袁吉祥，張亮，魏述軍

血管損傷對新生內(nèi)膜增生的影響

袁吉祥，張亮，魏述軍

目的：研究血管損傷對新生內(nèi)膜增生及核轉(zhuǎn)錄因子κb （NF-κb）、組織因子（TF）、內(nèi)皮素-1（ET-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶3（MMP-3）的影響。

血管損傷；新生內(nèi)膜；增生

(Chinese Circulation Journal, 2016,31:1210.)

盡管藥物洗脫支架的出現(xiàn)減少了支架內(nèi)再狹窄（ISR）的發(fā)生，但ISR仍高達10%～15%。ISR是影響冠狀動脈介入手術(shù)效果的重要因素，極大地限制了經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）的獲益，特別是糖尿病或多支病變的冠心病患者[1]。從病理生理學(xué)角度看，ISR是機體對血管損傷的病理性修復(fù)反應(yīng)，介入過程所導(dǎo)致的血管損傷和結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致新生內(nèi)膜增生，新生內(nèi)膜過度增生導(dǎo)致ISR。但是，目前血管損傷導(dǎo)致新生內(nèi)膜增生的病理生理機制還不明確，內(nèi)彈力膜在血管損傷中的作用還未揭示。本研究通過球囊擴張并拉傷兔子腹主動脈建立血管損傷模型，分析血管損傷對新生內(nèi)膜增生及核轉(zhuǎn)錄因子κb （NF-κb）、組織因子（TF）、內(nèi)皮素-1（ET-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶3（MMP-3）影響，探討血管損傷導(dǎo)致新生內(nèi)膜增生的病理生理機制，為防治ISR提供生物學(xué)靶點。

1 材料與方法

實驗動物： 4～6個月齡雄性新西蘭大耳白兔32只，體重2.0～2.5 kg，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

血管損傷模型的建立：分離右側(cè)股動脈，直視下穿刺并置入5F鞘管，經(jīng)導(dǎo)絲引入后擴張球囊（3.5 mm×15 mm），以12 atm（1 atm=101.325 kPa）的壓力擴張并拉傷腹主動脈建立血管損傷模型[2]。

病理學(xué)切片的制作：術(shù)后28 d用注射空氣法處死兔子，開腹暴露腹主動脈，剝離拉傷的血管段，生理鹽水沖洗后固定于10%甲醛溶液。24 h后血管段常規(guī)石蠟包埋，間隔相同距離于血管段25%、50%、75%分位切片3次（切片厚度4 μm），行蘇木素伊紅（HE）染色，NF-κb免疫組化染色后光鏡下觀察。切片經(jīng)鉛、鈾染色后透射電鏡下觀察。使用計算機圖像分析軟件測量血管標(biāo)本新生內(nèi)膜厚度，分析確定血管壁損傷積分。

根據(jù)內(nèi)彈力膜損傷的情況血管壁損傷分級標(biāo)準如下：1級，內(nèi)皮損傷，內(nèi)彈力膜無明顯損傷；2級，內(nèi)彈力膜輕度損傷；3級，內(nèi)彈力膜明顯損傷，未累及中膜；4級，內(nèi)彈力膜破損，累及中膜；5級，內(nèi)彈力膜破損，累及中膜、外彈力膜及外膜[3]。

血清檢驗：損傷術(shù)后1 min經(jīng)股動脈鞘管采血，4周后經(jīng)心臟采血，存放于-20℃冰箱。用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定血清TF、ET-1和MMP-3含量。

統(tǒng)計分析：采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，正態(tài)分布計量資料用描述，相關(guān)性分析采用Pearson法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

兔腹主動脈損傷情況（圖1）：術(shù)后4周，32只兔中30只順利完成實驗，共獲得30條受損血管段及相應(yīng)切片。受損血管直徑為（3.40±0.16）mm，球囊/血管直徑比為1.12±0.06。光鏡下觀察內(nèi)彈力膜，正常時為一條平緩的波浪線，損傷后表現(xiàn)為鋸齒狀的曲線，損傷越嚴重，鋸齒越密集且不規(guī)則。

透射電鏡下觀察新生內(nèi)膜（圖2）：可見新生內(nèi)膜顯著增厚，損傷的內(nèi)彈力膜呈現(xiàn)迂曲的波浪狀，平滑肌細胞穿過內(nèi)彈力膜微孔及斷裂口向新生內(nèi)膜遷移，新生內(nèi)膜增生，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體以及溶酶體等細胞器顯著增多。

圖1 血管壁損傷分級情況（×100）

圖2 透射電鏡下觀察新生內(nèi)膜（上排圖×500，下排圖×3000）

NF-κb免疫組化顯示（圖3）：NF-κb主要在新生內(nèi)膜中表達，血管損傷積分與NF-κb陽性細胞百分率呈正相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.916（P＜0.05）。

