王利英，喬軍，石瑤，連勇，劉富中，陳鈺輝，張映，李素文

（1.天津科潤蔬菜研究所，天津300384；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京100081）

基因型對茄子小孢子培養(yǎng)誘導(dǎo)單倍體的影響

王利英1，喬軍1，石瑤1，連勇2，劉富中2，陳鈺輝2，張映2，李素文1

（1.天津科潤蔬菜研究所，天津300384；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京100081）

茄子游離小孢子培養(yǎng)是獲得單倍體的最有效途徑，可以快速固定優(yōu)良性狀，縮短育種年限。試驗選取茄子五大類型共計46份材料進行小孢子培養(yǎng)。結(jié)果表明，愈傷組織誘導(dǎo)率與4℃低溫預(yù)處理天數(shù)間沒有相關(guān)性，只與基因型有關(guān)。繼續(xù)進行分化培養(yǎng)，白肉紫紅圓茄愈傷組織較易誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體，誘導(dǎo)率高達69%；其次是綠茄和綠肉紫黑圓茄，誘導(dǎo)率達到56%；紫萼長茄誘導(dǎo)率為7%，綠萼長茄最難誘導(dǎo)。通過進一步完善茄子單倍體誘導(dǎo)體系，單倍體誘導(dǎo)率平均提高到39%，可直接輔助單倍體育種。

茄子；小孢子培養(yǎng)；單倍體；基因型

茄子單倍體研究較早，20世紀(jì)80年代，顧淑榮[1]從茄子花粉粒離體培養(yǎng)經(jīng)愈傷組織獲得少量再生植株。Tuberosa等[2]培養(yǎng)茄子花藥成功通過胚狀體途徑成苗，并觀察了單倍體植株的形態(tài)特征。Miyoshi[3]用直接游離小孢子培養(yǎng)的方法經(jīng)愈傷組織途徑得到再生植株。連勇等[4]應(yīng)用小孢子培養(yǎng)的方法獲得茄子大量體細胞融合雜種株的小孢子再生植株。孫振英等[5]利用茄子離體小孢子培養(yǎng)技術(shù)，通過愈傷組織再生獲得了茄子二倍體栽培種的再生植株。由于茄子基因型差異和培養(yǎng)基敏感性，迄今最高單倍體誘導(dǎo)率為7%左右，離育種實踐要求差距較大。

基因型是影響茄子單倍體誘導(dǎo)的一個關(guān)鍵性因素[6-7]，基因型材料的不同決定了愈傷組織誘導(dǎo)率也不同[8-9]。Chambonnet等[10-12]研究發(fā)現(xiàn)，相同誘導(dǎo)條件下，不同基因型材料的愈傷組織誘導(dǎo)率及分化率存在差異。Rao[13]研究發(fā)現(xiàn)，不同茄子基因型單倍體誘導(dǎo)所需萘乙酸（NAA）濃度不同。Afele等[14]用同樣方法游離茄子品種“Wase Shinkuro”產(chǎn)生胚狀愈傷組織，而品種“Kumamoto Naga”卻沒分化產(chǎn)生胚，認(rèn)為可能是由不同品種mRNA表達上的差異所致。

本研究選取茄子五大類型共計46份試驗材料進行小孢子培養(yǎng)，設(shè)置4℃低溫進行花藥預(yù)培養(yǎng)，選用液體KM培養(yǎng)基進行游離培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織，直到分化再生單倍體幼苗，輔助單倍體育種。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗于2014年秋季在天津科潤蔬菜研究所試驗基地進行，共種植46份試驗材料。茄子類型和品種名稱如表1所示。6月15日播種育苗，7月25日定植于日光溫室，每份材料種植20株，株行距為60 cm×70 cm，平畦地膜覆蓋，常規(guī)栽培管理。

