■ 王 燕 文奇男 劉朝銀 劉 驥 郭建華 任 健 郭宏文 劉曉蘭*

（1.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江齊齊哈爾161006；2.遼寧省農(nóng)牧業(yè)機械研究所有限公司，遼寧沈陽110036）

隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展，蛋白質(zhì)資源嚴重匾乏， 血粉粗蛋白含量高（80%～90%），賴氨酸、亮氨酸等氨基酸豐富[1]，還含有多種微量元素、多種酶類和維生素，因此開發(fā)血粉既可解決血液的利用問題，又能緩解動物蛋白飼料的緊缺。但是血粉適口性不好，氨基酸不平衡，因此大部分資源都浪費了。另外，血液資源由于缺乏制備血粉的烘干等設備而將這些資源作為廢棄物排放掉，造成了嚴重的環(huán)境污染[2]。因此，血液資源的開發(fā)利用不僅緩解蛋白原料短缺的現(xiàn)狀，還有利于保障飼料工業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，同時可有效地緩解其對環(huán)境的污染。因此，加強對畜禽血液資源的精深加工和綜合利用，研發(fā)出優(yōu)質(zhì)血粉產(chǎn)品對我國畜牧行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有深遠影響和重大意義。

目前血粉的加工方法主要有物理法、化學法、酶法和微生物法。物理方法包括膨化、噴霧干燥和高壓處理等，這些方法能提高營養(yǎng)物質(zhì)的安全性和利用率，仍未能解決適口性差的問題，但對氨基酸構成沒有改善[3]，并且存在著高耗能、高投資等，極大地增加了養(yǎng)殖成本，導致其在飼料生產(chǎn)上的推廣應用受到了限制。化學加工和酶解加工均可以改善血粉的營養(yǎng)特性，但制成的成品中都含有血腥味，酶解血粉成本較高，推廣受到限制。微生物發(fā)酵方法是利用微生物產(chǎn)復合酶的特性將血粉大分子蛋白質(zhì)水解成氨基酸和肽等小分子物質(zhì)，并可以增加血粉中的游離氨基酸的含量，還能有效破壞血細胞膜，釋放血粉中的各種營養(yǎng)物質(zhì)或者利用營養(yǎng)物質(zhì)合成菌體蛋白，還可以有效地利用載體中的纖維素、植酸等營養(yǎng)成分[4]。利用此方法制備得到的產(chǎn)品其消化率和適口性得到改善，發(fā)酵血粉具有酒香味，適口性好，有效降解大分子蛋白，大大提高了血粉的消化率和適口性。另外，酶解處理后蛋白的二級結構會發(fā)生改變，蛋白的二級結構主要包括α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)則卷曲，酶解處理之后，蛋白的各種二級結構的含量會發(fā)生變化，導致功能特性的變化，動物利用效果提高[5]。本項目采用復合微生物協(xié)同發(fā)酵法制備肽含量高的血粉，以期提高血粉的營養(yǎng)價值和利用率，更有效地替代魚粉等優(yōu)質(zhì)蛋白飼料。

1 材料方法

1.1 試驗菌種

米曲霉、枯草芽孢桿菌，齊齊哈爾大學生物工程實驗室提供。①PDA培養(yǎng)基：土豆汁（30%濃度配制），2%葡萄糖，自然pH。②LB培養(yǎng)基：1%胰蛋白胨、0.5%酵母浸膏、1%氯化鈉，自然pH。

1.2 生長曲線的繪制

依據(jù)單菌篩選出的菌種，挑選斜面上生長良好的部位，各接種一環(huán)到裝有100 ml種子培養(yǎng)基的250 ml的三角瓶中，以37℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)好的種子液接入到裝有250 ml種子培養(yǎng)基的500 ml的三角瓶中，每瓶接入15 ml種子液，每種菌設置1個重復。將接種好的三角瓶于37℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)，每隔4 h每瓶取5 ml菌液，5 000轉離心10 min，棄上清液。再往離心管內(nèi)加入40 ml蒸餾水，振蕩，使沉淀變成懸濁液，以蒸餾水為對照，在600 nm下測定吸光值。以培養(yǎng)時間為橫坐標，吸光值的平均值為縱坐標，繪制生長曲線。菌種計數(shù)采用平板計數(shù)法。好氧菌采用涂布平板法，兼性厭氧菌采用傾注平板法。

1.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

按照單因素試驗設計，分別優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的比例、物料比、發(fā)酵溫度、培養(yǎng)時間以及輔料添加比例，起始條件為菌種比例為1∶1，物料比為5∶5，溫度30℃，發(fā)酵時間64 h，料水比1∶2，pH值自然。酶活的測定方法參照國標[6]。

2 結果與討論

2.1 米曲霉和枯草芽孢桿菌的生長曲線(見圖1、圖2)

