王玉瑤，王玉璇，翟翔，劉銘，解軍

心肌細胞中微小核糖核酸 let-7c對肌營養(yǎng)素基因表達的調(diào)控作用

王玉瑤，王玉璇，翟翔，劉銘，解軍

目的：探討心肌細胞中微小核糖核酸（miR）let-7c（miR-let-7c）對肌營養(yǎng)素基因表達是否具有調(diào)控作用以及可能的作用機制。

微小核糖核酸；肌營養(yǎng)素；核轉(zhuǎn)錄因子-κB

(Chinese Circulation Journal, 2016,31:1215.)

微小核糖核酸（miR）通過降解靶mRNA或抑制靶mRNA的翻譯來調(diào)控基因表達[1]。最近研究發(fā)現(xiàn)miR-let-7家族在心臟組織中高表達，參與許多重要的心臟功能調(diào)控[2]，miR-let-7c可能在心肌肥厚中發(fā)揮重要作用，但其具體作用靶標和機制仍不清楚[3]。肌營養(yǎng)素（myotrophin, MTPN）是從原發(fā)性高血壓大鼠的心臟中分離得到的低分子量蛋白，經(jīng)研究證實肌營養(yǎng)素參與心臟肥厚的起始環(huán)節(jié)，并在心臟肥厚向心力衰竭的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[4-7]。生物信息學分析表明，肌營養(yǎng)素mRNA 的3'非編碼區(qū)（3'-UTR）可能受miR-let-7c調(diào)控，但尚少有切實實驗證據(jù)的支持。我們擬構(gòu)建攜帶有肌營養(yǎng)素mRNA 3'-UTR的重組質(zhì)粒載體，與miR-let-7c前體共同轉(zhuǎn)入Hela細胞，采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析miR-let-7c對肌營養(yǎng)素表達的調(diào)控作用。進一步通過轉(zhuǎn)染大鼠心肌細胞H9c2，研究miR-let-7c上調(diào)后對肌營養(yǎng)素基因在心肌細胞中表達的影響，以及對肥厚關(guān)鍵信號分子核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）活性的調(diào)控作用，研究結(jié)果有助于闡明miR-let-7c在心肌肥厚中的作用機制。

1 材料和方法

實驗材料和試劑：胰蛋白酶購自Sigma公司（美國）；胎牛血清、達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司（美國）；miR-let-7c前體及抑制劑、pMIRREPORTTMmiRNA表達報告載體購自Ambion公司（美國）；Taqman 實時定量聚合酶鏈式反應（PCR）相關(guān)試劑購自ABI公司（美國）；肌營養(yǎng)素抗體、NF-κB p65抗體購自Santa Cruz公司（美國）。

構(gòu)建熒光素酶報告系統(tǒng)：合成含肌營養(yǎng)素3'-UTR關(guān)鍵區(qū)域的核酸片段，序列為： 5'-TATTAAGACCAAG TCATGCAATAATTGAATGTACCTCAAATTTTTA-3'， 經(jīng)PCR，HindⅢ和SpeⅠ雙酶切，將上述序列克隆入pMIR-REPORT熒光素酶報告基因表達載體，重組載體經(jīng)測序驗證后命名為重組熒光素酶報告基因表達載體（pMIR-MTPN）。Hela細胞培養(yǎng)在含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)染前1天給細胞換液至無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，每孔接種1×105細胞于24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔200 ng 重組載體DNA pMIR-MTPN和miR-let-7c前體或者陰性對照（終濃度為50 nmol/L）與Lipofectamine 2000試劑混合后分別對Hela細胞進行共轉(zhuǎn)染，分為3個實驗組（n=3）：（1）pMIR-MTPN單純載體組；（2）pMIR-MTPN +miR前體陰性對照組；（3）pMIRMTPN + miR-let-7c前體組。各組細胞培養(yǎng)48 h后，用磷酸鹽（PBS）緩沖液洗滌三遍，加入被動裂解緩沖液（PLB），細胞裂解液檢測并計算標準熒光素酶活性（熒光素酶活性檢測儀，美國Turner 公司）。

miR轉(zhuǎn)染大鼠H9c2心肌細胞：大鼠H9c2細胞株購自中國科學院細胞庫，于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，5% 二氧化碳（CO2），37℃條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染實驗前，將終濃度為50 nM miR-let-7c前體或抑制劑100 μl DMEM與加入5 μl Lipofectamine 2000試劑100 μl DMEM配成混合液體，H9c2細胞的6孔板中的細胞中加入1.8 ml無血清DMEM培養(yǎng)液后，加入該混合液體，37℃孵育6 h，去掉轉(zhuǎn)染液，換2.5 ml DMEM培養(yǎng)48 h，進行后續(xù)實驗。實驗分為4個組（n=3）：（1）miR陰性對照組；（2）miR-let-7c前體組；（3）抑制物陰性對照組；（4） miR-let-7c抑制物組。