表1 茄子小孢子培養(yǎng)所用46份試驗材料

1.2 試驗方法

1.2.1 花蕾采集及保存9月1日開始采集門茄花蕾，采集標(biāo)準(zhǔn)為花冠與萼裂處平齊或略高（2 mm以內(nèi)），花冠包裹緊密，11月底前采集結(jié)束。采集時間為晴天9：00—10：00。按品種不同分別用牛皮紙袋包好后進行花藥預(yù)培養(yǎng)剩下的花蕾置于4℃冰箱保存，第2天進行花藥預(yù)培養(yǎng)，第4天結(jié)束。

1.2.2 花藥預(yù)培養(yǎng)提前配制花藥預(yù)培養(yǎng)基：MS＋0.2 mg/L 2，4-D＋1 mg/L KT＋3%蔗糖＋7 g/L瓊脂＋0.5 g/L活性炭。預(yù)培養(yǎng)基pH值5.8，高溫121℃、高壓0.1 MPa滅菌20 min。超凈工作臺提前通風(fēng)30 min以上，75%酒精擦拭工作臺面，培養(yǎng)基滅菌后及時在超凈工作臺上分裝至直徑60 mm培養(yǎng)皿中備用，每皿裝10 mL培養(yǎng)基。

將不同品種花蕾依次放入三角瓶中標(biāo)記好名稱，每瓶滴2滴吐溫20，自來水沖洗5 min清潔花蕾表面。在超凈工作臺上用75%酒精浸泡30s后，用6.5%次氯酸鈉溶液（有效氯大于10%）浸泡20 min，再用無菌水清洗5 min，清洗3次。滅菌后的花蕾用無菌紙吸干表面水分備用。

在超凈工作臺上用鑷子剝開花冠，取出花藥接種在培養(yǎng)基表面，每皿接種2個花蕾的花藥，每個品種接種3皿，記錄品種名和接種時間，封口膜封口后轉(zhuǎn)移至36℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)6 d。

1.2.3 小孢子培養(yǎng)提前配制小孢子液體培養(yǎng)基：KM＋0.2 mg/L 2，4-D＋1.0 mg/L KT＋1 mg/L 6-BA＋5%葡萄糖，pH值5.8。用0.22 μm孔徑針頭式過濾器過濾滅菌，4℃冰箱保存。

挑取預(yù)培養(yǎng)結(jié)束未染菌的膨大花藥接種于液體培養(yǎng)基中，用無菌刀從花藥中部切成兩段，用鑷子擠壓游離小孢子后將花藥挑出，再用封口膜封口。

1.2.4 分化提前配制分化培養(yǎng)基：MS＋0.01 mg/L NAA＋2.0 mg/L 6-BA＋2%蔗糖＋5 g/L瓊脂＋0.5g/L活性炭。分化培養(yǎng)基pH值5.8，高溫121℃、高壓0.1 MPa滅菌20 min。

當(dāng)液體培養(yǎng)基中花藥頂端和中部出現(xiàn)愈傷組織時，長到2 mm以上即可轉(zhuǎn)接至分化培養(yǎng)基，置于光照強度1 500～2 000 lx、光照14 h/d，溫度25℃的組培架上培養(yǎng)。每間隔15 d切割繼代一次，30 d后可長出綠色芽苗。

1.2.5 再生提前配制生根培養(yǎng)基為：1/2 MS＋0.2 mg/L IBA＋5 g/L瓊脂＋3%蔗糖＋0.5 g/L活性炭。生根培養(yǎng)基pH值5.8，高溫121℃、高壓0.1 MPa滅菌20 min。

當(dāng)綠色芽苗長至1～3 cm高時即可轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基，置于光照強度2 000 lx、光照14 h/d、溫度25℃的組培架上培養(yǎng)。10 d左右切口處可見不定根生長，20 d后長成帶根小苗。

2 結(jié)果與分析

2.1 小孢子誘導(dǎo)愈傷組織及成苗比例

本試驗共分五大類供試基因型，分別是綠茄、綠肉紫黑圓茄、白肉紫紅圓茄、紫萼長茄和綠萼長茄，基本覆蓋所有茄子栽培類型。從表2可以看出，供試基因型有66%可以誘導(dǎo)出有效愈傷組織，41%可以誘導(dǎo)出芽，出芽后成苗率可達100%。

