■朱 滔 黃小燕 王根虎

（上海亙泰實業(yè)集團，上海201615）

豆粕是世界上應(yīng)用最為廣泛的植物蛋白原料，其具有蛋白含量高、氨基酸較為平衡、動物消化吸收利用好等優(yōu)勢，在動物飼料中廣泛使用。然而在使用豆粕飼喂幼齡動物時，其中殘留的抗?fàn)I養(yǎng)因子可以引起嚴(yán)重的過敏反應(yīng)[1]。特別是在仔豬斷奶過程中，由于受到多種應(yīng)激因素的影響，導(dǎo)致斷奶仔豬綜合征，降低養(yǎng)殖效益。豆粕中存在的主要抗?fàn)I養(yǎng)因子包括抗原蛋白、寡糖、胰蛋白酶抑制因子、脲酶[2]。因此通過技術(shù)手段降低豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子含量是提高豆粕應(yīng)用價值的重要手段。通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)高質(zhì)量發(fā)酵豆粕[3]，既可以減少豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，還可以提高飼料適口性，具有重要的經(jīng)濟價值，受到飼料廠的廣泛歡迎。然而市場上發(fā)酵豆粕產(chǎn)品眾多，品質(zhì)不一，產(chǎn)品品質(zhì)評估標(biāo)準(zhǔn)十分重要。因此本文簡介了如何綜合評估發(fā)酵豆粕質(zhì)量，以期為選擇合適的發(fā)酵豆粕提供理論依據(jù)。

1 大豆蛋白質(zhì)的組成和溶解性

1.1 大豆蛋白質(zhì)的組成

大豆蛋白質(zhì)的組成及其特性見表1。大豆蛋白質(zhì)主要由球蛋白組成，占總蛋白含量的90%以上，其余還含有部分清蛋白，占總蛋白的含量僅為5%左右。大豆球蛋白根據(jù)蛋白質(zhì)沉降系數(shù)分類，可分為4個組分，即2S、7S、11S、15S[4]。其中 15S組分為多聚體大豆球蛋白，占球蛋白總量的9.1%左右。11S組分為大豆球蛋白，占球蛋白總量的41.9%。7S組分占總球蛋白的34.0%左右，包括β-伴大豆球蛋白（占總球蛋白30%左右）、γ-伴大豆球蛋白、α-淀粉酶、脂肪氧化酶、凝集素[5]。2S組分包括α-伴大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子、細(xì)胞色素，占總球蛋白含量約15.0%。

表1 大豆中蛋白質(zhì)的組成

1.2 大豆蛋白質(zhì)的溶解性

蛋白質(zhì)是有機大分子化合物，在水中以分散狀態(tài)存在，其在水中的融溶量稱為蛋白質(zhì)的溶解度。由于溶解度特性對大豆蛋白質(zhì)的提取、分離和純化影響非常大，所以大豆蛋白質(zhì)的溶解度大小在實際應(yīng)用中非常重要。同時大豆熱加工中蛋白質(zhì)變性的程度也可以通過蛋白溶解度的變化來評判。

大豆蛋白質(zhì)的等電點為4.2～4.6之間，其在水溶液pH值為等電點時溶解度最低，隨著水溶液pH值的提高或降低蛋白質(zhì)溶解度急劇增長[6]。圖1為溶液pH值對大豆蛋白質(zhì)溶解度的影響。

從圖1可以看出，當(dāng)溶液pH值在大豆蛋白質(zhì)等電點時（pH4.2左右），蛋白溶解度最低，只有8%左右，溶解的可能為非蛋白氮及清蛋白。隨著pH值的提高，大豆蛋白的溶解度快速提高，在溶液pH值提高到12以上時，大豆蛋白的溶解度提高至95%以上。大豆蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度不僅受到pH值的影響，熱加工、水溫、水溶液中鹽離子的含量等都會影響溶解度。

圖1 不同酸堿處理及pH值對大豆蛋白質(zhì)溶解度的影響[7]

2 發(fā)酵豆粕的性質(zhì)

