張春芬，潘天任，鄧舒，肖蓉，聶元軍，李倩，蘇東濤，曹秋芬，，孟玉平

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，山西太原030031；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山西太原030031；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與經(jīng)濟(jì)研究所，山西太原030006；4.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006；5.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山西太原030031）

草莓莖尖快速繁殖體系的研究

張春芬1，潘天任2，鄧舒1，肖蓉1，聶元軍3，李倩4，蘇東濤3，曹秋芬1，5，孟玉平5

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，山西太原030031；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山西太原030031；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與經(jīng)濟(jì)研究所，山西太原030006；4.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006；5.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山西太原030031）

以“紅顏”草莓匍匐莖莖尖為外植體，研究了不同次氯酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)及處理時(shí)間、不同濃度激素配比對(duì)莖尖增殖、組培苗生根的影響，以篩選出外植體最適的消毒處理和最適合的培養(yǎng)基。結(jié)果表明，草莓“紅顏”匍匐莖莖尖消毒以2%次氯酸鈉處理10～15 min為宜；不定芽增殖以1.0 mg/L 6-BA＋0.3 mg/L IBA組合與0.5 mg/L 6-BA＋0.1 mg/LIBA較佳；適宜生根的培養(yǎng)基為1/2 MS＋0.1～0.3 mg/LIBA。

草莓；莖尖；快速繁殖

草莓（Fragaia ananassa Duchesne）屬薔薇科草莓屬多年生常綠草本植物，是世界上廣泛栽培的重要經(jīng)濟(jì)作物。其色澤鮮艷，多汁，酸甜可口，芳香宜人，有“水果皇后”之美譽(yù)[1]。加之適應(yīng)性廣，栽培容易，生產(chǎn)周期短，見效快，經(jīng)濟(jì)效益高，特別是溫室保護(hù)地栽培技術(shù)的快速發(fā)展，可以使之提前或延遲上市，實(shí)現(xiàn)周年生產(chǎn)和供應(yīng)，加速了草莓生產(chǎn)面積的迅速擴(kuò)大[2]。為確保生產(chǎn)出高品質(zhì)的草莓果實(shí)，必需提供大量的優(yōu)質(zhì)草莓種苗。傳統(tǒng)生產(chǎn)過程中，草莓主要通過匍匐莖分株繁殖提供種苗，而匍匐莖分株繁殖苗繁殖系數(shù)低，苗質(zhì)量差，且易感染病毒，影響種苗的品質(zhì)及其經(jīng)濟(jì)價(jià)值，成為阻礙草莓生產(chǎn)的主要問題[3]。通過組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)獲得大量脫毒苗是解決這一問題的有效途徑[4]。

本研究利用草莓“紅顏”莖尖作為外植體，通過研究外植體的消毒時(shí)間、不同激素配比對(duì)草莓莖尖增殖及生根的影響，篩選出有利于草莓組培繁殖的最佳處理，以建立簡(jiǎn)易高效的草莓快繁技術(shù)體系，為實(shí)現(xiàn)脫毒苗工廠化、規(guī)模化生產(chǎn)，快速培育優(yōu)良的草莓種苗提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料

以草莓栽培品種“紅顏”的匍匐莖莖尖為試驗(yàn)材料，采自陽(yáng)曲縣浦豐農(nóng)林科技有限公司試驗(yàn)基地。

1.2 方法

試驗(yàn)在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心研究室進(jìn)行。

1.2.1 外植體消毒連續(xù)晴天的下午，自田間選取健壯母株上生長(zhǎng)充實(shí)、頂端懸空而小葉未展開的匍匐莖，帶回實(shí)驗(yàn)室，剪取頂端約5 cm長(zhǎng)的頂芽，用紗布包好置于自來(lái)水下沖洗1 h，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用75%酒精浸泡30 s后，用滅菌蒸餾水沖洗2～3遍，轉(zhuǎn)入2%～5%次氯酸鈉中，不斷搖動(dòng)燒杯，使次氯酸鈉溶液與莖尖充分接觸，經(jīng)不同時(shí)間消毒后，再用無(wú)菌水沖洗4～5遍，用無(wú)菌吸水紙吸干表面水分，在解剖鏡下切取約2 mm的莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)，接種于初代培養(yǎng)基上。

試驗(yàn)設(shè)次氯酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，5%共2個(gè)水平，消毒時(shí)間為5，10，15 min共3個(gè)水平，總共6個(gè)處理。每瓶接種一個(gè)莖尖，每個(gè)處理接種20瓶，重復(fù)3次。污染率、褐化率在接種后10 d統(tǒng)計(jì)，萌發(fā)率在接種30 d后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