血管損傷積分與新生內(nèi)膜厚度、TF、ET-1及MMP-3的相關(guān)性分析（圖4）： 血管損傷積分與新生內(nèi)膜厚度之間的最優(yōu)擬合曲線是“S”形的三次曲線，曲線中間的部分增幅較大，它對應(yīng)的橫坐標(biāo)是3，也就是內(nèi)彈力膜明顯損傷的部分。相關(guān)分析結(jié)果顯示：血管損傷積分與術(shù)后1 min TF，術(shù)后1 min和4周 后 的ET-1，術(shù)后1 min和4周后的MMP-3均呈正相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù)分別為0.925、0.957、0.947、0.914和0.940（ P均＜0.05）。

圖3 核轉(zhuǎn)錄因子-κb 免疫組化二甲基聯(lián)苯胺染色（DAB染色，×200）

圖4 血管損傷積分與新生內(nèi)膜厚度、TF、ET-1、MMP-3的相關(guān)性分析

3 討論

新生內(nèi)膜形成和增生導(dǎo)致ISR是冠狀動脈支架置入后一個重要的病理生理事件，血管損傷或者結(jié)構(gòu)破壞是導(dǎo)致新生內(nèi)膜增生的重要原因[3]。但是PCI術(shù)中血管損傷是不可避免的，因為隨著膨脹的球囊或者支架把動脈粥樣硬化斑塊向外擠壓，內(nèi)膜可能會撕裂，內(nèi)彈力膜張力會不斷增大，當(dāng)張力超過其代償范圍時內(nèi)彈力膜就會損傷甚至斷裂，從而導(dǎo)致血管彈性降低。內(nèi)彈力膜是由交叉排列的、密集的彈力纖維組成的，損傷或者斷裂后無法修復(fù)。為了維持正常的血管張力，機體會通過新生內(nèi)膜增生來代償。在血管伴有鈣化、支架口徑偏大、擴張壓力過大等情況下，更容易出現(xiàn)內(nèi)彈力膜的損傷。本實驗采用了曲線擬合的方法來體現(xiàn)血管損傷與新生內(nèi)膜厚度之間的關(guān)系，最優(yōu)擬合曲線是“S”形的三次曲線，表明血管壁各結(jié)構(gòu)中內(nèi)彈力膜是反映血管損傷的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。

目前認為，血管損傷后新生內(nèi)膜增生的機制主要是：內(nèi)皮下組織暴露于血液后導(dǎo)致血小板在損傷局部的黏附、聚積，炎性細胞浸潤并釋放趨化、黏附、生長因子，刺激血管平滑肌細胞（VSMCs）通過內(nèi)彈力膜遷移至內(nèi)皮下，轉(zhuǎn)型為新生內(nèi)膜并不斷增生，導(dǎo)致血管負性重構(gòu)[4]。內(nèi)彈力膜是阻礙上述過程發(fā)生的唯一屏障。內(nèi)彈力膜損傷后，變形擴大的內(nèi)彈力膜微孔或者斷裂的內(nèi)彈力膜使VSMCs移行相對容易，因而加速了新生內(nèi)膜的增厚。

TF是一種脂蛋白復(fù)合物，含有大量磷脂，是導(dǎo)致凝血系統(tǒng)激活的重要因素。在正常情況下TF不存在于循環(huán)中或不與循環(huán)血液接觸，只有當(dāng)血管壁的完整性遭到破壞時，中膜膠原纖維暴露于血液，TF才會被組織細胞釋放于循環(huán)血液，通過外源性凝血途徑啟動凝血反應(yīng)[5]。凝血反應(yīng)導(dǎo)致血小板聚集和炎癥細胞浸潤并釋放趨化、黏附、生長因子，刺激中膜血管平滑肌細胞遷移至內(nèi)皮下轉(zhuǎn)型為新生內(nèi)膜?？梢奣F是血管損傷后導(dǎo)致新生內(nèi)膜增生的始動因子。本實驗4周后血清TF未能檢測到，提示暴露的中膜膠原纖維已經(jīng)被新生內(nèi)膜所封閉。經(jīng)皮冠狀動脈介入治療時球囊或支架擴張擠壓可引起內(nèi)膜損傷或者撕裂，內(nèi)皮下組織暴露，血管及血液細胞立即釋放TF，引起局部急性血栓形成，血栓可能被纖溶酶溶解或者逐漸被新生內(nèi)膜機化。支架貼壁不良也容易導(dǎo)致血栓形成。血栓如果未造成急性缺血癥狀，可能會因為晚期機化而造成ISR。因此，支架內(nèi)再狹窄也可能是支架內(nèi)血栓機化的結(jié)果[6]。

