程 瑤 孟 巖 鄭 巖 金 迪 趙 亮

錦州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 錦州 121000

青蒿琥酯白蛋白納米粒的制備及抗腫瘤活性初步研究

程 瑤 孟 巖 鄭 巖 金 迪 趙 亮*

錦州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 錦州 121000

目的：探討青蒿琥酯白蛋白納米粒的最優(yōu)制備條件及對(duì)腫瘤細(xì)胞的體外抑制情況。方法：以青蒿琥酯包封率為定量指標(biāo)成分，確定牛血清白蛋白質(zhì)量，青蒿琥酯濃度，旋蒸轉(zhuǎn)速等影響因素，并以L9(33)正交實(shí)驗(yàn)安排實(shí)驗(yàn)；根據(jù)結(jié)果篩選出最優(yōu)處方后，考察納米粒的體外釋放情況；MTT法考察納米粒對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的體外抑制率，并與青蒿琥酯原料藥比較。結(jié)果：最佳制備條件為：取500μL濃度為35mg/mL的牛血清白蛋白水溶液，在渦旋的情況下滴加濃度為500μg/mL的青蒿琥酯無(wú)水乙醇溶液，待溶液變成乳白色后，停止滴加，置于旋蒸儀上設(shè)置轉(zhuǎn)速為1000r/min，時(shí)間為30min。根據(jù)此條件制得的納米粒平均包封率82%；體外釋放試驗(yàn)前期有明顯突釋現(xiàn)象，前4h累積釋放度為46%，其后釋放均勻，24h累積釋放度達(dá)92%，具有緩釋作用；其在24h對(duì)細(xì)胞抑制率高于青蒿琥酯組，有較強(qiáng)抑制作用。結(jié)論：在最優(yōu)制備條件下，可增加原料藥的包封率，所制青蒿琥酯納米粒在體外具有較好的緩釋性，對(duì)腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用。

青蒿琥酯；白蛋白納米粒；正交試驗(yàn)；MTT試驗(yàn)

青蒿琥酯(Artesunate，AS)化學(xué)名為二氫青蒿素-1,2-α-琥珀酸單酯，分子式為 C19O8H28，分子量384，是具有倍半萜結(jié)構(gòu)的抗瘧藥青蒿素的衍生物。研究發(fā)現(xiàn)[1-2]，青蒿琥酯除抗瘧外，尚有治療其它寄生蟲病、抗腫瘤等作用。目前，臨床使用的主要有青蒿琥酯片劑、青蒿琥酯的粉針劑。但是青蒿琥酯的口服片劑不能克服肝臟的首過(guò)效應(yīng)，吸收程度較差；粉針劑吸收快、消除也快、生物利用度小。研究通過(guò)納米給藥系統(tǒng)對(duì)青蒿琥酯的現(xiàn)有劑型進(jìn)行改進(jìn)，可以克服 AS 現(xiàn)有劑型存在的缺陷，提高其生物利用度，增加藥物療效。并且對(duì)其抗腫瘤活性進(jìn)行初步研究。牛血清白蛋白(BSA)來(lái)源于血漿，溶解度高而且安全穩(wěn)定又無(wú)毒。筆者以青蒿琥酯為原料藥，以BSA作為載藥材料，采用去溶劑化-交聯(lián)法并通過(guò)正交試驗(yàn)選取最優(yōu)處方，制備出青蒿琥酯BSA納米粒,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器 KQ-300E型超聲機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (Sigma-aldrich)；WH-2微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器廠)；UV-2450紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)；萬(wàn)分之一電子天平(日本島津公司)；恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠)；透析袋(MV：1000-3000，美國(guó)spectrum 公司)；XD-101型倒置顯微鏡(日本 OLYMPUS公司)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；Haier生物安全柜(青島海爾特種電器有限公司)；Thermo CO2培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技有限公司)；TDL-4型低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。1.2 試藥 牛血清白蛋白(BSA，F(xiàn)ractionV SIGMA公司)；無(wú)水乙醇(分析純，天津永晟精細(xì)化工有限公司)；戊二醛50%水溶液(分析純，沈陽(yáng)市華東試劑廠)；氫氧化鈉溶液(分析純，沈陽(yáng)市華東試劑廠)；青蒿琥酯(AS，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；A549細(xì)胞(遼寧醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心)；胎牛血清(沈陽(yáng)鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)；DMEM(高糖培養(yǎng)基，沈陽(yáng)鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)；胰蛋白酶(沈陽(yáng)鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)；PBS(沈陽(yáng)鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)；MTT(沈陽(yáng)鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)；細(xì)胞培養(yǎng)瓶(美國(guó)康寧公司)；96孔板(美國(guó)康寧公司)；所用水為去離子水。