污染率＝污染芽數(shù)/接種芽數(shù)×100%；褐化率＝褐化芽數(shù)/接種芽數(shù)×100%；萌發(fā)率＝萌發(fā)芽數(shù)/接種芽數(shù)×100%。

1.2.2 繼代增殖初代接種成活21～28 d后，將萌發(fā)芽轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中，增殖培養(yǎng)基為添加不同濃度的6-BA與IBA的MS培養(yǎng)基。

試驗(yàn)設(shè)細(xì)胞分裂素6-BA質(zhì)量濃度為0，0.3，0.5，0.8，1.0 mg/L共5個(gè)水平，生長(zhǎng)素IBA質(zhì)量濃度為0，0.1，0.3，0.5 mg/L共4個(gè)水平，共為14個(gè)組合。每瓶接3株，每處理10瓶，重復(fù)3次，30 d后調(diào)查增殖情況。增殖系數(shù)＝總增殖芽個(gè)數(shù)/總接種芽個(gè)數(shù)。

1.2.3 生根培養(yǎng)待繼代植株長(zhǎng)到一定大小時(shí)，自健壯苗上切取具三葉一心的不定芽接種于生根培養(yǎng)基上，生根培養(yǎng)基為1/2MS添加不同濃度的IBA。

試驗(yàn)設(shè)置生長(zhǎng)素IBA質(zhì)量濃度為0，0.1，0.3，0.5 mg/L共4個(gè)處理。每瓶接3株，每處理10瓶，重復(fù)3次，25 d后調(diào)查生根情況。平均生根條數(shù)＝總不定根數(shù)/生根芽數(shù)。

1.2.4 煉苗與移栽生根培養(yǎng)21～28 d后植株長(zhǎng)出3～5條1～3 cm的不定根后，將培養(yǎng)瓶移至溫室煉苗，溫度為25℃左右，2～3 d后瓶?jī)?nèi)小苗葉色深綠、表面有蠟質(zhì)層出現(xiàn)時(shí)打開瓶蓋，繼續(xù)煉苗3～5 d后從瓶?jī)?nèi)取出植株，洗去根部附著的培養(yǎng)基，然后浸入50%多菌靈可濕性粉劑500倍液5～10 min，沖洗晾干后定植于蛭石作基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)并澆透水，保濕培養(yǎng)7 d觀察其存活情況。

1.2.5 培養(yǎng)條件培養(yǎng)基如無(wú)特別說(shuō)明，均添加3%蔗糖、6.5 g/L瓊脂，pH值為5.8，培養(yǎng)基121℃滅菌20 min，自然冷卻后備用。培養(yǎng)條件為：溫度（25±2）℃，14 h光照，光照強(qiáng)度3 000 lx。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理時(shí)間對(duì)“紅顏”匍匐莖莖尖消毒效果的影響

由表1可知，次氯酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%和5%時(shí)，污染率隨著處理時(shí)間的增加而降低，而褐化率與之相反，隨著處理時(shí)間的增加而升高；污染率在2%次氯酸鈉處理5 min時(shí)最高，達(dá)71.7%，在5%次氯酸鈉處理15 min時(shí)最低，降至23.3%，褐化率則在2%次氯酸鈉處理5 min時(shí)最低，為3.3%，在5%次氯酸鈉處理15 min時(shí)最高，達(dá)到48.3%。Duncan方差分析顯示，污染率在2%次氯酸鈉處理5 min與其他5個(gè)處理間存在顯著差異，2%次氯酸鈉處理10，15 min和5%次氯酸鈉處理10，15 min間不存在顯著差異，5%次氯酸鈉處理5 min與處理10，15 min間都存在顯著差異。褐化率在2%次氯酸鈉處理5，10 min之間不存在差異，與其他4個(gè)處理間差異顯著，5%次氯酸鈉處理10，15 min的褐化率與其他4個(gè)處理間都存在顯著差異。接種30 d后的萌發(fā)率表現(xiàn)為在2%次氯酸鈉處理10 min時(shí)最高，為48.3%，其次為2%次氯酸鈉處理15 min時(shí)的46.7%，這二者之間不存在差異，但都與2%次氯酸鈉處理5 min（25.0%）和5%次氯酸鈉處理15 min（28.3%）存在顯著差異。綜合污染率、褐化率及萌發(fā)率，草莓“紅顏”匍匐莖莖尖消毒以2%次氯酸鈉處理10～15 min為適宜時(shí)間。

