李 曉，李紅艷，王 穎，劉天紅，吳志宏，孫元芹

(山東省海洋生物研究院，山東青島 266100)

響應(yīng)面法優(yōu)化狹鱈魚魚皮酸溶性膠原蛋白質(zhì)的提取工藝*

李 曉，李紅艷，王 穎**，劉天紅，吳志宏，孫元芹

(山東省海洋生物研究院，山東青島 266100)

【目的】優(yōu)化狹鱈魚(Theragra chalcogramma)魚皮中酸溶性膠原蛋白質(zhì)的提取工藝，為實(shí)際生產(chǎn)提供工藝數(shù)據(jù)和理論依據(jù)?！痉椒ā吭谝宜釢舛?、提取時(shí)間和料液比的單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以酸溶性膠原蛋白質(zhì)提取率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，建立提取率的二次多項(xiàng)式回歸模型，考察3個(gè)因素對提取率的影響?！窘Y(jié)果】對酸溶性膠原蛋白質(zhì)提取率的影響為料液比>提取時(shí)間>乙酸濃度；交互項(xiàng)中“料液比-提取時(shí)間”項(xiàng)對提取率影響極其顯著，“料液比-乙酸濃度”項(xiàng)對提取率影響顯著，其他交互項(xiàng)對提取率影響不顯著；通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)合回歸模型進(jìn)行數(shù)學(xué)分析，得到提取狹鱈魚魚皮酸溶性膠原蛋白質(zhì)的最佳工藝參數(shù):乙酸濃度0.5 mol/L、提取時(shí)間40 min、料液比1∶9。在優(yōu)化參數(shù)條件下，酸溶性膠原蛋白質(zhì)提取率的理論預(yù)測值為20.53%，實(shí)測值為20.10%；試驗(yàn)提取得到的膠原蛋白電泳圖譜較為清晰，無雜條帶出現(xiàn)?！窘Y(jié)論】該回歸模型合理可行，提取的產(chǎn)物基本保持了膠原蛋白質(zhì)的原有結(jié)構(gòu)。

狹鱈魚 魚皮 酸溶性膠原蛋白質(zhì) 響應(yīng)面法

0 引言

【研究意義】膠原是一類重要的結(jié)構(gòu)蛋白，廣泛分布于動(dòng)物的骨骼、皮膚、結(jié)締組織和軟骨等部位[1]，膠原的水解產(chǎn)物被稱為膠原蛋白質(zhì)，變性產(chǎn)物俗稱明膠，明膠、膠原蛋白質(zhì)統(tǒng)稱為膠原蛋白質(zhì)[2]。膠原分子呈現(xiàn)三螺旋構(gòu)型，其非螺旋部位的范圍和分布決定了膠原蛋白質(zhì)的不同類型，而不同類型的膠原蛋白質(zhì)具有不同的生物活性，使其在美容、食品和醫(yī)藥等不同領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[3-5]。近年來，膠原蛋白質(zhì)的市場需求量逐年增加，而陸地畜源膠原蛋白質(zhì)主要局限于豬皮及牛皮，由于瘋牛病、口蹄疫等安全性原因及宗教原因，世界各國都在尋找應(yīng)用更加廣泛的水產(chǎn)膠原蛋白質(zhì)源[6]。狹鱈魚(Theragra chalcogramma)屬于鱈形目(Anacanthini)，鱈魚科(Gadidae)，狹鱈屬(Theragra)[7]，目前多用于加工凍魚片，加工過程中產(chǎn)生的大量魚皮、魚骨等往往作為飼料原料處理，利用率較低，又由于這些副產(chǎn)物膠原蛋白質(zhì)含量高且安全，是較好的水產(chǎn)膠原蛋白質(zhì)來源，如果能有效利用該資源，可產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Yan等[8]發(fā)現(xiàn)狹鱈魚片膠原蛋白屬于Ⅰ型膠原蛋白，在228 nm波長處有最大吸收值，譚洪亮等[9]研究表明金槍魚(Katsuwonus pelamis)魚骨膠原蛋白肽具有良好的抗氧化活性，可以用于相關(guān)功能食品、藥品或食品添加劑，鄧曉龍等[10]研究表明秘魯魷魚(Dosidicus gigas)真皮膠原蛋白質(zhì)最大吸收波長在228 nm處，鹽濃度大于2.0%時(shí)，相對溶解度迅速下降至4.23%?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】響應(yīng)面法設(shè)計(jì)是回歸試驗(yàn)設(shè)計(jì)的一種，既可以用于分析實(shí)驗(yàn)中各因子間的交互影響，又可以用來建立準(zhǔn)確合理的數(shù)學(xué)模型，更好地處理數(shù)據(jù)[11]。本研究以狹鱈魚魚皮為原料，利用乙酸提取酸溶性膠原蛋白質(zhì)，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件，通過Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定多因素系統(tǒng)的最優(yōu)條件?！緮M解決的關(guān)鍵問題】在評價(jià)各因素對響應(yīng)值的影響及其交互作用的同時(shí)，優(yōu)化酸溶性膠原蛋白質(zhì)的提取，獲得最佳條件，為實(shí)際生產(chǎn)提供工藝數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