表2 茄子小孢子培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)及成苗比例

2.2 4℃冷藏天數(shù)對小孢子培養(yǎng)出愈率的影響

表3 4℃冷藏花蕾天數(shù)對綠茄花藥有效出愈率的影響%

表4 4℃冷藏花蕾天數(shù)對綠肉紫黑圓茄花藥有效出愈率的影響%

表5 4℃冷藏花蕾天數(shù)對白肉紫紅圓茄花藥有效出愈率的影響%

表6 4℃冷藏花蕾天數(shù)對紫萼長茄花藥有效出愈率的影響%

由表3～6可知，4℃冷藏花蕾天數(shù)對花藥有效出愈率沒有顯著影響，綠茄、綠肉紫黑圓茄和紫萼長茄出愈率保持在20%以上，白肉紫紅圓茄出愈率達到69%，而綠萼長茄出愈困難，出愈率為0。

2.3 愈傷組織誘導(dǎo)出芽率統(tǒng)計

愈傷組織出芽與否與基因型有關(guān)，茄子愈傷組織誘導(dǎo)出芽比較困難。由表7可知，紫萼長茄出芽率最低，只有7%，白肉紫紅圓茄出芽率達到69%，綠茄和綠肉紫黑圓茄出芽率均為56%。茄子再生相對愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽分化比較容易，再生率可達100%。

表7 愈傷組織出芽率統(tǒng)計%

3 討論

小孢子培養(yǎng)技術(shù)在白菜、菜花、蘿卜等蔬菜作物育種中廣泛應(yīng)用，明顯縮短了育種年限[15-17]。與十字花科蔬菜相比，茄果類蔬菜小孢子培養(yǎng)難度大，大多試驗停留在愈傷組織或類胚狀體階段，成功應(yīng)用的報道較少[18-20]。本試驗在前人研究的基礎(chǔ)上進行了大量優(yōu)化調(diào)整，旨在克服基因型影響，并進一步提高有效出愈率和成苗率，最終達到應(yīng)用水平。通過小孢子培養(yǎng)開展相關(guān)品種DH系的構(gòu)建工作，一方面可以加快品種純化速度，獲得優(yōu)異純合自交系，另一方面為茄子相關(guān)性狀科學(xué)研究提供精確永久的調(diào)查群體，對于分子遺傳圖譜構(gòu)建和QTL定位有重要作用，可直接輔助單倍體育種。

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Effects of Genotype on Induction of Haploid Induced by Microspore Culture of Eggplant

WANGLi-ying1，QIAOJun1，SHI Yao1，LIANYong2，LIUFu-zhong2，CHENYu-hui2，ZHANGYing2，LI Su-wen1
（1.Tianjin Kernel Vegetable Research Institute，Tianjin 300384，China；2.Institute ofVegetables and Flowers，Chinese AcademyofAgricultural Sciences，Beijing100081，China）

Isolated microspore culture of eggplant was the most effective way to obtain haploid,which could quickly fix good traits and shorten the breedingperiod.In this paper,five types ofeggplant including46 genotypes were selected for the microspore culture.The results showed that induction rate ofcallus was related to the genotype rather than the days ofpretreatment oflowtemperature at 4℃.In differentiation culture,white flesh purple round eggplant was easy to be induced to produce haploid,induction rate was up to 69%,followed by green eggplant and green flesh purple round eggplant up to 56%,purple calyx long eggplant up to 7%,and green calyx long eggplant was the most difficult one.Haploid induction rate of eggplant increased from 7%to 39%by further improvetion of the haploid induction system,and could directlyaid haploid breeding.

eggplant;microspore culture;haploid;genotype

S641.1

A

1002-2481（2016）03-0284-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.03.02

2015-11-02

國家科技支撐計劃項目（2014BAD01B08）；天津市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化與推廣資助項目（201304020）；天津市財政局農(nóng)業(yè)財政資金項目

王利英（1971-），女，天津薊縣人，研究員，碩士，主要從事茄子育種研究工作。李素文為通信作者。