實時定量PCR：提取轉(zhuǎn)染后的H9c2細胞總RNA，每份標保本取10 ng RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋至30 μl后進行實時定量PCR檢測，反應體系：0.75 μl 20×探針，2 μl稀釋后逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，7.5 μl 2×Taqman Universal PCR Master Mix Ⅱ，4.75 μl無核酸酶水。反應條件：95℃，10 min；95℃，15 s，60℃，60 s，40個循環(huán)。使用U6作為內(nèi)參基因。采用2-ΔΔCt方法計算分析各組miR-let-7c mRNA的相對表達量。

蛋白質(zhì)提取及Western blot：裂解液裂解轉(zhuǎn)染后的H9c2細胞，提取細胞總蛋白或分離提取細胞核蛋白，BCA法[8]測定樣品蛋白濃度。等量（50 μg）蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙稀酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，分別加入肌營養(yǎng)素一抗（稀釋倍數(shù)1：1 000）、NF-κB p65以及β-微管蛋白或β-肌動蛋白內(nèi)參一抗（稀釋倍數(shù)1：1 000），于4℃孵育過夜，洗膜后，加辣根過氧化物酶標記二抗（稀釋倍數(shù)1：5 000），室溫孵育2 h。X光片顯色。使用ImageJ軟件分析各條帶與內(nèi)參條帶的吸光度值之比。

統(tǒng)計學方法：所有實驗均至少重復三次，結(jié)果取平均值，數(shù)據(jù)表達為均數(shù)±標準差，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用Student’s t檢驗，統(tǒng)計學處理使用SPSS 13.0軟件進行，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義（雙側(cè)）。

2 結(jié)果

2.1miR-let-7c作用于肌營養(yǎng)素mRNA 靶向關(guān)系驗證

雙熒光素酶報告系統(tǒng)實驗結(jié)果表明（圖1），在Hela細胞中，與pMIR-MTPN+miR前體陰性對照組相比，pMIR-MTPN+ miR-let-7c前體組熒光素酶活性顯著降低，下降了41%[（59.30±9.90）% vs（98.10±15.10）%，P＜0.05]，表明miR-let-7c能夠直接作用于肌營養(yǎng)素mRNA 3'-UTR區(qū)域。

圖1 熒光素酶活性檢測miR-let-7c與肌營養(yǎng)素mRNA 3'-UTR區(qū)域相互作用（n=3）

2.2miR-let-7c轉(zhuǎn)染大鼠H9c2心肌細胞效果

采用Taqman實時定量PCR法檢測 miR轉(zhuǎn)染效果，結(jié)果表明（圖2），miR-let-7c前體轉(zhuǎn)染H9c2心肌細胞后，與miR陰性對照組相比，miR-let-7c前體組miR-let-7c表達水平顯著升高；而miR-let-7c抑制物轉(zhuǎn)染后，與抑制物陰性對照組相比，miR-let-7c抑制物組miR-let-7c表達水平則顯著降低（0.42±0.11） 倍。差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖2 Taqman實時定量PCR法檢測miR-let-7c前體及抑制物轉(zhuǎn)染H9c2心肌細胞后miR-let-7c表達水平（n=3）

2.3miR-let-7c對肌營養(yǎng)素蛋白表達具有抑制作用

Western blot法檢測miR-let-7c轉(zhuǎn)染H9c2心肌細胞后肌營養(yǎng)素蛋白表達，結(jié)果表明（圖3），miR-let-7c前體組與miR陰性對照組相比，肌營養(yǎng)素蛋白表達水平顯著降低（0.28±0.05 vs 0.90±0.09）；而miR-let-7c抑制物轉(zhuǎn)染H9c2心肌細胞后，miR-let-7c抑制物組與抑制物陰性對照組比較肌營養(yǎng)素蛋白表達水平顯著升高（1.14±0.09 vs 0.44±0.09）。差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖3 蛋白免疫印跡法檢測miR-let-7c對大鼠心肌細胞中肌營養(yǎng)素蛋白表達水平的影響（n=3）

