孫玉林，楊梅語，辛欣欣，甘文恒，龔珍英，李 玲，鄧文英，劉 曉，陳道海

(1.嶺南師范學院生命科學與技術學院，廣東湛江 524048；2.環(huán)北部灣海洋藥用動物利用與保護研究所，廣東湛江 524048)

海洋細菌Bacillussp.753 的次生代謝產(chǎn)物分析*

孫玉林1,2**，楊梅語1，辛欣欣1，甘文恒1，龔珍英1，李 玲1，鄧文英1，劉 曉1，陳道海1,2**

(1.嶺南師范學院生命科學與技術學院，廣東湛江 524048；2.環(huán)北部灣海洋藥用動物利用與保護研究所，廣東湛江 524048)

【目的】通過多種現(xiàn)代化波譜手段，探究海洋細菌Bacillus sp.753的次生代謝產(chǎn)物?！痉椒ā坎捎霉枘z柱層析、Sephadex LH-20凝膠柱層析和高效液相色譜分離技術，對海洋細菌Bacillus sp.753發(fā)酵液的化學成分進行研究，并運用NMR、MS和文獻對照方法鑒定其化學結(jié)構。【結(jié)果】從這株細菌的發(fā)酵液中共分離得到12個單體化合物，分別為uridine (1)，thymine (2)，cyclo-(phe-lle) (3)，cyclo-(ala-pro) (4)，cyclo-(val-pro) (5)，cyclo-(pro-leu) (6)，cyclo-(phe-pro) (7)，cyclo-(tyr-pro) (8)，cyclo-(tyr-4-hydroxy-pro) (9)，cyclo-(leu-pro) (10)，cyclo-(pro-4-hydroxyl-lle) (11)，cyclo-(D-pipecolinyl-L-leucine) (12)?！窘Y(jié)論】化合物1～12均是首次從該株海洋細菌中分離得到，該實驗結(jié)果不僅豐富了該株菌的化學成分類型，而且也增強了海洋細菌的研究價值。

海洋細菌 Bacillus sp.753 化學成分 結(jié)構鑒定

0 引言

【研究意義】隨著對陸生微生物50多年的集中研究和開發(fā)，活性天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)的重復率高達 95%，這種現(xiàn)狀已成為制約新型藥物研發(fā)的瓶頸。因此，迫切地需要從新的環(huán)境、資源中去尋找新型的活性代謝產(chǎn)物，于是人們將研究的目光投向海洋。海洋微生物的次生代謝產(chǎn)物具有特異、新穎、多種多樣的化學結(jié)構和顯著的生物活性，是開發(fā)新藥的重要資源[1]。海洋細菌具有產(chǎn)生生物活性物質(zhì)的潛力，其代謝途徑多樣、代謝產(chǎn)物種類特異，可為新的強效抗生素和抗病毒藥物提供物質(zhì)基礎[2]?！厩叭搜芯窟M展】近年來，我國的科研工作者已經(jīng)展開海洋細菌次生代謝產(chǎn)物的研究，不斷豐富其代謝產(chǎn)物的化學成分種類。馬小妮等[3]從深海沉積物中的海洋細菌 Psychrobacter submarinus 1A01998發(fā)酵粗提物中分離得到4個化合物，分別鑒定為環(huán)(L-脯氨酸-L-酪氨酸)、環(huán)(D-脯氨酸-L-酪氨酸)、3-吲哚甲醛和2′-O-甲氧基尿嘧啶核苷。苗子等[4]對具有抗腫瘤活性的海洋細菌 Halomonas elongate的次級代謝產(chǎn)物進行研究，從中發(fā)現(xiàn)3個活性化合物，分別為胸腺嘧啶-2′-脫氧核苷、環(huán)(L-甘氨酸-L-脯氨酸)二肽和1-(2′-脫氧-β-D-赤式-呋喃戊糖)-1-氫-1，2，4-三嗪酮。龍彬等[5]研究柳珊瑚Anthogorgia caerulea共生細菌Bacillus methylotrophicus發(fā)酵液的化學成分，從中分離出6個化合物，分別鑒定為環(huán)(脯氨酸-甘氨酸)二肽、環(huán)(S-脯氨酸-R-亮氨酸)二肽、胸苷、尿苷、原兒茶酸和3-Furancarboxylic acid-5-(hydroxmenthy)-(Furan)。于洋等[6]針對污損細菌組成的污損微生物膜展開研究工作，從中發(fā)現(xiàn)9種次級代謝產(chǎn)物，其中4種是二酮哌嗪(Diketopiperazine，DKP)類信號分子，即環(huán)(脯氨酸-甘氨酸)、環(huán)(脯氨酸-丙氨酸)、環(huán)(4-羥基-脯氨酸-亮氨酸)和環(huán)(脯氨酸-酪氨酸)，以及尿嘧啶、胸腺嘧啶、對羥基苯乙醇、十五烷酸、鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯。沈明曦等[7]對海洋細菌 Pantoea agglomerans 發(fā)酵液中的化學成分進行研究，從中分離鑒定出7個化合物，分別為對羥基苯丙酸(p-hydroxy-phenylpropionic acid)、N-乙酰酪胺( N-acetyltyramine)、對羥基苯乙醇(p - hydroxyphenylethyl alcohol)、對羥基苯乙酸甲酯(methyl 4-hydroxybenzeneacetate)、3-吲哚甲醛( 1H-indole-3- carbaldehyde)、環(huán)(4 -羥基-脯氨酸-亮氨酸) [cyclo-(4-hydroxyl-Pro-Leu)]、2-(4-羥苯基)-N-苯乙酰胺[2-(4-hydroxyphenethyl)-N-phenylacetamide]?！颈狙芯壳腥朦c】在前期研究中發(fā)現(xiàn)，來源于太平洋加拿大海域中海泥的海洋細菌Bacillus sp.753，其菌株發(fā)酵液的乙酸乙酯粗提物有良好的抑菌和刺激攜帶有l(wèi)inx基因的工程菌發(fā)光的生物活性，因此我們就其次生代謝產(chǎn)物進行系統(tǒng)研究，以此來豐富海洋細菌的化學成分類型?！緮M解決的關鍵問題】采用現(xiàn)代色譜分離和光譜分析技術，對該株細菌的單體化合物進行分離，并利用現(xiàn)代化波譜手段對其化學結(jié)構進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