狹鱈魚魚皮由青島奧海生微生態(tài)生物有限公司提供，洗凈，控水，4℃冷藏備用；Premixed Protein Marker(Board)為TaKaRa產(chǎn)品(大連寶生生物)；其他試劑均為分析純。UV2450 型分光光度計(jì)(日本島津)；Avanti J-26XP系列高效離心機(jī)(美國貝克曼)；EPS-600電泳儀(上海天能)。

1.2 方法

1.2.1 預(yù)處理

洗凈的魚皮加入0.1 mol/L的NaOH溶液浸泡24 h除去雜質(zhì)蛋白和色素，洗至中性，勻漿，備用。

1.2.2 酸溶性膠原蛋白質(zhì)制備

取預(yù)處理的魚皮漿，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的料液比、乙酸濃度和時(shí)間浸提，經(jīng)4℃、11 400×g離心30 min，上清液逐漸添加研細(xì)的NaCl，控制加入NaCl的質(zhì)量，至溶液中最終濃度為2.6 mol/L，呈絮狀物析出的沉淀即為膠原蛋白質(zhì)。4℃、11 400×g離心30 min，沉淀物以0.5 mol/L 的乙酸溶液復(fù)溶，依次以0.1 mol/L的乙酸透析1 d，蒸餾水透析2 d，透析后的液體經(jīng)冷凍干燥，即可得到酸溶性膠原蛋白質(zhì)[12]。

1.2.3 膠原蛋白質(zhì)提取率測定

羥脯氨酸(Hydroxyproline，Hyp)是膠原蛋白的特征性氨基酸，其含量乘以換算系數(shù)即為提取液中膠原蛋白質(zhì)含量[13]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[14]：配制羥脯氨酸儲(chǔ)備液(1 mg/mL)，之后稀釋儲(chǔ)備液得到標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 μg/mL)，取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL，分別以0.001 mol/L的HCl補(bǔ)足至1 mL，加入2 mL氯胺T溶液，混勻，室溫靜置20 min，之后加入2 mL高氯酸溶液，混勻室溫靜置5 min，再加入對二甲基氨基苯甲醛溶液2 mL，混勻，60℃加熱20 min顯色，流水沖冷，以空白液調(diào)零，在560 nm處測定各自吸光度(A)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測定：按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的料液比、濃度和時(shí)間，經(jīng)乙酸4℃浸提離心的樣品上清液1 mL于安瓿瓶中，加入1 mL 6 mol/L的HCl，130℃水解3 h，上清液按照文獻(xiàn)[14]方法測定羥脯氨酸含量:

式中，m表示狹鱈魚魚皮中羥脯氨酸的質(zhì)量(g)；C表示提取液中羥脯氨酸的濃度(g/mL)；V表示提取液的體積(mL)。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取魚皮漿20 g，經(jīng)過0.1 mol/L NaOH預(yù)處理，選取乙酸濃度、提取時(shí)間和料液比(W/V)為單因素，以提取液中羥脯氨酸含量為提取率指標(biāo)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

(1)乙酸濃度 固定料液比為1∶10，4℃提取24 h，乙酸濃度分別為0.2 mol/L、0.3 mol/L、0.4 mol/L、0.5 mol/L、0.6 mol/L、0.7 mol/L和0.8 mol/L，確定最佳乙酸濃度。

(2)提取時(shí)間 固定料液比為1∶10，以0.5 mol/L乙酸浸提，4℃提取，提取時(shí)間分別為6 h、12 h、24 h、48 h和96 h，確定最佳提取時(shí)間。

(3)料液比 以0.5 mol/L乙酸浸提，4℃下提取48 h，料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶50，確定最佳料液比。