表1 不同處理時(shí)間對(duì)“紅顏”匍匐莖莖尖消毒效果的影響

2.2 外源激素對(duì)“紅顏”繼代增殖的影響

將長(zhǎng)勢(shì)一致的無(wú)菌苗分組接種到添加不同質(zhì)量濃度的6-BA與IBA的增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)各激素組合的不定芽增殖情況。從表2可以看出，草莓在無(wú)添加激素的培養(yǎng)基上也能增殖，但是增殖系數(shù)小，不能滿足試驗(yàn)及工廠化生產(chǎn)的需要。在添加1.0 mg/L 6-BA和0.3 mg/L IBA的培養(yǎng)基上，“紅顏”草莓的增殖系數(shù)最大，但苗生長(zhǎng)過快，容易形成畸形苗，且玻璃化嚴(yán)重；其次依次為組合1.0 mg/L 6-BA＋0.1 mg/L IBA，0.8 mg/L 6-BA＋0.3 mg/LIBA，0.8 mg/L6-BA＋0.1 mg/LIBA，增殖系數(shù)分別為8.54，8.39，8.08，各組合間不存在顯著差異，但是只在添加0.8 mg/L 6-BA＋0.3 mg/L IBA的培養(yǎng)基上植株長(zhǎng)勢(shì)健壯，其他組合則多畸形苗，容易玻璃化。在設(shè)定的各激素組合中，以0.8mg/L6-BA＋0.3 mg/L IBA組合與0.5 mg/L 6-BA＋0.1 mg/L IBA組合較佳，苗生長(zhǎng)健壯，增殖系數(shù)分別為8.39和7.74，二者之間不存在差異。

表2 外源激素對(duì)“紅顏”繼代增殖的影響

2.3 IBA質(zhì)量濃度對(duì)“紅顏”組培苗生根的影響

由表3可知，“紅顏”草莓的組織培養(yǎng)無(wú)菌苗極易生根，在不添加任何激素的1/2 MS中也能生根，但平均生根僅有2.1條，根系較短，且纖細(xì)。添加一定質(zhì)量濃度的IBA能促進(jìn)不定根的形成，在添加0.5 mg/L IBA培養(yǎng)基中雖平均生根條數(shù)最多（6.8），與其他處理都存在顯著差異，但有愈傷組織形成，且根系纖細(xì)，移栽不易成活。在添加0.1，0.3 mg/L IBA時(shí)根系較長(zhǎng)，且粗壯，有利于再生苗移栽成活。

表3 不同培養(yǎng)基對(duì)草莓生根的影響

3 討論與結(jié)論

在植物的離體培養(yǎng)中，無(wú)菌外植體的獲得是試驗(yàn)研究順利進(jìn)行的關(guān)鍵步驟[5]。從自然界采集的植物器官和組織材料表面攜帶有各種微生物，因此，在接種前，對(duì)植物材料進(jìn)行表面消毒是植物組織培養(yǎng)的首要工作。目前，有多種化學(xué)試劑作為消毒劑可用于植物組織培養(yǎng)外植體消毒，如2%～5%次氯酸鈉、0.1%升汞、10%過氧化氫等，這些試劑都對(duì)植物組織的表面消毒有良好的效果[6-7]。升汞是草莓常用的外植體表面消毒劑，但由于其是有劇毒的重金屬鹽消毒劑，殘留大，對(duì)環(huán)境和外植體材料都有很大毒害，因此，本研究選用無(wú)毒害作用且殘留少的次氯酸鈉作為消毒劑，次氯酸鈉濃度大小與處理時(shí)間的長(zhǎng)短不僅影響外植體的消毒效果，還影響著外植體的萌芽率。本研究中，草莓最佳處理為2%次氯酸鈉處理10～15 min，處理時(shí)間過短會(huì)增加污染率，增大工作量；而次氯酸鈉濃度過高雖能降低污染率但容易使外植體褐化，影響生長(zhǎng)甚至導(dǎo)致死亡。