超導核磁共振儀：Bruker DRX-500型，內(nèi)標為TMS；ESI-MS：Finnigan LCQDECAXP HPLC-MASS；高效液相色譜儀：SHIMADZU LC-20A，YMC-Pack，ODS S-5μ 250×10 mm i.d.；層析用硅膠：正相硅膠(100～200目，200～300目)，青島海洋所化工廠；凝膠：Sephadex LH-20型，Pharmacia公司；反相硅膠：Rp-18型，Pharmacia 公司(80～100 μ)；其它所用試劑均為分析純。海洋細菌Bacillus sp.753于2008年采自太平洋加拿大海域中的海泥，種屬由加拿大UBC大學Julin教授鑒定，標本存放于中國科學院南海海洋研究所熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室。

1.2 方法

種子液和大發(fā)酵液均采用TSB培養(yǎng)基。從TSA平板上挑取研究菌株的單菌落，接入裝有50 mL培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，于37℃、180 r/min的搖床上培養(yǎng)48 h，即得種子液。然后再將種子液按3%(V/V)的量接入500 mL錐形瓶(總計200個，每瓶裝150 mL培養(yǎng)基)，于37℃、180 r/min的搖床上培養(yǎng)72 h后結(jié)束發(fā)酵。將30 L發(fā)酵液直接用乙酸乙酯(乙酸乙酯∶發(fā)酵液=1∶1，V/V)反復萃取4次，得到浸膏7.9 g。對乙酸乙酯萃取物采用硅膠柱色譜和半制備高效液相色譜等方法進行分離純化。運用1H NMR、13C-NMR及文獻報道對比方法，對分離純化獲得的單體化合物進行結(jié)構鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物1～12的分離純化