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

采用響應(yīng)面法中的Box-Behnken設(shè)計(jì)[15-16]，以酸溶性膠原蛋白質(zhì)的提取率(Y)為響應(yīng)值，選取乙酸濃度(A)、提取時(shí)間(B)和料液比(C)做三因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用Design Expert 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立二次響應(yīng)面模型，尋找最佳的提取工藝條件。

1.2.6 膠原蛋白質(zhì)的鑒定

采用SDS-PAGE電泳鑒定膠原蛋白質(zhì)，取1.2.2節(jié)制備的酸溶性膠原蛋白質(zhì)冷凍干燥樣品溶于0.5 mol/L的乙酸溶液(濃度1～2 mg/mL)，以NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至中性。分離膠8%、濃縮膠5%，上樣量20 μL，采用直流恒壓電源(電壓200 V)電泳40 min，考馬斯亮藍(lán)R-250染色20 min后脫色，觀察染色條帶[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 乙酸濃度的影響

在乙酸0.2～0.4 mol/L濃度區(qū)間內(nèi)，隨乙酸濃度的增加，酸溶性膠原蛋白質(zhì)的提取率也升高；在0.4～0.8 mol/L濃度區(qū)間內(nèi)，隨乙酸濃度的增加，提取率下降；當(dāng)乙酸濃度為0.4 mol/L時(shí)，提取率最大(圖1)，因此最佳乙酸濃度為0.4 mol/L。

圖1 乙酸濃度對酸溶性膠原蛋白質(zhì)提取率的影響

Fig.1 Effect of concentration on the extraction yield

2.1.2 提取時(shí)間的影響

隨提取時(shí)間的延長，酸溶性膠原蛋白質(zhì)提取率增加，48 h內(nèi)提取率增加較快，超過48 h，提取率增加不顯著(圖2)，因此48 h為最佳提取時(shí)間。

圖2 提取時(shí)間對酸溶性膠原蛋白質(zhì)提取率的影響

Fig.2 Effect of time on the extraction yield

2.1.3 料液比的影響

隨料液比增加，酸溶性膠原蛋白質(zhì)提取率逐漸增加，當(dāng)料液比達(dá)到1∶10時(shí)，提取率最大，之后料液比增加，提取率不再增加(圖3)，因此確定最佳料液比為1∶10。

圖3 料液比對酸溶性膠原蛋白質(zhì)提取率的影響

Fig.3 Effect of solid-to-liquid on the extraction yield

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 模型及顯著性檢驗(yàn)

采用中心組合設(shè)計(jì)，得到17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)析因點(diǎn)，5個(gè)零點(diǎn)(估計(jì)誤差)。析因點(diǎn)為自變量取值在A、B、C所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)(表1)。

表1 酸溶性膠原蛋白質(zhì)提取工藝Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Table 1 Box-Behnken design and result of extration process of acid-soluble collagen

序號(hào)Testnumber因素FactorABCY(%)10.40400.1013.6720.50400.1020.1030.40500.1016.5740.50500.1015.2350.40450.0817.7460.50450.0817.9870.40450.1213.3780.50450.1218.0190.45400.0817.32100.45500.0816.76110.45400.1018.21120.45500.1215.30130.45450.1019.38140.45450.1020.48150.45450.1019.33160.45450.1018.76170.45450.1019.33

為檢驗(yàn)方程的可靠性，對方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2。

表2 提取工藝回歸模型方差分析

Table 2 Variance analysis for the regression model

方差來源Source平方和Sumofsquares自由度Degreeoffreedom均方MeanofaqureP顯著性Significance模型Model68.0420197.5602230.0009**A12.42511112.425110.0018*B3.699213.69920.0320*C3.01351313.0135130.0468*AB15.09323115.093230.0010**AC4.8414.840.0185*BC1.38062511.3806250.1470A210.68484110.684840.0027*B29.10471719.1047170.0041*C24.98418514.9841850.0174*殘差Residual3.63389570.519128失擬項(xiàng)Lackoffit2.06337530.6877920.2948純誤差Pureerror1.5705240.39263總和Total71.6759116

注：P≤0.05，模型或考察因素有顯著影響，用*表示；P≤0.01，模型或考察因素有極其顯著影響，用**表示

Note：P≤0.05 indicate significant difference(*),P≤0.01 indicate extremely significant difference(**)