發(fā)酵豆粕是以大豆粕為主要原料（≥95%），以麩皮、玉米皮等為輔助原料，使用農(nóng)業(yè)部《飼料添加劑品種目錄》中批準(zhǔn)使用的微生物菌種進行固態(tài)發(fā)酵，并經(jīng)干燥制成的蛋白質(zhì)飼料原料產(chǎn)品。從2013年開始實施的中國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2218-2012規(guī)定的發(fā)酵豆粕技術(shù)指標(biāo)包括：水分≤12.0%、粗蛋白質(zhì)≥45.0%、粗纖維≤5.0%、粗灰分≤7%、尿素酶活性≤0.1 U/g、酸溶蛋白（占蛋白含量）≥8.0%、賴氨酸≥2.5%、水蘇糖≤1.0%[8]。此行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)主要目的是規(guī)范市場，防止假發(fā)酵豆粕進入市場。但是僅僅這些指標(biāo)并不能合理評估不同發(fā)酵豆粕產(chǎn)品的價值。

發(fā)酵工藝對豆粕整體品質(zhì)的影響包括以下4方面：①微生物分泌的酶將大分子物質(zhì)降解為小分子（包括不良寡糖的降解、大分子蛋白降解為小分子肽鏈）；②微生物利用碳水化合物無氧發(fā)酵產(chǎn)生乳酸；③固體發(fā)酵時水分一般為30%～50%，發(fā)酵完成后將產(chǎn)品干燥，水分控制在5%～10%；④有些廠家在豆粕發(fā)酵前，有蒸煮消毒的前處理工藝。

從發(fā)酵豆粕降解豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子出發(fā)，國家制定了發(fā)酵豆粕的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，但是卻很少考慮到整個發(fā)酵工藝對豆粕質(zhì)量的影響，特別是干燥和/或蒸煮對豆粕氨基酸利用率的影響。由于過度熱加工對于豆粕氨基酸的利用率影響很大，因此發(fā)酵豆粕中沿用了豆粕質(zhì)量評價體系中的蛋白溶解度這一指標(biāo)，用于衡量豆粕在發(fā)酵過程中是否被過度熱處理。表2、表3表示豆粕和發(fā)酵豆粕的營養(yǎng)指標(biāo)及氨基酸的消化率。

表2 普通豆粕、發(fā)酵豆粕的營養(yǎng)物質(zhì)組成(%)[9]

表3 普通豆粕、發(fā)酵豆粕的氨基酸含量及其消化率(%)

從表2、表3中可以看出，發(fā)酵豆粕的營養(yǎng)價值（如粗蛋白、氨基酸含量），顯著高于普通豆粕。但是從日糧配制角度上來說，發(fā)酵豆粕賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸回腸末端標(biāo)準(zhǔn)消化率較浸提豆粕降低了14.77%、12.05%、1.12%，而氨基酸平均消化率從豆粕的87.39%降低至81.11%，平均降低7.19%。據(jù)分析，發(fā)酵豆粕氨基酸消化率降低的原因可能是其在生產(chǎn)過程中受到過度熱加工（蒸煮和/或干燥）的影響，降低了氨基酸的利用率。因此有必要在原有評估體系中增加對于熱加工程度的評估。

3 發(fā)酵豆粕評估體系

由上分析所知發(fā)酵豆粕的評估主要分為兩方面：①發(fā)酵豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解程度；②發(fā)酵豆粕蛋白受熱加工的影響程度?，F(xiàn)階段行業(yè)內(nèi)用的比較多的主要指標(biāo)有：抗原蛋白、酸溶蛋白、不良寡糖、乳酸含量、蛋白溶解度。其中抗原蛋白和不良寡糖是直接表明抗?fàn)I養(yǎng)因子消除情況，而酸溶蛋白、乳酸含量主要用來判斷發(fā)酵是否充分的兩個指標(biāo)，蛋白溶解度是指發(fā)酵豆粕是否加熱過度的指標(biāo)。一些飼料廠在使用時只注重某一項指標(biāo)，比如說抗原蛋白，但是卻忽略了發(fā)酵豆粕的整體質(zhì)量評估。我們認(rèn)為需要對發(fā)酵豆粕的質(zhì)量進行綜合判斷，改進現(xiàn)有檢測方法，準(zhǔn)確的評估發(fā)酵豆粕質(zhì)量。