圖4 蛋白免疫印跡法檢測miR-let-7c對大鼠心肌細胞核中NF-κB p65蛋白表達的影響（n=3）

2.4miR-let-7c 轉(zhuǎn)染心肌細胞后NF-κB蛋白水平變化

Western blot法檢測miR-let-7c轉(zhuǎn)染H9c2心肌細胞后細胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白表達，結(jié)果表明（圖4），miR-let-7c前體組與miR陰性對照組相比，NF-κB p65蛋白表達水平顯著降低（0.25±0.06 vs 0.75±0.07）；而miR-let-7c抑制物組與抑制物陰性對照組比較，NF-κB p65蛋白表達水平顯著升高（1.09±0.05 vs 0.71±0.06）。差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討論

心肌肥厚是影響心血管疾病發(fā)病率和病死率的獨立危險因素。心肌肥厚過程受到多種因素刺激和多種信號通路調(diào)控，尋找參與調(diào)控心肌肥厚的關(guān)鍵因子，揭示心肌肥厚的分子機制一直以來都是研究熱點[9]。近年來，隨著對miR功能研究的不斷深入，人們已經(jīng)明確證實了一些miR參與心肌肥厚的調(diào)控通路[10-12]，但仍有許多miR在心肌肥厚中的調(diào)控機制尚待揭示。miR-let-7是最早被發(fā)現(xiàn)的miR之一，在各物種間高度保守。之前大量研究多關(guān)注于miR-let-7在腫瘤抑制方面的作用[1,13]。近年來，一系列研究表明，miR-let-7家族還參與心血管系統(tǒng)分化、發(fā)育、疾病等諸多生理病理學過程的調(diào)控，其中miR-let-7c可能參與了心肌肥厚過程，但其靶標及具體作用機制目前仍不清楚[2,3]。

miR的5’端第2～7或2～8個核苷酸序列稱為“種子序列”，這一區(qū)域具有高度的保守性，與之互補的靶序列在不同物種中通常也具有高度的保守性，種子序列對于miR識別特異性的靶序列是必需的[14]。肌營養(yǎng)素是蛋白分子量為12 kD的錨定重復序列蛋白，在哺乳動物的組織中廣泛表達[15]。一系列基礎及臨床實驗研究均表明，肌營養(yǎng)素是心肌肥厚和心力衰竭的起始因子[4-7]。我們前期通過文獻調(diào)研和生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)肌營養(yǎng)素基因3'-UTR區(qū)域存在與miR-let-7c種子序列識別和結(jié)合的靶序列，克隆該段序列，并進一步通過分子及細胞生物學實驗對miR-let-7c能否調(diào)控肌營養(yǎng)素基因表達進行了研究，熒光素酶報告系統(tǒng)實驗結(jié)果證實了miR-let-7c能夠直接作用于肌營養(yǎng)素基因3'-UTR相應序列，從而對肌營養(yǎng)素基因表達產(chǎn)生抑制作用。進一步通過在心肌細胞中過表達miR-let-7c前體，發(fā)現(xiàn)miR-let-7c能夠降低肌營養(yǎng)素在心肌細胞中的蛋白表達水平，從而證實了肌營養(yǎng)素是miR-let-7c在心肌肥厚過程中的調(diào)控靶蛋白之一。此外，研究表明，NF-κB信號通路是肌營養(yǎng)素發(fā)揮心肌肥厚調(diào)控的關(guān)鍵分子通路[5]，NF-κB通路活化時，NF-κB p65轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)，從而行使一系列調(diào)控作用。本研究結(jié)果表明，miR-let-7c上調(diào)后NF-κB蛋白水平降低，這可能是其參與心肌肥厚的重要分子機制之一。

綜上所述，本研究在分子、細胞水平上對miR-let-7c與肌營養(yǎng)素基因3'-UTR位點的相互作用以及肥厚關(guān)鍵分子NF-κB的影響進行了驗證，結(jié)果表明，miR-let-7c可能通過調(diào)節(jié)肌營養(yǎng)素基因參與心肌肥厚過程，且該過程涉及NF-κB信號通路，這一結(jié)果有助于闡明miR-let-7c在心肌肥厚中的具體分子機制。

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Regulative Effect of microRNA let-7c on Myotrophin Gene Expression in Rat’s H9c2 Cardiac Myocytes