2 方法

2.1 青蒿琥酯標(biāo)準(zhǔn)試液配制 精密稱取干燥至恒重的青蒿琥酯250.0mg置50mL容量瓶中，加0.02%NaOH至刻度，搖勻，制得5mg/mL的青蒿琥酯貯備液。

2.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇[3]準(zhǔn)確移取青蒿琥酯標(biāo)準(zhǔn)試液0.2mL置于10mL容量瓶中,加無(wú)水乙醇至刻度,搖勻。將制得溶液在50℃水浴加熱30min后，以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照，變化波長(zhǎng)在200～600nm，測(cè)定吸光度A。結(jié)果表明在238nm時(shí)，具有最大A值，所以確定238nm為最大吸收。2.3 青蒿琥酯標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[4]精密吸取青蒿琥酯標(biāo)準(zhǔn)試液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mr分別置于10mL容量瓶中，加0.02%NaOH至刻度，搖勻制得溶液，50℃水浴加熱30min。以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照，在238nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，以吸收度A、濃度C繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。并求出回歸方程為:A=0.0431C+0.00067(r2=0.9999)，青蒿琥酯溶液在0.5～3.0mg范圍呈線性關(guān)系。

2.4 青蒿琥酯白蛋白納米粒的制備 將一定質(zhì)量的BSA溶于500μL水中，在渦旋的情況下，緩慢滴加含有青蒿琥酯的無(wú)水乙醇溶液，至出現(xiàn)乳光后，滴加 0.2%戊二醛，繼續(xù)渦旋至混勻，一定時(shí)間后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，真空干燥處理即得青蒿琥酯白蛋白納米粒。

2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在青蒿琥酯白蛋白納米粒制備中的過(guò)程中，影響青蒿琥酯包封率的主要因素為BSA質(zhì)量(A)、青蒿琥酯濃度(B)和旋蒸轉(zhuǎn)速(C)，見(jiàn)表1。采用三因素三水平的正交試驗(yàn)表L9(33)設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案。

表1 青蒿琥酯白蛋白納米粒正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析L9(33)因素水平表

2.7 正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析 根據(jù)直觀分析和方差分析，找到青蒿琥酯白蛋白納米粒制備的最優(yōu)條件。2.8 青蒿琥酯白蛋白納米粒釋放度測(cè)定 在最優(yōu)制備條件下制得青蒿琥酯白蛋白納米粒，然后分別精密稱取載藥白蛋白納米粒凍干粉和原料藥適量，置于分子量1000～3000的透析袋中系好，置于加有 50mLPBS(pH7.4)的具塞錐形瓶中，以100r/min的振蕩頻率于 37℃下水浴振搖，在不同時(shí)間點(diǎn)(0.5、1、2、4、6、10、12、18、24h)取透析液 5mL，超速離心取上清液，同時(shí)補(bǔ)加等量新鮮PBS。通過(guò)紫外吸收進(jìn)行含量分析，計(jì)算出不同時(shí)間點(diǎn)的累計(jì)釋放量。取3份樣品平行實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果繪制累積釋放率時(shí)間曲線，比較青蒿琥酯白蛋白納米粒與原料藥體外釋放行為。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將制備好的BSA納米粒在4℃冰箱中進(jìn)行長(zhǎng)期放置，并于3、6、9個(gè)月進(jìn)行觀察。

2.10 青蒿琥酯白蛋白納米粒體外抗腫瘤活性初步研究

2.10.1 納米粒的細(xì)胞活性檢測(cè)(MTT) 根據(jù)活細(xì)胞可以還原MTT降解成具有紫色的甲瓚結(jié)晶，而凋亡細(xì)胞無(wú)法還原MTT就會(huì)造成兩種細(xì)胞在 490nm處光密度值有差異。

2.10.2 細(xì)胞培養(yǎng) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肺癌細(xì)胞A549 細(xì)胞，先棄去原有培養(yǎng)液，加入2～3mL的PBS清洗，加入2mL的胰蛋白酶，待細(xì)胞變圓后，立即加入0.2mL的血清和2mLDMEM終止消化，吹打混勻移至 10mL圓底離心管，1200r/min離心3min，棄上清液，加PBS清洗一次，加入培養(yǎng)液重懸。按每5×103個(gè)/孔的密度將細(xì)胞懸液接種到 96 孔板中，過(guò)夜培養(yǎng)。

2.10.3 青蒿琥酯BSA納米粒的體外細(xì)胞活力 待96孔板內(nèi)的細(xì)胞貼壁伸展后，將稀釋好的藥物以每孔100μL的體積加入孔中。其中，青蒿琥酯原料藥和青蒿琥酯BSA納米粒中青蒿琥酯的濃度分別為5、10、20、30、40ug/mL，并設(shè)5個(gè)平行孔。加入藥物后放于培養(yǎng)箱。在24h時(shí)在每孔中加入20μL的MTT溶液和80μL的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)4h，隨后棄去孔中液體，加入100μL二甲基亞砜，置于搖床上15min，使紫色結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀在 490nm處進(jìn)行光密度值的檢測(cè)。為了排除BSA納米粒載體材料對(duì)細(xì)胞活力的干擾，筆者使用與青蒿琥酯BSA納米粒同等量的空白BSA納米粒進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 正交試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)表1進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果。見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析 為了確定顯著性因子，對(duì)表2進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 方差分析結(jié)果