外源激素是植物組織培養(yǎng)基中不可缺少的關(guān)鍵物質(zhì)，其濃度和比例會(huì)影響器官的分化，對(duì)植物離體器官的生長(zhǎng)和分化起到非常重要的作用。草莓組培苗的增殖擴(kuò)繁過程中，適當(dāng)濃度的激素組合是獲得高質(zhì)量、高增殖系數(shù)一個(gè)關(guān)鍵因素，激素濃度過高或過低都會(huì)影響不定芽的增殖及生長(zhǎng)效果。饒雪梅[8]研究了IBA質(zhì)量濃度對(duì)草莓組培增殖的影響，結(jié)果表明，增殖系數(shù)隨IBA質(zhì)量濃度增大而變大，但是在較高質(zhì)量濃度時(shí)，玻璃化比較嚴(yán)重。本研究也證實(shí)，較高質(zhì)量濃度IBA不利于不定芽的增殖，反而增加了愈傷組織的分化。本研究結(jié)果表明，IBA質(zhì)量濃度低于0.5 mg/L時(shí)，增殖系數(shù)隨6-BA質(zhì)量濃度的提高而增大，但是6-BA質(zhì)量濃度達(dá)到1.0mg/L時(shí)，不定芽畸形或玻璃化嚴(yán)重，這與袁倩等[9]的研究結(jié)論一致，使用較高質(zhì)量濃度的6-BA進(jìn)行草莓增殖培養(yǎng)增殖系數(shù)增大，但是易出現(xiàn)玻璃化[10]。本研究還發(fā)現(xiàn)，在6-BA質(zhì)量濃度為0.8 mg/L時(shí)與0.3 mg/L IBA組合優(yōu)于其他3個(gè)組合，但是與0.5 mg/L 6-BA＋0.1 mg/L IBA組合之間不存在顯著差異，說(shuō)明在草莓培養(yǎng)中改變其中一個(gè)激素的質(zhì)量濃度時(shí)，適當(dāng)改變另一激素的質(zhì)量濃度同樣能達(dá)到相同的效果。由此可見，在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，激素比例是影響草莓增殖分化的重要因素。

組培苗不定根的再生直接影響植物組培快繁工作的成本、工作效率和經(jīng)濟(jì)效益。與植物莖尖及其他幼嫩組織相比，根系對(duì)激素濃度的變化相對(duì)比較敏感，因此，誘導(dǎo)生根所需的激素水平較低。草莓生根常用激素有IAA，IBA，NAA。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不添加激素時(shí)也能誘導(dǎo)不定芽生根，但是根系纖細(xì)，且發(fā)根量少，添加一定濃度的IBA促進(jìn)了不定根的形成，濃度增加到0.5 mg/L時(shí)，反而會(huì)增加愈傷組織的形成，造成根系纖細(xì)，不利于移栽成活。崔廣榮等[11]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沒有添加任何激素的對(duì)照效果最好，這可能是由于內(nèi)源激素已能滿足植株生根的需要或IBA不利于此基因型草莓誘導(dǎo)生根，因此，在進(jìn)行草莓生根培養(yǎng)時(shí)，要根據(jù)試驗(yàn)情況，慎重選擇。此外，不少研究者發(fā)現(xiàn)，不同品種間對(duì)激素的濃度需求存在一定的差異，薛其勤等[12]在對(duì)豐香、章姬、甜查理、紅顏、卡姆羅莎5個(gè)品種的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與其他品種相比，豐香極易生根，在增殖培養(yǎng)基中也會(huì)有少量根系產(chǎn)生。

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Study on Rapid Propagation ofFragaia ananassaDuchesne Stem Tip

ZHANGChun-fen1，PANTian-ren2，DENGShu1，XIAORong1，NIE Yuan-jun3，LI Qian4，SUDong-tao3，CAOQiu-fen1，5，MENGYu-ping5
（1.Institute ofPomology，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China；2.Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China；3.Institute ofAgricultural Resources and Economy，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan 030006，China；4.College ofBiological Engineering，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；5.Research Center ofBiotechnology，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China）

To select the most suitable sterilization time and the most suitable medium,the effects of different disinfection time, different hormone combinations were studied in tissue culttre ofstrawberrytakingthe stemtip as explant material.The results showed that the best sterilization time by 2%NaClO was 10-15 min,the best generation media was 1.0 mg/L 6-BA＋0.3 mg/L IBA or 0.5 mg/L 6-BA＋0.1 mg/LIBA.The most suitable rootingmediumwas 1/2 MS＋0.1-0.3 mg/LIBA.

strawberry;stemtip;rapid propagation

S668.4

A

1002-2481（2016）03-0291-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.03.04

2015-10-09

山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技自主創(chuàng)新能力提升工程項(xiàng)目（2015zzcx-22）；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所項(xiàng)目

張春芬（1981-），女，山西翼城人，助理研究員，博士，主要從事園藝植物生物技術(shù)研究工作。