楊振華

（楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程分院，陜西楊凌712100）

秋水仙素處理甘草種子染色體加倍研究

楊振華

（楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程分院，陜西楊凌712100）

在低溫下，用0.05%，0.20%，0.40%秋水仙素水溶液分別處理甘草的萌動種子1，2，3 d，干種子4，6，8 d，比較不同質(zhì)量分數(shù)處理和不同處理時間對種子的萌發(fā)率、加倍率及嵌合率的影響。結(jié)果表明，用0.40%秋水仙素處理萌動種子3 d染色體加倍效果最好，加倍率可達66.67%；萌發(fā)率隨處理時間的延長有降低的趨勢；嵌合率因秋水仙素質(zhì)量分數(shù)和時間的不同而各異，最高可達34.62%。

甘草；秋水仙素；萌動種子；干種子；染色體加倍

甘草屬于豆科（Leguminosae）甘草屬（Glycyrrihizal）灌木狀多年生草本植物，因具有極強的藥用價值而被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)中。此外，因特殊的生理性能，甘草可在寒冷、干旱環(huán)境中生長，在植被破壞嚴重已開始沙化的地區(qū)還有防風(fēng)固沙的巨大生態(tài)效益[1-2]。

甘草通過多倍體育種有2個明顯效果：一是可增加藥材產(chǎn)量，如國外用秋水仙素點滴曼陀羅的腑芽，育成四倍體植株，其植株形態(tài)大小及質(zhì)量都超過了二倍體曼陀羅。二是可提高藥材化學(xué)成分。曼陀羅四倍體葉中的生物堿含量大致是二倍體的2倍。薄荷的揮發(fā)油含量、茼蒿的山道年含量、除蟲菊精的含量多倍體也都比二倍體高[3]。

本試驗對多倍體育種中的化學(xué)誘導(dǎo)多倍體進行研究，采用秋水仙素對甘草種子進行處理，通過比較秋水仙素不同質(zhì)量分數(shù)處理和不同處理時間對種子萌發(fā)率、加倍率及嵌合率的影響，觀察染色體變異情況。

1 材料和方法

1.1 供試材料

選擇甘肅產(chǎn)地的脹果甘草為試驗材料，其染色體數(shù)目為2n＝2x＝14[4]。

1.2 試驗方法

試驗設(shè)在楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物遺傳實驗室。

1.2.1 浸種法處理干種子試驗選取300粒大小一致的甘草種子平均分配于10個培養(yǎng)皿中，其中，1個培養(yǎng)皿以蒸餾水處理作對照，另外9個培養(yǎng)皿分為3組加入不同質(zhì)量分數(shù)（0.05%，0.20%，0.40%）秋水仙素，給予不同時間（4，6，8 d）低溫冷藏，測定萌發(fā)率。之后再用自來水沖洗干凈后置于常溫下，待胚根長至0.5～1.0cm時，切取根尖進行倍性檢查[5-7]。

1.2.2 浸種法處理萌動種子試驗選取300粒大小一致的甘草種子平均分配于10個培養(yǎng)皿中，其中一個培養(yǎng)皿以蒸餾水處理作為對照，另外9個培養(yǎng)皿分為3組加入不同質(zhì)量分數(shù)（0.05%，0.20%，0.40%）的秋水仙素處理剛露白的萌動種子，給予不同時間（1，2，3 d）低溫冷藏后測定萌發(fā)率，萌發(fā)率＝萌發(fā)種子/待測種子×100%。之后再用自來水沖洗干凈后置于常溫下，待胚根長至0.5～1.0 cm時，切取根尖進行倍性檢查。

1.3 染色體數(shù)目鑒定的方法

待胚根長至0.5～1.0cm時，于10：00—10：30切取根尖，放入裝有2 mg/L8-羥基喹啉的小瓶中預(yù)處理2 h左右。經(jīng)蒸餾水沖洗再用卡諾固定液固定根尖4 h。倒去固定液，用蒸餾水浸洗根尖3～5次，每次5～10min。然后在裝有根尖的小瓶中加入1mol/L HCl數(shù)滴后，放入（60±0.5）℃的水浴鍋中酸解8～9 min。最后再用蒸餾水沖洗根尖并吸取根尖的水分，用改良苯酚品紅進行染色，壓片鏡檢。記錄每個根尖10個細胞染色體數(shù)目，以計算加倍率和嵌合率。加倍率＝加倍種子數(shù)/處理種子數(shù)×100%；嵌合率＝嵌合體數(shù)/處理種子數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素對甘草種子萌發(fā)率的影響

由圖1可知，萌動種子在秋水仙素處理下的萌發(fā)率均達到75%以上，尤其是0.20%秋水仙素處理2 d的萌發(fā)率最高，達到93%以上。

從圖2可以看出，所有處理干種子的萌發(fā)率均偏低，其萌發(fā)率在60.0%～76.67%，其中，以0.05%秋水仙素處理干種子6 d的萌發(fā)率最高，達到76.67%。秋水仙素處理萌動種子的萌發(fā)率明顯高于干種子。

2.2 秋水仙素對甘草染色體加倍率的影響

由圖3可知，隨著秋水仙素質(zhì)量分數(shù)的增加，處理1，3 d的萌動種子加倍率明顯增加；0.20%，0.40%秋水仙素處理萌動種子3 d的加倍率較高，分別為52.17%，66.67%。