NF-κb是一類特殊的蛋白質(zhì)，具有和基因啟動子區(qū)的固定核苷酸序列結(jié)合而啟動基因轉(zhuǎn)錄的功能，參與調(diào)控許多與動脈粥樣硬化有關(guān)的靶基因的表達，在細胞增殖、分化中起重要作用[7]。本研究中免疫組化提示NF-κb主要在新生內(nèi)膜中表達，提示血管損傷后細胞增生主要發(fā)生在新生內(nèi)膜，另一方面提示內(nèi)彈力膜的屏障作用。本實驗中血管損傷積分與新生內(nèi)膜NF-κb陽性細胞率正相關(guān)提示血管損傷可激活新生內(nèi)膜NF-κb途徑，繼而引發(fā)損傷修復(fù)相關(guān)靶基因的表達和活性因子的釋放，因而刺激新生內(nèi)膜不斷增生。

ET-1是一種由21個氨基酸殘基組成的活性多肽，不僅存在于血管內(nèi)皮，也廣泛存在于各種組織和細胞中，是一種內(nèi)源性長效血管收縮調(diào)節(jié)因子，同時也是一種強效持久的促有絲分裂劑，可促進細胞增殖[8]。本研究血管損傷術(shù)后1 min ET-1釋放可能與內(nèi)皮受到擠壓損傷有關(guān)，4周后ET-1持續(xù)表達可能與新生內(nèi)膜不斷增生有關(guān)。血管損傷當(dāng)時，由于內(nèi)皮細胞受到擠壓刺激，立即釋放內(nèi)皮素產(chǎn)生強烈的縮血管反應(yīng)，同時NF-κb被激活與靶基因結(jié)合持續(xù)表達內(nèi)皮素。隨著內(nèi)皮細胞的壞死和剝脫，VSMC逐漸遷移至內(nèi)皮下轉(zhuǎn)型為新生內(nèi)膜。新生內(nèi)膜持續(xù)表達內(nèi)皮素可能是導(dǎo)致新生內(nèi)膜增生的原因之一。

MMPs主要存在于溶酶體中，幾乎能降解細胞外基質(zhì)中的各種蛋白成分。MMP-3屬于基質(zhì)分解素，其作用底物廣泛，包括層粘連蛋白、纖連蛋白、彈性蛋白、蛋白聚糖等[9]。血管損傷后，膠原纖維暴露導(dǎo)致凝血系統(tǒng)激活，后者引發(fā)纖溶酶系統(tǒng)激活，繼而引起MMP-3釋放。MMP-3降解細胞外基質(zhì)，從而有利于VSMC的遷移和新生內(nèi)膜的增生，最后導(dǎo)致血管負性重構(gòu)。本實驗通過透射電鏡觀察到血管損傷后新生內(nèi)膜內(nèi)溶酶體增多，可能是NF-κb活性增高導(dǎo)致MMP-3轉(zhuǎn)錄合成增多的表現(xiàn)。

總之，本實驗發(fā)現(xiàn)血管損傷可以通過激活NF-κb途徑，促進ET-1和MMP-3表達，從而促使新生內(nèi)膜不斷增生，導(dǎo)致血管負性重構(gòu)。TF是血管損傷后導(dǎo)致新生內(nèi)膜增生的始動因子。內(nèi)彈力膜是反映血管損傷的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，是阻礙新生內(nèi)膜增生的惟一屏障。因此內(nèi)彈力膜損傷可以作為預(yù)測ISR的一項指標(biāo)[10]。減少ISR的關(guān)鍵是PCI操作需細致謹慎，減少血管損傷，同時要求支架大小合適、緊密貼壁。血管內(nèi)超聲或者光學(xué)相干斷層掃描有助于判斷血管直徑和支架貼壁情況，從而有助于減少ISR[11]。另外，本研究為防治ISR提供了生物學(xué)靶點，下調(diào)NF-κb 的活性、拮抗或者阻斷ET-1和MMP-3可能是防治ISR的新途徑。

本研究的不足之處：首先本研究結(jié)果是從兔腹主動脈血管損傷中獲得的，因此可能與人冠狀動脈的實際病理改變存在差別；第二，本研究中血管損傷模型是在非病變血管基礎(chǔ)上建立的，與PCI術(shù)中的血管損傷存在一定差距。

致謝：感謝寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗中心的王潔、張琰老師，寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院病理科的馬愛玲、郭雅琪老師。

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Impact of Vascular Injury on Neointimal Hyperplasia in Experimental Rabbit Model