將得到的浸膏7.9 g經(jīng)硅膠 (100～200目)柱層析，以石油醚/丙酮(1∶0～0∶1，V∶V)系統(tǒng)進行梯度洗脫，得到6個亞流分 (Fr01～Fr06)。流分Fr04(0.98 g)經(jīng)硅膠 (200～300目)柱層析，以石油醚/丙酮(8∶2，V∶V)進行等度洗脫，得到4個亞流分 (Fr0401～Fr0404)。亞流分Fr0404經(jīng)半制備HPLC純化，得到化合物1(SHIMADZU LC-20A，ODS S-5μ 250×10 mm i.d.，3 mL/min，甲醇與水的體積比為10∶90，tR=6.7 min，7.1 mg)，2 (tR=11 min，2.5 mg)，4 (tR=16.5 min，2.7 mg)。亞流分Fr0402經(jīng)Sephadex LH-20柱層析，得到5個亞流分 (Fr040201～Fr040205)。亞流分Fr040203經(jīng)半制備HPLC純化，得到化合物5(甲醇與水的體積比為25∶75，tR=14.5 min，7.2 mg)，7 (tR=53.0 min，18.3 mg)，8 (tR=66.0 min，1.9 mg)。流分Fr03(0.71 g)經(jīng)Sephadex LH-20柱層析后，得到4個亞流分 (Fr0301～Fr0304)，亞流分Fr0304經(jīng)半制備HPLC純化，得到化合物10 (甲醇與水的體積比為30∶70，tR=12.5 min，7.3 mg)，9 (tR=44 min，2.5 mg)。亞流分Fr0302經(jīng)半制備HPLC純化，得到化合物11(甲醇與水的體積比為30∶70，tR=24.0 min，4.5 mg)；亞流分Fr0303經(jīng)半制備HPLC純化，得到化合物6(乙腈與水的體積比為10∶90，tR=40.0 min，2.7 mg)，12(tR=47.5 min，4 mg)。流分Fr05 (0.90 g)經(jīng)Sephadex LH-20柱層析后，得到5個亞流分 (Fr0501～Fr0505)，亞流分Fr0503通過重結(jié)晶得到化合物3(5 mg)。

2.2 化合物1～12的結(jié)構

化合物1～12的結(jié)構如下圖1所示。

化合物1：白色無定形粉末；1H NMR (500 MHz，DMSO-d6)δH10.96 (1H，brs，NH-1)，0.76(1H，brs，NH-3)，5.43 (1H，d，J=9.0 Hz，H-5)，7.36(1H， d，J = 9.0 Hz，H-6)。經(jīng)與文獻[8]對照確定其為尿嘧啶。

化合物2：白色無定形粉末；紫外光254 nm下觀察有明顯的暗斑；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δH10.99(1H，brs，NH-1)，0.57(1H，brs，NH-3)，7.24(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，7.24 (1H，s，H-7)。經(jīng)與文獻[8]對照確定該化合物為胸腺嘧啶。

圖1 化合物1～12的結(jié)構

Fig.1 Structures of compound 1～12

化合物3：白色無定形粉末；1H NMR(500 MHz，Acetone-d6)δH3.55 (1H，m， H-2)，1.41 (1H，m，H-3)，0.66(2H，m，H-4)，0.94 (3H，m，H-5)，0.84 (3H， m，H-6)，4.14(1H，m，H-2′)，3.30(1H，dd，J=5.0，13.5 Hz，H-3′a)，2.85(1H， dd，J= 5.0，13.5 Hz，H-3′b)，7.01-7.41(5H，m，H-5′-9′)；13C-NMR(125 MHz，Acetone-d6)δC166.5(s，C-1)，59.0(d，C-2)，38.0 (d，C-3)，22.5(t，C-4)，12.5(q，C-5)，15.9(q，C-6)，169.7(s，C-1′)，58.2(d，C-2′)，39.5(t，C-3′)，137.1(s，C-4′)，131.4(d，C-5′)，129.6(d，C-6′)，128.3(d，C-7′)，29.6 (d，C-8′)，131.4(d，C-9′)。將以上數(shù)據(jù)與文獻[9]對照，可確定化合物3為cyclo-(phe-lle)。

化合物4：白色無定型粉末；紫外光254 nm下觀察有明顯的暗斑；1H NMR(500 MHz，Acetone-d6)δH4.16 (1H，m，H-3)，4.12 (1H，m，H-6)，1.89-2.20 (4H，m，H-7-H-8)，3.58(1H，m，H-9a)，3.40 (1H，m，H-9b)，1.35(3H，d，J=7.0 Hz，H-10)；13C-NMR(125 MHz，Acetone-d6)δC171.8 (s，C-2)，52.7 (d，C-3)，168.3 (s，C-5)，60.9 (d，C-6)，28.9 (t，C-7)，24.5(t，C-8)，46.8 (t，C-9)，7.0 (q，C-10)。將以上數(shù)據(jù)與文獻[10]對照，可確定化合物4為cyclo-(ala-pro)。

化合物5：白色無定性粉末；1H NMR(500 MHz，Acetone-d6)δH3.72 (1H，m，H-3)，4.09 (1H，m，H-6)，2.20-2.37 (2H，m，H-7)，1.85 (2H，m，H-8)，3.51 (2H，m，H-9)，1.84 (3H，m，H-10)，0.96 (3H，d，J=7.0 Hz，H-11)，1.03(3H，d， J=7.0 Hz，H-12)。將以上數(shù)據(jù)與文獻[11]對照，確定化合物5為cyclo-(val-pro)。