根據(jù)表2結(jié)果，對數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到回歸方程為

Y=19.46+1.25*A-0.68*B-0.61*C-1.94*A*B+1.10*A*C-0.59*B*C-1.59*A2-1.47*2-1.09*C2,

A、B、C均為編碼值。

對回歸方程進(jìn)行顯著性分析，可知失擬項(xiàng)P不顯著(0.294 8>0.05)，表明該回歸模型的預(yù)測值與實(shí)際值擬合較好。模型P<0.01，表明該模型極其顯著，實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確可行，所選的二次回歸模型用于模擬提取過程的三因素三水平有效。在所選的各因素水平范圍內(nèi)，對結(jié)果的影響排序?yàn)榱弦罕?提取時(shí)間>乙酸濃度(由P值可知)。模型R2=94.93%(>90%)，說明各因素存在線性相關(guān)，擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小。因此，可以采用該模型分析和預(yù)測不同條件下的提取率。

方程中A、B、C對提取率的影響均顯著，二次項(xiàng)影響也顯著，交互項(xiàng)AB作用極其顯著，AC作用顯著，說明乙酸濃度、提取時(shí)間和料液比對提取率的影響不是簡單的線性關(guān)系，二次項(xiàng)和交互項(xiàng)對提取率也有影響。

2.2.2 響應(yīng)面分析

根據(jù)三維立體圖對任何兩個(gè)因素的交互作用及各因素對響應(yīng)值的影響進(jìn)行分析，確定最佳因素水平(圖4)。響應(yīng)面三維圖等高線的形狀可反應(yīng)交互項(xiàng)影響的強(qiáng)弱，橢圓形表明兩者交互作用顯著，越接近圓形表示兩因素的交互作用越弱[18]。等高線呈橢圓形，表明提取時(shí)間與乙酸濃度、料液比與乙酸濃度、料液比與提取時(shí)間交互作用均比較明顯(圖4)。

圖4 兩因素交互作用對酸溶性膠原蛋白質(zhì)提取率的影響

Fig.4 Response surface plot for interactive effects on the extraction efficiency

2.2.3 提取工藝最佳條件

優(yōu)化分析后，確定最佳的乙酸提取狹鱈魚魚皮酸溶性膠原蛋白質(zhì)的工藝參數(shù)為乙酸濃度0.5 mol/L，提取時(shí)間40 min，料液比1∶9，在此參數(shù)條件下，提取率的理論預(yù)測值為20.53%，實(shí)際測得提取率為(20.10±1.25)%，表明該模型合理可行。

2.3 膠原蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

狹鱈魚魚皮的酸溶性膠原蛋白至少由兩條α鏈(α1和α2)組成，β鏈含量較高，并含有少量的γ鏈(圖5)。

1：蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品；2：酸溶性膠原蛋白質(zhì)

1:Premixed protein marker;2:Acid-soluble collagen

圖5 酸溶性膠原蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳圖

Fig.5 SDS-PAGE patterns of ASC

3 討論

3.1 酸溶性膠原蛋白質(zhì)的提取率

本研究中狹鱈魚魚皮酸溶性膠原蛋白質(zhì)的提取率為20.10%，要高于趙海英等[19]的提取率(19.3%)，與其他原料來源的研究提取率也不盡相同，這可能與原料種類、溫度、羥脯氨酸換算系數(shù)、液料比、pH值及時(shí)間等因素有關(guān)[20-22]，對本研究結(jié)果來說，提取溫度及換算系數(shù)影響較大。水產(chǎn)膠原一般在25℃左右即開始變性,因此，為保證生理活性，膠原的提取及前處理都在低于10℃下的環(huán)境下進(jìn)行[22]。本試驗(yàn)在4℃下進(jìn)行，得到的酸溶性膠原蛋白質(zhì)實(shí)際上應(yīng)該是膠原，趙海英等[19]對鱈魚皮膠原蛋白的提取溫度為37℃，產(chǎn)物應(yīng)為膠原蛋白，因此，兩者提取率不同。而李莉等[22]在提取大鯢膠原蛋白質(zhì)時(shí)，空白試驗(yàn)(未添加酶)提取率為28.88%，添加胃蛋白酶后提取率可達(dá)到66.99%，說明酶的添加能顯著提高提取率，但此情況下產(chǎn)物不再是單一膠原，而成為膠原、膠原蛋白質(zhì)及明膠的混合物，高于本研究結(jié)果。朱文學(xué)等[14]采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取黃河鯉魚酸溶性膠原蛋白質(zhì)的提取率為15.89%，低于本研究結(jié)果，可能是由于原料種類存在差異；李八方等[23]在4℃下提取胡子鯰魚酸溶性膠原蛋白質(zhì)的提取率為20.32%，溫度與本實(shí)驗(yàn)一致，膠原蛋白質(zhì)的提取率也與本實(shí)驗(yàn)較為接近。另外，羥脯氨酸與膠原蛋白之間不同的換算系數(shù)也會(huì)導(dǎo)致各研究中提取率有所不同。來自不同原料、不同組織、不同部位的膠原蛋白中羥脯氨酸的含量互不相同，因而兩者之間的換算系數(shù)會(huì)因?yàn)樵?、組織、部位等因素而不能采用單一數(shù)值。一般情況下，陸生動(dòng)物的常用換算系數(shù)為7.1，而水生動(dòng)物采用11.1或14.1。也有報(bào)道采用其他系數(shù)的，例如Nalinanon等[24]采用7.7作為換算系數(shù)，而張帥等[25]采用14.7。Nalinanon等[24]研究鯛魚的膠原蛋白提取率僅為9.86%,遠(yuǎn)低于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，而張帥等[25]研究羅非魚的膠原蛋白提取率為30.30%,要高于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這就造成了換算系數(shù)不一致使得提取率難以比較，較低的換算系數(shù)會(huì)導(dǎo)致最終提取率數(shù)值偏低，而較高的換算系數(shù)提取率數(shù)值會(huì)偏高。