楊玉娟等(2016)和周天驕等(2015)對總共308個不同豆粕和發(fā)酵豆粕樣品中抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的檢測結(jié)果（見表4）。從表4中可以看出，不同豆粕樣品和發(fā)酵豆粕樣品的抗?fàn)I養(yǎng)因子含量差異非常大。楊玉娟等（2016）的檢測結(jié)果表明，發(fā)酵豆粕中大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子、棉籽糖、水蘇糖的含量平均值分別為 54.7、37.6、7.5、1.93、5.19 mg/g，較豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子含量有明顯下降，但是不同發(fā)酵豆粕之間變異非常大，表現(xiàn)在大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子、棉籽糖、水蘇糖的變異系數(shù)分別為77.7%、95.2%、101.3%、169.4%、150.9%。這兩篇論文表明不同發(fā)酵豆粕對于抗?fàn)I養(yǎng)因子的消除率相差很大，因此有必要對不同發(fā)酵豆粕的質(zhì)量進行評價。

發(fā)酵豆粕生產(chǎn)過程中的蒸煮和干燥等濕熱處理工藝可以使蛋白質(zhì)變性（李巖濤，2013），蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)被破壞，二硫鍵斷裂，肽鏈展開，包埋的疏水基團開始暴露，并且與其它化合物的基團形成分子間或分子內(nèi)的結(jié)合鍵，從而降低其蛋白溶解度[12]。更為重要的是高溫能使氨基酸的氨基和還原性碳水化合物起反應(yīng)（美拉德反應(yīng)），降低氨基酸的含量和利用率。在所有氨基酸中賴氨酸是最容易發(fā)生美拉德反應(yīng)的氨基酸，其暴露在外的ε-氨基能與還原糖的羧基相結(jié)合。除賴氨酸外，蛋白質(zhì)分子中的其它氨基酸（如精氨酸、組氨酸和色氨酸）也會受熱加工過度的影響，可以與氨基酸發(fā)生反應(yīng)的還原性化合物還包括醛和酮。美拉德反應(yīng)的后期，會形成褐色素或類黑素，這也是豆粕經(jīng)過過熱加工后顏色變深的由來。美拉德反應(yīng)程度取決于水分活度、溫度、pH值、加熱時間，以及底物的種類和可利用程度[13-14]。因此發(fā)酵豆粕受熱損傷的程度可以通過產(chǎn)品顏色、蛋白溶解度、賴氨酸/粗蛋白比值來進行綜合評估。

表4 豆粕與發(fā)酵豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子含量（mg/g）

3.1 發(fā)酵豆粕蛋白溶解度的檢測

蛋白在溶液中的溶解基本上是所有檢測手段的前處理方法，因此有必要在檢測之前，對蛋白的溶解度有著深入的了解，才能全面認(rèn)識發(fā)酵豆粕的評估體系。豆粕中蛋白溶解度、酸溶蛋白以及抗原蛋白檢測的原理都與大豆蛋白的等電點以及其溶解性高度相關(guān)。大豆蛋白在溶液中的溶解性是檢測任何指標(biāo)的先決條件。因為大分子蛋白在等電點下溶解度最低而小分子蛋白可以在此pH值溶液中溶解，從而將大分子蛋白沉淀下來，將水溶液中粗蛋白含量認(rèn)定為發(fā)酵豆粕中小肽含量，因此也稱為酸溶蛋白。

測定豆粕蛋白溶解度所用的溶液為0.2%氫氧化鉀，溶液pH值為12.5，在此條件下大豆的蛋白溶解度在95%左右，而大豆經(jīng)過浸提或壓榨、烘干等熱加工過程后，由于蛋白質(zhì)變性和美拉德反應(yīng)，豆粕的蛋白溶解度降低至70%～85%。豆粕經(jīng)過發(fā)酵后有3大變化：①乳酸的產(chǎn)生；②大分子蛋白的降解；③烘干；這三個因素都會導(dǎo)致發(fā)酵豆粕蛋白溶解度的變化：①發(fā)酵豆粕中酸的存在會與氫氧化鉀中和，降低溶液的pH值，從而降低蛋白溶解度。方華等（2014）的研究表明，發(fā)酵過程中產(chǎn)生的2%～4%的有機酸可以導(dǎo)致蛋白溶解度檢測值偏低10%～15%；②大分子蛋白降解為小分子蛋白（酸溶蛋白）后，小分子蛋白在堿性環(huán)境條件下溶解度也有下降，見圖2；③隨著烘干溫度的升高和時間延長，發(fā)酵豆粕蛋白溶解度隨之降低。