直觀分析和方差分析結(jié)果表明，三種因素對(duì)青蒿琥酯白蛋白納米粒的包封率影響大小依次為A>C>B。A、B和C因素對(duì)青蒿琥酯白蛋白納米粒的制備均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，由此得出制備青蒿琥酯白蛋白納米粒的最佳條件為A2B1C3，即取500μL濃度為35mg/mL的牛血清白蛋白水溶液，在渦旋的情況下滴加濃度為500μg/mL的青蒿琥酯無(wú)水乙醇溶液，待溶液變成乳白色后，停止滴加，置于旋蒸儀上設(shè)置轉(zhuǎn)速為1000r/min，時(shí)間為30min。3.3 青蒿琥酯BSA納米粒的體外釋放 由圖1可知，青蒿琥酯原料藥在4h，累計(jì)釋放率為(91.0±2.1)%，基本釋放完全。而青蒿琥酯BSA納米粒的體外釋放體現(xiàn)出兩相形式，前 4 h藥物累積釋放率為(46.5±3.7)%，屬于快速釋放；4 h 后釋藥平緩，24 h 累積釋放率為(92.3±6.6)%，為緩慢低速釋放，說(shuō)明納米粒具有明顯的緩釋作用。

3.4 青蒿琥酯BSA納米粒穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 青蒿琥酯BSA納米粒在第3、6個(gè)月時(shí)納米粒沉降，手搖即可分散；9個(gè)月時(shí)納米粒沉降，渦旋即可分散。綜上所述白蛋白納米粒穩(wěn)定性尚可。

3.5 BSA納米粒的體外抗腫瘤活性 載體材料為牛血清白蛋白，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)證明24h內(nèi)BSA納米粒對(duì)A549細(xì)胞幾乎無(wú)影響，充分證明了其具有無(wú)毒性的特點(diǎn)。由圖2可知，青蒿琥酯BSA納米粒對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率明顯高于青蒿琥酯原料藥。

4 討論

研究主要考察了牛血清白蛋白質(zhì)量，青蒿琥酯濃度，旋蒸轉(zhuǎn)速及時(shí)間這3個(gè)因素對(duì)納米粒包封率的影響，采用正交試驗(yàn)和方差分析篩選出了制備青蒿琥酯白蛋白納米粒的最佳工藝條件。 隨后對(duì)青蒿琥酯白蛋白納米粒的釋放性能進(jìn)行了檢測(cè)，從整個(gè)釋放過(guò)程可以看出，白蛋白納米粒能夠使藥物長(zhǎng)時(shí)間維持在穩(wěn)態(tài)濃度，能夠起到控制藥物緩慢釋放作用，使藥物在體內(nèi)作用時(shí)間更長(zhǎng)。隨后又通過(guò)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)得出納米粒穩(wěn)定性較好，通過(guò)檢測(cè)其在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，空白白蛋白納米粒對(duì)細(xì)胞無(wú)任何毒性，因?yàn)榍噍镧グ椎鞍准{米粒比青蒿琥酯原料藥的攝取效果好，藥物被納米粒載體包裹后由于內(nèi)吞作用容易透過(guò)細(xì)胞膜，開始時(shí)青蒿琥酯濃度較高，對(duì)細(xì)胞有顯著作用，但隨著時(shí)間的增加，青蒿琥酯逐漸被代謝消失，而青蒿琥酯經(jīng)白蛋白包裹成納米粒后，則始終保持一定的濃度釋放，可以防止藥物被迅速代謝，延長(zhǎng)作用時(shí)間。所以青蒿琥酯納米粒組在24h時(shí)細(xì)胞抑制率大于青蒿琥酯原料藥。由于納米粒本身具有被腫瘤細(xì)胞吞噬的作用，所以載藥納米粒對(duì)細(xì)胞的殺傷力要大于原藥。說(shuō)明青蒿琥酯白蛋白納米粒有更明顯的抗腫瘤活性。

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(編輯：陶希睿)

2016-10-13

遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(NO：20140160008)。

程瑤，女，漢族，本科，研究方向?yàn)橹兴幮轮苿┭芯俊?/p>

趙亮(1979-)，男，漢族，副教授，碩士，研究方向?yàn)橹兴幮轮苿┭芯?。E-mail:liangzhao79@163.com

R285.5

A

1007-8517(2016)24-0033-04