由圖4可知，處理4 d的干種子染色體加倍率隨著秋水仙素質(zhì)量分數(shù)的升高而升高，從15%增加到63.64%；處理6 d秋水仙素質(zhì)量分數(shù)為0.20%的加倍率僅為25%，質(zhì)量分數(shù)0.40%時其加倍率最高，為33.33%；處理8 d的染色體加倍率在秋水仙素3個質(zhì)量分數(shù)下呈現(xiàn)低—高—低的趨勢，并以0.20%質(zhì)量分數(shù)時的加倍率最高（45%）[8]。說明在不同秋水仙素質(zhì)量分數(shù)水平下，當(dāng)質(zhì)量分數(shù)較低時，隨著處理時間的延長，加倍率明顯增加，而在較高質(zhì)量分數(shù)下，隨著處理時間的延長，加倍率卻明顯下降。

2.3 秋水仙素誘導(dǎo)染色體加倍中的嵌合體表現(xiàn)

雖然秋水仙素處理甘草種子能夠?qū)е录毎缎缘脑黾?，但同時也會使細胞產(chǎn)生倍性嵌合現(xiàn)象。由圖5可知，當(dāng)處理時間為1，2 d時，隨著秋水仙素質(zhì)量分數(shù)秋水仙素的升高，嵌合率呈漸增趨勢；而第3 d時，隨著秋水仙素質(zhì)量分數(shù)的升高，嵌合率反而降低，其中，以0.05%秋水仙素處理萌動種子3 d的嵌合率最高，達到34.62%。

由圖6可知，嵌合率以秋水仙素處理干種子6 d較高，而0.20%秋水仙素處理4 d最高，達27.78%。說明秋水仙素的質(zhì)量分數(shù)不同對嵌合率有較大影響，但嵌合率與秋水仙素質(zhì)量分數(shù)不成簡單的線性關(guān)系，嵌合率的增加還與其他影響因子如處理時間、溫度等相關(guān)，它們之間的影響規(guī)律有待進一步研究。

3 結(jié)論與討論

秋水仙素本身是有毒物質(zhì)[9]，在處理種子時會對種子的萌發(fā)產(chǎn)生毒害作用，從而影響種子的萌發(fā)率。本研究結(jié)果表明，隨著秋水仙素處理時間的延長，種子萌發(fā)率有下降的趨勢，尤其是干種子的萌發(fā)率。秋水仙素處理時，藥劑質(zhì)量分數(shù)的大小與處理時間的長短直接影響處理效果[10-11]。一般情況，質(zhì)量分數(shù)高時處理時間短，反之處理時間長。處理方法的不同也會影響處理效果。浸種法處理時，一般會對根系產(chǎn)生毒害作用[9]。本試驗采用浸種法，當(dāng)秋水仙素處理干種子4 d時，隨著秋水仙素質(zhì)量分數(shù)的增加，萌發(fā)率下降。用秋水仙素處理時，要選擇最佳時間對材料進行固定、解離、染色和壓片[12-15]。而何時固定材料是影響試驗成敗的一個主要因素。本試驗中，取胚根時間為10：00—10：30，這段時間正是甘草種子細胞分裂最旺盛時期。秋水仙素處理種子時，選取材料的染色體數(shù)目多少也是試驗成敗的一個因素[7]。本試驗中，選取的材料是脹果甘草種子（2n＝2x＝14），染色體數(shù)目不多，易觀察其有無加倍。秋水仙素誘變育種時還存在嵌合體問題。植物的莖尖分生組織由2種或2種以上遺傳型不同的細胞組成，并由這些細胞共同發(fā)育成完整的植株，稱為嵌合體[16-19]。有研究通過頂芽切割和叢生芽技術(shù)，誘導(dǎo)再生苗來分離秋水仙素誘導(dǎo)羅漢果四倍體中形成的嵌合體。在本試驗中，嵌合率隨著秋水仙素處理質(zhì)量分數(shù)和時間的不同而各異，有研究表明，嵌合率的變化受處理溫度、處理時間、秋水仙素質(zhì)量分數(shù)互作的影響[20-22]，其規(guī)律有待進一步研究。

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Study on Doubling Chomosomes of Licorice Seeds Treated by Colchicine

YANGZhen-hua
（Department ofBiological Engineering，YanglingVocational and Technical College，Yangling712100，China）

The dry seeds and germinating seeds of the licorice were treated with 0.05%,0.20%,0.40%colchicines under low temperature for 4,6,8 d and 1,2,3 d,respectively.To study the influence of different concentration and time of colchicines to the germinatingrates,the chromosome-doubled rates and the embedded rates.The results showed that the highest chromosome-doubled rate was got after germinating seeds were treated with 0.40%colchicines for 3 d,it was up to 66.67%.With time prolonging,the germinating rates had the trend to decline;the embedded rates were different at different concentration of colchicines and treatment time,the highest rate was up to34.62%.

licorice;colchicin;the germinatingseeds;the dryseeds;doublingchromosome

R282

A

1002-2481（2016）03-0294-03

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.03.05

2015-10-28

楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院校內(nèi)研究基金項目（201400020）

楊振華（1981-），男，甘肅白銀人，講師，碩士，主要從事生物技術(shù)應(yīng)用教學(xué)及研究工作。