發(fā)酵豆粕檢測蛋白溶解度的目的是確認(rèn)熱加工的程度，防止過度烘干，影響發(fā)酵豆粕中氨基酸的消化率。但是因為乳酸以及酸溶蛋白影響蛋白溶解度，并且不同廠家發(fā)酵豆粕產(chǎn)品中乳酸和酸溶蛋白含量完全不同，所以在檢測發(fā)酵豆粕蛋白溶解度時，需要改善檢測方法，消除乳酸及酸溶蛋白對蛋白溶解度檢測的影響。從而使蛋白溶解度成為反應(yīng)發(fā)酵豆粕受熱加工影響程度的一項準(zhǔn)確的評價指標(biāo)。

豆粕的蛋白溶解度控制在70%～85%之間，近年來隨著油脂加工技術(shù)的改進，豆粕的蛋白溶解度有提高的趨勢。方華等（2014）[15]的研究表明，發(fā)酵過程中蒸煮溫度超過100℃、干燥溫度超過60℃，對發(fā)酵豆粕的蛋白溶解度影響巨大[15]。結(jié)合實際檢測數(shù)據(jù)，我們建議發(fā)酵豆粕蛋白溶解度最好高于70%，最低不低于65%。

3.2 發(fā)酵豆粕抗原蛋白的檢測

大豆中的抗原蛋白有很多，目前研究比較充分的大豆抗原蛋白主要有大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白，其沉降系數(shù)分別為11S和7S，分別占大豆總蛋白的36%和27%左右。而根據(jù)免疫反應(yīng)活性，大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白分別占40%和27.9%左右[17]。因此我們現(xiàn)階段的主要手段就是通過檢測大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的含量，間接推斷發(fā)酵豆粕中抗原蛋白的降解程度。大豆中除大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白外，還有其它的抗原蛋白存在。此外，大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的不同亞基致敏能力也不同。Ogawa等（1995）[18]和Fu等（2007）[19]研究表明，β-伴大豆球蛋白的α亞基是大豆致敏蛋白中最重要的一種，而α亞基和β亞基并不是致敏蛋白。大豆球蛋白的總體致敏能力低于7S蛋白。研究表明，11S球蛋白的酸性多肽亞基均為過敏蛋白，而堿性多肽很少與大豆過敏患者血清產(chǎn)生免疫反應(yīng)[20]。

圖2 不同pH值下大豆分離蛋白和大豆水解蛋白的溶解度[16]

加工處理能影響大豆蛋白的致敏性。龍國徽（2015）的研究表明，120℃濕熱處理能顯著改變大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的結(jié)構(gòu)，引發(fā)其免疫活性的變化，并且進一步的研究發(fā)現(xiàn)，大豆球蛋白比β-伴大豆球蛋白結(jié)構(gòu)熱穩(wěn)定性更好，結(jié)構(gòu)不易破壞[21]。

在此背景下，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）通過制備抗大豆主要抗原蛋白抗體，建立抗原蛋白定量測定方法，具有高度專一、高靈敏性等優(yōu)點，近年來是抗原蛋白檢測的主要手段。ELISA法檢測抗原蛋白，第一步是將蛋白用提取液進行提取，通常提取液的pH值都在堿性偏中性?？紤]到發(fā)酵豆粕一般偏酸性，提取時溶液pH值可能偏低。并且發(fā)酵豆粕0.2%KOH溶解度低于豆粕，好的發(fā)酵豆粕溶解度在70%左右，很多發(fā)酵豆粕甚至只有50%～60%?？紤]到如上兩個影響因素，檢測時提取出來的蛋白含量可能更低，只有50%不到。在此條件下檢測出來的抗原蛋白含量僅供參考，只能從一定程度上用來評估不同發(fā)酵豆粕產(chǎn)品的質(zhì)量。

發(fā)酵豆粕中抗原蛋白的降解、蛋白溶解度的降低、產(chǎn)品中的有機酸都能導(dǎo)致抗原蛋白檢測結(jié)果低。SDS-page法蛋白條帶顏色淺、ELISA法定量檢測值低都只能說明提取出來的抗原蛋白含量低，并不能完全說明抗原蛋白已經(jīng)被降解。將抗原蛋白作為準(zhǔn)確反映發(fā)酵豆粕蛋白質(zhì)量的指標(biāo)需要改善檢測方法（消除酸和熱加工對溶解度的影響），提高蛋白質(zhì)在緩沖液中的溶解度，充分將發(fā)酵豆粕中的蛋白（特別是大分子蛋白）提取出來。