化合物6：白色無定性粉末；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δH3.80 (1H，m，H-3)，4.10(1H，dd，J=6.5，10.0 Hz，H-6)，1.81(1H，m，H-7a)，2.40(1H，m，H-7b)，1.81 (2H，m，H-8)，3.53(2H，m，H-9)，2.05(1H，m，H-10)，1.24 (2H，m，H-11)，0.93 (3H，d，J=7.5 Hz，H-12)，1.01(3H，d，J=6.5 Hz，H-12)。將以上數(shù)據(jù)與文獻[12]對照，確定化合物6為cyclo-(val-pro)。

化合物7：無色片狀結(jié)晶(甲醇)；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δH4.34 (1H，m，H-3)，4.07 (1H，m，H-6)，2.05 (1H，m，H-7a)，1.73(2H，m，H-7b and H-8a)，1.41 (1H，m，H-8b)，3.29 (1H，m，H-9a)，3.08 (1H，m，H-9b)，3.07 (1H，m， H-10a)，3.00 (1H，m，H-10b)，7.25 (5H，m，H-12-H-16)，7.99 (1H，brs，NH-4)。參照文獻[8]，鑒定該化合物為cyclo-(phe-pro)。

化合物8：黃色粉末；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δH4.47(1H，m，H-3)，4.07(1H，m，H-6)，2.14(1H，m，H-7a)，1.83(2H，m，H-7b)，1.63(2H，m， H-8)，3.39 (1H，m，H-9a)，3.50 (1H，m，H-9b)，7.31 (2H，m，H-12，H-13)，7.20(2H，m，H-15，H-16)。綜合數(shù)據(jù)并與文獻[13]對照，確定該化合物為cyclo-(tyr-pro)。

化合物9：白色無定性粉末；負離子ESIMS給出準分子離子峰m/z 275.3 [M-H]-；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δH4.20 (1H，m，H-3)，3.31 (1H，dd，J= 8.0， 9.0 Hz，H-6)，2.14 (1H，m，H-7a)，2.04(2H，m，H-7b)，4.20 (2H，m，H-8)，3.57(1H，dd，J= 3.5，12.5 Hz，H-9a)，3.34(1H，dd，J=6.5，12.5 Hz，H-9b)，3.12 (1H，dd，J= 4.5，14.0 Hz，H-10a)，3.02(1H，dd，J=5.0，14.0 Hz，H-10b)，7.26 (2H，m，H-12，H-16)，7.17 (2H，m，H-13，H-15)。綜合數(shù)據(jù)并與文獻[14]對照，確定該化合物為cyclo-(tyr-4-hydroxy-pro)。

化合物10：白色無定性粉末。該化合物與化合物4的譜圖很相似，提示該化合物也為二酮哌嗪類的化合物。與化合物4的氫譜仔細對比，發(fā)現(xiàn)唯一的區(qū)別在于化合物10中C-3位的取代基由甲基變?yōu)楫惗』Ｅc文獻[11]對照，確定該化合物為cyclo-(leu-pro)，核磁數(shù)據(jù)見表1。

化合物11：白色無定性粉末。該化合物與化合物10的譜圖很相似，提示該化合物也為二酮哌嗪類的化合物。與化合物10的氫譜對比，發(fā)現(xiàn)唯一的區(qū)別在于化合物11中C-8位亞甲基上的1個氫被1個羥基所取代。與文獻[8]對照，確定該化合物為cyclo-(pro-4-hydroxyl-lle)，核磁數(shù)據(jù)見表1。

化合物12：白色無定性粉末。該化合物與化合物10的譜圖很相似，提示該化合物也為二酮哌嗪類的化合物。仔細比較兩者的氫譜，發(fā)現(xiàn)唯一的區(qū)別在于化合物12氫譜上多出1個亞甲基δH1.67(2H，m，H-9)。綜合以上數(shù)據(jù)并和文獻[14]比對，確定該化合物為cyclo-(D-pipecolinyl-L-leucine)，核磁數(shù)據(jù)見表1。

表1 化合物10～12的氫譜數(shù)據(jù)

