效率打下堅實的基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為普那菊苣（2n＝2x＝18），由山西省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所提供。

1.2 培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件

1.2.1 培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，蔗糖濃度為3%（M/V），瓊脂用量為0.6%（M/V），附加不同種類和濃度配比的外源激素（表1），pH值為5.4～5.8，于121℃滅菌20min后備用。

1.2.2 培養(yǎng)條件 外植體在溫度（28±1）℃，光照強度1300～1500lx，光周期16h（光）/8h（暗）條件下培養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1 外植體的處理 晴天采摘大田里鮮嫩的普那菊苣葉片，流水沖洗30 min，接著在超凈工作臺上用75%乙醇消毒2 min，0.1%HgCl2中滅菌，再用無菌水沖洗3～5次，并用濾紙吸干葉片表面的水跡。HgCl2浸泡時間設為4，8，12min，每個處理重復3次，每個培養(yǎng)皿接種20個外植體。

1.3.2 愈傷組織誘導、芽的分化及根的誘導 將經(jīng)過消毒處理后的葉柄、葉片和莖段切成1 cm2或0.5 cm2的小塊或段，分別以遠軸面（葉背面）和近軸面（葉正面）向上置于愈傷組織誘導培養(yǎng)基中。每個處理重復3次，每個培養(yǎng)皿接種20個外植體，14 d后統(tǒng)計出愈率以及極性對愈傷形成的影響。隨后將產(chǎn)生愈傷組織的外植體轉(zhuǎn)移到芽誘導培養(yǎng)基上，進行叢生芽的誘導，14 d繼代一次，30 d后統(tǒng)計出芽率。當不定芽長至3cm左右時，將不定芽切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，進行生根誘導。

出愈率=出現(xiàn)愈傷組織的外植體數(shù)/誘導愈傷組織的外植體總數(shù)×100%；出芽率=出現(xiàn)不定芽的外植體數(shù)/出現(xiàn)愈傷組織的外植體總數(shù)× 100%；生根率=生根芽苗數(shù)/誘導生根的芽苗總數(shù)×100%[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時間效果比較

HgCl2浸泡時間為4 min時，葉片消毒不夠徹底，不能有效去除外植體表面上的微生物，外植體的污染較高；浸泡時間為8min時，不僅能有效地去除外植體表面上的微生物，而且對外植體的傷害較輕，外植體全部能夠形成愈傷組織；浸泡時間為12 min時，外植體表皮的大量細胞死亡，外植體不能形成愈傷組織。因此，HgCl2最佳浸泡時間為8min。2.2 愈傷組織分化

葉柄、葉片和莖段3種外植體均能在含有不同濃度的6-BA＋IBA，6-BA＋NAA和KT的3種培養(yǎng)基上分化形成愈傷組織（表1）。外植體接種到誘導培養(yǎng)基上3 d后，外植體的邊緣或者兩端的切口處，開始膨脹形成許多小突起，使外植體發(fā)生彎曲，慢慢地突起連成一片，形成墨綠色、綠色或者淡黃色愈傷組織。葉柄外植體在兩端切口處形成墨綠色愈傷組織，分化能力強，出芽最早，但出芽率不是很高；葉片外植體形成大面積的深綠色愈傷組織，隨著時間的延長愈傷組織布滿整個葉片，分化能力強，使葉片外植體成為球狀，出芽時間僅次于葉柄，出芽率最高；莖段外植體僅在兩端切口處形成淺綠色愈傷組織，但分化能力較差、出芽率低，獲得的愈傷組織易褐化。對葉片外植體極性的對比試驗結(jié)果表明，離體葉片葉背向上和葉正面向上發(fā)生不定芽的時間和數(shù)量沒有顯著區(qū)別，說明普那菊苣葉片的極性對再生不定芽沒有顯著影響。6-BA＋IBA，6-BA＋NAA和KT激素配比的3種培養(yǎng)基，6-BA＋IBA形成的愈傷組織容易玻璃化和褐化，添加AgNO3和Vc能明顯改善玻璃化和褐化現(xiàn)象，形成的愈傷組織濃綠，質(zhì)地致密；6-BA＋NAA培養(yǎng)基上外植體形成愈傷組織且容易生長不定根，隨著時間延長愈傷組織仍然只處于外植體的切口處，不定根不斷地長大、長長；KT＋IAA培養(yǎng)基上形成較為理想的愈傷組織，顏色濃綠，質(zhì)地致密，出現(xiàn)芽點的時間較早。

2.3 芽誘導分化

將形成的質(zhì)地致密、顏色濃綠的愈傷組織外植體轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基中，6-BA＋IBA，6-BA＋NAA和KT的3種培養(yǎng)基均可以誘導芽分化培養(yǎng)。由表1可知，在含有6-BA＋IBA的培養(yǎng)基誘導的愈傷組織容易分化出芽，產(chǎn)生的叢生芽個數(shù)較多，可以形成放射狀生長的不定芽；6-BA＋NAA形成的愈傷組織較少，不利于芽分化，產(chǎn)生的叢生芽個數(shù)較少；KT＋IAA產(chǎn)生的叢生芽個數(shù)較多，也可以形成放射狀生長的不定芽，雖然誘導的愈傷組織出芽的時間晚于6-BA＋IBA，但是KT＋IAA培養(yǎng)基中玻璃化現(xiàn)象較少。