SDS-PAGE法檢測抗原蛋白的第一步與ELISA方法相同，都是將發(fā)酵豆粕中的蛋白提取出來。檢測方法中存在的問題也與ELISA法相同。但是不同的是加熱處理可以使大豆蛋白變性，變性后的蛋白質(zhì)由于結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，在聚丙烯酰胺凝膠上不能結(jié)合，通過電容檢測不到抗原蛋白的存在[22]。

3.3 發(fā)酵豆粕中酸溶蛋白的檢測

發(fā)酵豆粕中酸溶蛋白的檢測方法來源于大豆肽粉國標(biāo)GB/T 22492-2008[23]。主要原理是利用大豆中的大分子蛋白在酸性條件下易被沉淀，而分子量較小的蛋白質(zhì)（肽、游離氨基酸、非蛋白氮）可以溶于酸性溶液中。因此將樣品用三氯乙酸進行處理，將大分子蛋白沉淀下來，檢測小分子蛋白的含量，以此為指標(biāo)表示豆粕中大分子蛋白的降解程度。然而與大豆肽粉不同的是，發(fā)酵豆粕中含有有機酸，可以降低溶液中的pH值，從圖1中可以看出來，大豆蛋白的溶解度在pH值低于等電點情況下的溶解度也會迅速增加。如果產(chǎn)品中有機酸含量不同，溶液的pH值也不同，對于酸溶蛋白的檢測結(jié)果也有影響。因此需要消除有機酸對溶液pH值的影響，再對發(fā)酵豆粕的酸溶蛋白含量進行檢測。

3.4 其他反應(yīng)熱加工程度的指標(biāo)

熱加工對豆粕的影響可以表現(xiàn)在蛋白溶解度指標(biāo)的變化，但是隨著熱加工程度的逐漸加深，美拉德反應(yīng)的加重，豆粕的很多物質(zhì)（如賴氨酸）含量都會發(fā)生變化。豆粕受熱損傷，賴氨酸濃度降低，而粗蛋白的濃度不會發(fā)生變化。隨著熱加工程度的加深（溫度升高、時間延長、高壓蒸汽的存在），豆粕中賴氨酸/粗蛋白比值隨之降低。González-Vega等（2015）的研究表明，隨著高壓蒸汽處理時間的延長，賴氨酸/粗蛋白比例從6.29%降低至5.57%[24]。并且Stein等(2009)[25]和Cozannet等（2010）[26]都報告了熱損傷DDGS中賴氨酸/粗蛋白比值的降低。因此可以通過計算賴氨酸/粗蛋白值來判斷發(fā)酵豆粕的熱損傷程度。從表2中可以計算浸提豆粕和發(fā)酵豆粕的賴氨酸/粗蛋白比值分別為6.29%和5.81%，說明發(fā)酵豆粕中熱損傷程度加深，這也與發(fā)酵豆粕氨基酸的消化率低于浸提豆粕的現(xiàn)象相吻合。此外還有報道表明，可以通過檢測糠氨酸的量來評估豆粕熱損傷程度（González-Vega等，2015）。

4 結(jié)語

綜合以上討論，發(fā)酵豆粕作為一種常見的原料，在市場上使用非常普遍，但是現(xiàn)有的檢測方法均來源于其它產(chǎn)品。發(fā)酵過程中豆粕產(chǎn)生了一系列的變化，包括蒸煮、大分子蛋白和寡糖的降解、酸的產(chǎn)生、進一步干燥，使發(fā)酵豆粕明顯有別于其它大豆類產(chǎn)品。其它產(chǎn)品的檢測方法對于發(fā)酵豆粕來說并不是十分合適，需要對檢測條件進行調(diào)整，以符合發(fā)酵豆粕的實際情況。在此結(jié)合實際情況，發(fā)酵豆粕的推薦評價標(biāo)準(zhǔn)為：蛋白溶解度≥70%、酸溶蛋白（占蛋白比）≥20%、大豆球蛋白+β-伴大豆球蛋白≤10%、水蘇糖+棉籽糖≤1%、賴氨酸/粗蛋白≥6.0%。