Table 11H (500 MHz) Spectroscopic data for compounds 10～12

編號No.10δH(JinHz)11δH(JinHz)12δH(JinHz)1233.94,(1H,m)4.23,(1H,m)3.92,(1H,m)4564.07,(1H,t,J=7.5Hz)4.19,(1H,m)4.08,(1H,m)72.62,(1H,m),2.02,(1H,m)2.13,(1H,m),2.17,(1H,m)2.01,(1H,m),1.89,(1H,m)81.90,(2H,m)4.21,(1H,m)1.60,(2H,m)93.61,(1H,m),3.51,(1H,m)3.46,(1H,m),3.60,(1H,m)1.67,(2H,m)102.34,(1H,m),2.02,(1H,m)1.65,(1H,m),1.81,(1H,m)3.63,(1H,m),3.53,(1H,m)111.50,(1H,m)1.64,(1H,m)2.40,(1H,m),1.89,(1H,m)121.06,(3H,d,J=7.0Hz)0.94,(3H,d,J=6.5Hz)1.78,(1H,m)130.91,(3H,d,J=7.0Hz)0.92,(3H,d,J=6.5Hz)0.98,(3H,d,J=6.5Hz)140.95,(3H,d,J=6.5Hz)

Note:Compounds 10,12 in CDCl3，11 in Pyr-d5

3 結(jié)論

本研究對來源于太平洋加拿大海域海泥中的海洋細菌Bacillus sp.753的化學成分進行系統(tǒng)研究，從中獲得uridine(1)，thymine(2)，cyclo-(phe-lle)(3)，cyclo-(ala-pro)(4)，cyclo-(val-pro)(5)，cyclo-(pro-leu)(6)，cyclo-(phe-pro)(7)，cyclo-(tyr-pro)(8)，cyclo-(tyr-4-hydroxy-pro)(9)，cyclo-(leu-pro)(10)，cyclo-(pro-4-hydroxyl-lle) (11)，cyclo-(D-pipecolinyl-L-leucine)(12)等12個單體化合物，其中化合物1，2為核苷類化合物，化合物3～12均為二酮哌嗪類化合物，并且均為首次從該株菌中分離得到。本研究也證明該株菌中主要的化學成分是二酮哌嗪類化合物，同時豐富了該屬細菌中的化學成分類型，為進一步研究該菌屬的海洋細菌提供參考資料。

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(責任編輯：米慧芝)

Analysis of the Secondary Metabolites of Marine BacteriumBacillussp.753

SUN Yulin1,2，YANG Meiyu1，XIN Xinxin1，GAN Wenheng1，GONG Zhenying1， LI Ling1，DENG Wenying1，LIU Xiao1，CHEN Daohai1,2

(1.Life Science and Technology School，Lingnan Normal University，Zhanjiang，Guangdong，524048，China；2.Round Beibu Gulf Institute for the Protection and Utilization of Marine Animals in Medicine，Zhanjiang，Guangdong，524048，China)

【Objective】To investigate the secondary metabolites of marine bacterium Bacillus sp.753 by various modern spectrum methods.【Methods】Constituents in the fermentation liquid of the marine bacteria were isolated and purified by silica gel,Sephadex LH-20,and semi-preparative reverse-phase HPLC(C18).Their structures were identified by NMR,MS and literatures.【Results】Twelve compounds were isolated from marine bacterium Bacillus sp.753 and their structures were identified as uridine (1),thymine (2),cyclo-(phe-lle) (3),cyclo-(ala-pro)(4),cyclo-(val-pro) (5),cyclo-(pro-leu) (6),cyclo-(phe-pro)(7),cyclo-(tyr-pro) (8),cyclo-(tyr-4-hydroxy-pro) (9),cyclo-(leu-pro)(10),cyclo-(pro-4-hydroxyl-lle) (11),cyclo-(D-pipecolinyl-L-leucine)(12).【Conclusion】Compounds 1～12 were isolated from this bacterium for the first time,which not only enriched the types of chemical composition in the Bacillus sp.753,but also increased the research value of the marine bacterium.

marine bacterium，Bacillus sp.753，chemical constituents，structure identification

http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1075.N.20161123.1136.002.html

2016-08-15

孫玉林(1980-)，男，講師，主要從事海洋生物活性物質(zhì)應用研究。

*嶺南師范學院博士啟動項目(ZL1313)，廣東省自然科學基金項目(2015A030310406)，湛江海鮮食材資源可持續(xù)利用與保護科技服務平臺項目(2014B040404071)和湛江海鮮食材資源可持續(xù)利用重點實驗室項目(2015A06008)資助。

R914.4

A

1002-7378(2016)04-0258-05

網(wǎng)絡優(yōu)先數(shù)字出版時間:2016-11-23 【DOI】10.13657/j.cnki.gxkxyxb.20161123.001

**通信作者：孫玉林，E-mail：sunyulin07002@126.com；陳道海(1963-)，男，教授，主要從事海洋藥用動物的開發(fā)利用與保護研究，E-mail：daohaichen2002@163.com。