WANG Yu-yao, WANG Yu-xuan, ZHAI Xiang, LIU Ming, XIE Jun.
Department of Biochemistry and Molecular Biology, Shanxi Medical University, Taiyuan (030001), Shanxi, China

XIE Jun, Email: xiejun1968@126.com

Objective: To explore weather microRNA let-7c (miR-let-7c) could regulate myotrophin gene expression in rat’s H9c2 cardiac myocytes with possible mechanisms.Methods: Recombinant plasmid carrying 3′ untranslated region (3′-UTR) of myotrophin and miRNA precursor of let-7c was co-transfected into Hela cells to construct the luciferase reporter system in order to measure luciferase activity. Rat’s H9c2 cardiac myocytes were cultured. The let-7c gene expression was detected by Taqman probe-based real-time PCR after let-7c miRNA precursor or let-7c miRNA inhibitor transfection respectively; protein expressions of myotrophin and nuclear factorκB (NF-κB) were examined by Western blot analysis.Results: Luciferase activity examination indicated that compared with recombinant luciferase gene expression carrier (pMIR-MTPN)+miR precursor negative control group, pMIR-MTPN+miR-let-7c miRNA precursor group showed reduced luciferase activity (59.30±9.90) % vs (98.10±15.10) %. Western blot analysis presented that compared with miR negative control group, miR-let-7c precursor group had decreased protein expressions of myotrophin (0.28±0.05) vs (0.90±0.09) and NF-κB (0.25±0.06) vs (0.75±0.07); in contrast, compared with Negative inhibitor group, miR-let-7c inhibitor group had increased protein expressions of myotrophin (1.14±0.09) vs (0.44±0.09) and NF-κB (1.09±0.05) vs (0.71±0.06), all P＜0.05.Conclusion: miR-let-7c could inhibit myotrophin expression via acting on its 3′-UTR domain and may also infuence NF-κB signaling pathway in rat’s H9c2 cardiac myocytes.

microRNA; Myotrophin; Nuclear factor-κB

2016-06-20）

（編輯；曹洪紅）

國家自然科學基金（81500364）；山西省基礎研究項目（2015021187）；山西省高等學?？萍紕?chuàng)新項目（2015149）

030001 山西省太原市，山西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院 生物化學與分子生物學教研室

王玉瑤 講師 博士 主要從事心血管疾病相關(guān)基因功能研究 Email：wyybio@163.com 通訊作者：解軍 Email： xiejun1968@126.com.

R541

A

1000-3614（2016）12-1215-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2016. 12.015

方法：首先構(gòu)建攜帶肌營養(yǎng)素基因3'非編碼區(qū)（3'-UTR）片段的熒光素酶報告基因載體，與miR-let-7c前體共轉(zhuǎn)染Hela細胞，雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測熒光素酶活性以驗證miR-let-7c與肌營養(yǎng)素基因的靶向調(diào)控關(guān)系。進而培養(yǎng)大鼠心肌細胞H9c2，Taqman實時定量聚合酶鏈式反應（PCR）法檢測miR轉(zhuǎn)染效果，蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測miR-let-7c及miR-let-7c抑制物轉(zhuǎn)染心肌細胞后肌營養(yǎng)素蛋白表達，以及心肌肥厚相關(guān)信號通路分子核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）的活性變化。

結(jié)果：熒光素酶活性實驗結(jié)果表明，與重組熒光素酶報告基因表達載體（pMIR-MTPN）+ miR前體陰性對照組相比，pMIR-MTPN+ miR-let-7c前體組熒光素酶活性顯著降低[（59.30±9.90）% vs （ 98.10±15.10）%]。Western blot結(jié)果表明，miR-let-7c前體組與miR陰性對照組相比，肌營養(yǎng)素蛋白表達水平顯著降低[（0.28±0.05） vs （0.90±0.09）]，此外，NF-κB蛋白水平顯著降低[（0.25±0.06） vs （ 0.75±0.07）]；相反，miR-let-7c抑制物組與抑制物陰性對照組相比，肌營養(yǎng)素蛋白表達水平顯著升高[（1.14±0.09） vs（0.44±0.09）]，同時，NF-κB蛋白水平也顯著升高[（1.09±0.05）vs（0.71±0.06）]，差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05）。

結(jié)論：miR-let-7c能夠通過作用于3'UTR區(qū)域，抑制肌營養(yǎng)素基因表達，并影響心肌肥厚關(guān)鍵信號通路分子NF-κB的活性。