表1 不同激素組合對普那菊苣愈傷組織、不定芽和根形成的影響

2.4 根的誘導分化

普那菊苣在無激素的MS或1/2 MS根誘導培養(yǎng)基上，誘導率幾乎為0。不定芽在含有IAA，NAA，IBA的培養(yǎng)基上均能誘導生根，但是含有激素的1/2 MS和MS培養(yǎng)基相比，MS培養(yǎng)基更適合生根培養(yǎng)。由圖1可知，在IAA，NAA，IBA這3種生根培養(yǎng)基中，IAA誘導芽苗生根，但是生根較短，隨著時間延長根系生長緩慢甚至停止生長。而MS＋NAA，MS＋IBA培養(yǎng)基更適合生根，NAA與IBA相比，MS＋NAA 0.2mg/L誘導的根系直根更加粗壯，根系長度較短、數(shù)量多、密度大；而MS＋IBA 0.2 mg/L誘導的直根較細，長勢較快，生長后長出許多側(cè)根。

2.5 普那菊苣組織培養(yǎng)再生體系的優(yōu)化

通過對不同類型外植體的愈傷組織誘導，發(fā)現(xiàn)大田直接來源和大田無菌培養(yǎng)來源的材料誘導差異不明顯，但各類型外植體之間存在誘導差異，其誘導效果最好的是葉片，葉柄其次，莖段最差。普那菊苣愈傷組織誘導試驗結(jié)果表明，外植體類型是影響誘導效果的主要因素。普那菊苣再生培養(yǎng)的最佳體系是采用葉片作為外植體，愈傷組織和芽分化誘導培養(yǎng)基為：MS＋6-BA 1.5 mg/L＋IBA 0.2 mg/L＋AgNO30.5mg/L＋Vc 0.3mg/L或MS＋KT 1.0mg/L＋IAA 0.3 mg/L＋CH 100 mg/L；生根培養(yǎng)基為：MS＋NAA 0.2mg/L或MS＋IBA 0.2mg/L。通過該體系可以得到質(zhì)地致密的愈傷組織、較多的叢生芽以及根系粗壯發(fā)達的幼苗。

3 討論

保存植物種質(zhì)資源的一個有效途徑就是采用組織培養(yǎng)技術快速繁殖親本材料。外植體的選取、植物激素的配比和適當?shù)姆敝撤绞绞菍崿F(xiàn)高效快速繁殖的重要因素。本研究選用不同激素配比的培養(yǎng)基對普那菊苣外植體進行了再生研究，普那菊苣的葉片、葉柄和莖段均能通過組織培養(yǎng)獲得再生植株，其出愈率、出芽率和生根率在適當培養(yǎng)基中均能接近100%。

本研究選用6-BA＋IBA，6-BA＋NAA和KT的3種培養(yǎng)基進行愈傷組織和芽分化誘導，其中，6-BA具有高效、穩(wěn)定、廉價和易于使用等特點[23]，因此，愈傷組織和芽分化誘導培養(yǎng)基選擇MS＋6-BA 1.5 mg/L＋IBA 0.2 mg/L＋AgNO30.5 mg/L＋Vc 0.3 mg/L或MS＋KT 1.0 mg/L＋IAA 0.3 mg/L＋CH 100 mg/L。普那菊苣生根是組織培養(yǎng)的一個關鍵環(huán)節(jié)，只有根系發(fā)達，才能長出健壯的分化苗。

不定芽在含有IAA，NAA或IBA的培養(yǎng)基誘導根的生成，植株表現(xiàn)出較大的差異，IAA誘導的根較短；NAA誘導的根系直根比較粗壯，根長度較短、數(shù)量多、密度大；而IBA誘導的直根較細，長勢較快、生長后長出許多側(cè)根。因此，應根據(jù)不同的試驗目的，選擇不同激素的生根培養(yǎng)基。

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Study on Optimization of Regeneration System of Puna Chicory

HE Zhen1，ZHANG Lijun2，ZHANG Xiaoling3
（1.Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan030031，China；2.KeyLaboratoryofCropGeneResourcesandGermplasm EnhancementonLoessPlateau，MinistryofAgriculture，Shanxi KeyLaboratoryofGenetic ResourcesandGenetic Improvement ofMinorCrops，InstituteofCropGermplasmResources，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan030031，China；3.DatongXihanTownshipAgricultural TechnologyExtensionStation，Datong037000，China）

Optimization of Puna chicory regeneration system improves the Puna chicory regeneration efficiency.Chicory leaf segments,petiolesegments,stemsegments wereused as experimental materials.Theexplants wereinoculated ontotheMS mediumwith various phytohormone combinations to induce callus formation,and bud and root regeneration.The paper analyzed the effects of phytohormone concentrations and combinations on the induction of callus,buds and roots.The result showed that the most appropriate sterilizedtimewas8 minwith0.1%HgCl2andunderthesecircumstancesinjury onexplantscouldbelessenandmicrobesonthesurface of plant could be eliminated effectively.Callus and adventitious buds could be easily and efficiently induced fromPuna chicory leave, petiole.Leavesegments hadthebest inducingeffect,whilestemsegments hadtheworst.Explants typewas themajor factor affecting the callus,adventitious bud and root induction.Optimummediums for the induction of callus,adventitious bud and root was MS＋6-BA 1.5mg/L＋IBA 0.2mg/L＋AgNO30.5mg/L＋Vc 0.3mg/L orMS＋KT 1.0mg/L＋IAA 0.3mg/L＋CH 100mg/L andMS＋NAA 0.2 mg/L orMS＋IBA 0.2mg/L,basedonusingleaveexplants.

Punachicory;explants; in vitro regeneration;optimization

S548

A

1002-2481（2016）07-0910-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.07.05

2016-04-19

山西省自然基金項目（2014011030-1）；山西省國際合作項目（2014081032-1）

何 真（1972-），女，重慶涪陵人，助理研究員，主要從事作物栽培研究工作。張麗君為通信作者。