YUAN Ji-Xiang, ZHANG Liang, WEI Shu-jun.
Department of Cardiology, People’s Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region, Yinchuan (750001), Ningxia, China Corresponding Author: WEI Shu-jun, Email: weishujun1968@163.com

Objective: To study the impact of vascular injury on neointimal hyperplasia and the expressions of nuclear transcription factor-κb (NF-κb), tissue factor (TF), endothelin-1 (ET-1) and matrix metalloproteinase-3 (MMP-3) in experimental rabbit model.Methods:A total of 32 male New Zealand big-eared white rabbits were used to establish vascular injury model by femoral artery puncture, balloon was sent to abdominal aorta via the wire followed by balloon dilatation to strain abdominal aorta. Blood sample was taken from femoral artery sheath 1 minute after operation, and the rabbits were killed at 4 weeks after operation, meanwhile blood sample was taken from the heart. Injured arteries were isolated, fxed and embedded; slices were stained by HE, basic fuchsine and NF-κb immunohistochemical methods for light microscope observation; slices were also stained by lead and uranium for transmission electron microscope observation. Neointimal thickness was measured by computer analysis, vascular injury integral and NF-κb positive cell rate were determined, blood levels of TF, ET-1 and MMP-3 wereexamined by ELISA. The relationship between vascular injury integral and the contents of TF, ET-1, MMP-3 and NF-κb positive cell rate were analyzed by SPSS statistical software.Results: The optimal ftting curve between vascular injury integral and neointimal thickness was S-shaped cubic curve. NF-κb was mainly expressed in neointima, vascular injury integral was positively related to NF-κb positive cell percentage, Pearson correlation coefcient was 0.916, P＜0.05. Vascular injury integral was positively related to the contents of 1 min post-operative TF; 1 min and 4 weeks post-operative ET-1; 1 min and 4 weeks post-operative MMP-3; Pearson correlation coefcients were 0.925, 0.957, 0.947, 0.914 and 0.940 respectively, all P＜0.05.Conclusion: Vascular injury may activate NF-κb pathway, promote ET-1 and MMP-3 expression, therefore accelerating neointimal hyperplasia, leading negative vascular remodeling, TF was an initiating factor for neointimal hyperplasia. Internal elastic lamina was the key structure reflecting vascular injury, it is the only barrier hindering neointimal hyperplasia in experimental rabbit model.

Vascular injury; Neointima; Hyperplasia

2016-04-20）

（編輯：王寶茹）

寧夏自然科學(xué)基金（NZ14174）

750001 銀川市，寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院（西北民族大學(xué)第一附屬醫(yī)院） 心內(nèi)科

袁吉祥 副主任醫(yī)師 碩士 研究方向為冠心病基礎(chǔ)與介入技術(shù) Email： 34232762@qq.com 通訊作者：魏述軍Email：weishujun1968@163.com

R54

A

1000-3614（2016）12-1210-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2016.12.014

方法：對32只雄性新西蘭大耳白兔進行穿刺股動脈，經(jīng)導(dǎo)絲送入球囊，球囊擴張并拉傷腹主動脈建立血管損傷模型。損傷術(shù)后1 min經(jīng)股動脈鞘管采血，4周后經(jīng)心臟采血，處死兔子，分離損傷血管，進行固定、包埋，切片行蘇木素伊紅（HE）染色、堿性品紅染色及NF-κb免疫組化染色后光鏡下觀察。切片經(jīng)鉛、鈾染色后透射電鏡下觀察。使用計算機圖像分析軟件測量新生內(nèi)膜厚度，分析確定血管壁損傷積分及NF-κb陽性細胞率，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定血清TF、ET-1和MMP-3含量，利用SPSS統(tǒng)計軟件對血管損傷積分與血清TF、ET-1、MMP-3含量及NF-κb陽性細胞率進行相關(guān)性分析。

結(jié)果：血管損傷積分與新生內(nèi)膜厚度之間的最優(yōu)擬合曲線是“S”形的三次曲線。NF-κb主要在新生內(nèi)膜中表達，血管損傷積分與NF-κb陽性細胞百分率呈正相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.916（P＜0.05)。血管損傷積分與術(shù)后1 min TF，術(shù)后1 min及4周ET-1，術(shù)后1 min及4周MMP-3含量均呈正相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù)分別為0.925、0.957、0.947、0.914和0.940（P均＜0.05)。

結(jié)論：血管損傷可以通過激活NF-κb途徑，促進ET-1和MMP-3表達，從而促使新生內(nèi)膜不斷增生，導(dǎo)致血管負性重構(gòu)。TF是血管損傷后導(dǎo)致新生內(nèi)膜增生的始動因子。內(nèi)彈力膜是反映血管損傷的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，是阻礙新生內(nèi)膜增生的唯一屏障。