3.2 酸溶性膠原蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)

本研究中α1和α2所測相對分子質(zhì)量約為110 000和105 000，稍小于羅非魚[26](α1和α2分別為125 000和116 000)、草魚(α1和α2都大于116 000)等[26,4]淡水魚膠原；β相對分子質(zhì)量約為200 000；γ相對分子質(zhì)量為220 000。膠原蛋白質(zhì)作為結(jié)構(gòu)蛋白，其中的β鏈?zhǔn)莾蓷lα鏈的二聚體，γ鏈為結(jié)構(gòu)比較完整的α鏈三聚體[27]。

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(責(zé)任編輯：陸 雁)

Optimization of Extraction Process of Acid-soluble Collagen from the Walleye Pollock(Theragrachalcogramma)by Respone Surface Methodolgy

LI Xiao，LI Hongyan，WANG Ying，LIU Tianhong，WU Zhihong，SUN Yuanqin

(Marine Biology Institute of Shandong Province，Qingdao，Shandong，266100，China)

【Objective】Walleye pollock (Theragra chalcogramma) is one of the commercial fish species in China.The skin of pollock is usually dumped without utilization,which would cause environment pollution and resource waste.The main component of pollock skin is collagen.For effective use of the dumped skin to prepare collagen,it is necessary to obtain fudamental information about the pollock skin collagen.【Methods】In this research,on the basis of one-factor-at-a-time experiments,a Box-behnken design experiment was used to evaluate the optimal extraction conditions of acid-soluble collagen from the walleye pollock skin.The concentration of acid,solid-to-liquid ratio and extraction time were the three test factors and the extraction rate of collagen was the target parameter.Response surface methodology was used to describe the influence of the three factors on the extraction rate of collagen and aquadratic polynomial regression model was developed to optimize the extraction conditions.【Results】The order of the factors influence was:Solid-to-liquid ratio > extraction time> concentration of acid.The interaction between the solid-to-liquid ratio and extraction time had a extremely significant effect on the collagen extraction rate,interaction between the solid-to-liquid ratio and concentration of acid had a significant effect on the collagen extraction rate，while other interactions had no significant effect.Through the experiment combined with regression model，the specific parameters were:The concentration of acid was 0.5 mol/L,the extraction time was 40 min，and the solid-to-liquid ratio was 1∶9.Under these conditions,the extraction rate was 20.10%,which was similar to the theoretical value (20.53%) predicted by theregression model.The SDS-PAGE pattern was clear.【Conclusion】The regression model was reasonable and feasible.The collagen was of good purity and maintained its original structure.

walleye pollock，fishskin，acid-soluble collagen(ASC)，response surface methodology

http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1075.N.20161202.1602.004.html

2016-09-30

李 曉(1985-)，女，助理研究員，主要從事水產(chǎn)品加工與安全研究，E-mail：lixiaohappy9@163.com。

*國家海洋局公益性項(xiàng)目(201205027-3)資助。

S985.1

A

1002-7378(2016)04-0250-08

網(wǎng)絡(luò)優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間:2016-12-02 【DOI】10.13657/j.cnki.gxkxyxb.20161202.002

**通信作者：王 穎(1971-)，女，研究員，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖及水產(chǎn)品加工研究，E-mail:food_rc@sina.com。