圖1 米曲霉生長曲線

圖2 枯草芽孢桿菌生長曲線的測定

由圖1可以看出，從0～8 h時菌體處于生長延滯期，這一時期是菌體吸水膨脹、子囊消失的過程，8～24 h時菌體處于對數(shù)生長期，在24～28 h時達到菌體生長的穩(wěn)定期。對數(shù)生長期是菌體具有較高的繁殖能力的時期，所以選擇20 h為最佳的種子培養(yǎng)時間，此時的菌體濃度為23.60 mg/ml。

由圖2可以看出，0～12 h枯草芽孢桿菌生長旺盛，12～16 h枯草芽孢桿菌生長下降，16～20 h生長緩慢上升，20～24 h又下降。所以可以看出生長12 h時枯草芽孢桿菌生長最旺盛，此時的菌體濃度最大，為12.53 mg/ml，所以選擇12 h為枯草芽孢桿菌的液體種子培養(yǎng)的最佳時間。

2.2 最佳發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 最佳物料的優(yōu)化(見圖3)

圖3 血粉與輔料的最適比例

由圖3可知，物料比血粉與麥麩5∶5時發(fā)酵效果最好，這與麥麩本身的透氣性好有關。對于米曲霉這類好氧菌，添加麥麩能提高物料的通透性，使氧氣與菌種能充分反應，促進菌體的生長和增殖。加入快速碳源一般應加快反應，但在本試驗中，快速碳源（蔗糖）對產(chǎn)酶性能有一定的阻遏，可能是微生物胞外酶生物合成的分解代謝產(chǎn)物的阻遏效應，在快速碳源存在的條件下，組成酶和誘導酶都有類似的現(xiàn)象。顯然，蔗糖對米曲霉和枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的阻礙屬于代謝產(chǎn)物阻礙。

2.2.2 最佳主輔料比的優(yōu)化(見圖4)

由圖4可知，血粉和麥麩的比例為5∶5時，蛋白酶活力最高。當麥麩含量逐漸增加時，蛋白酶活力逐漸增加，這可能是由于麥麩一般情況除了增加物料的通透性，提供充足的氧氣外，還會提供碳源，此時的碳氮比能最大限度地增加微生物的增殖，隨著微生物數(shù)量的增加，產(chǎn)酶活力必然會逐漸加大，便于微生物發(fā)揮作用。

圖4 血粉和麥麩的比例優(yōu)化

2.2.3 最佳料水比的條件優(yōu)化(見圖5)

圖5 最適料水比的條件優(yōu)化

由圖5可知，料水比為1∶2時蛋白酶酶活力較高，且與1∶2.5、1∶3.5的比例的蛋白酶酶活無顯著差異，隨著水的增加，微生物的增殖能力和產(chǎn)酶能力都相應提高。合適的濕度能改善物料的理化性質(zhì)，促進菌體生長，提高酶活，一般高于70%較為適宜，對于細菌，一般要求70%為宜，而真菌對濕度要求較高，20%～70%之間為宜。為了降低成本應選擇1∶3.5作為最適比例。但是水含量過高，物料無法滿足微生物的營養(yǎng)要求，會使蛋白酶活下降。

2.2.4 最佳發(fā)酵溫度的優(yōu)化(見圖6)

由圖6可知，隨著發(fā)酵溫度的增加，蛋白酶酶活呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，當發(fā)酵溫度為36℃時，蛋白酶酶活達到最高值為4 114.93 U/g，溫度主要影響的是菌體生長和底物濕度，溫度越高，相對濕度就越小。本文采用的微生物是米曲霉和枯草芽孢桿菌，米曲霉的最適溫度為30℃，細菌的最適溫度為37℃，兩種菌達到更好的生長和產(chǎn)酶效果，最適溫度應該介于兩者之間，這與本文得到的結論是一致的。隨著溫度的繼續(xù)增加，酶活力迅速下降。

圖6 隨發(fā)酵溫度的升高蛋白酶酶活的變化

2.2.5 最佳發(fā)酵時間優(yōu)化

從24～36 h，酶活變化較大，從36～48 h酶活變化不大，從培養(yǎng)36 h開始，產(chǎn)酶速度加快，到72 h達到產(chǎn)酶最高峰，然后開始下降，且下降幅度較大，說明發(fā)酵受到時間的影響較大。發(fā)酵時間主要影響菌體的生長和酶活，在固態(tài)基料中傳質(zhì)較液態(tài)基料慢，由本文可以看出，隨著發(fā)酵時間的延長，蛋白酶酶活逐漸增加，72 h達到峰值，發(fā)酵到84 h反而酶活下降，可能是養(yǎng)料已經(jīng)消耗殆盡，產(chǎn)生了其他的副產(chǎn)物消耗了其中的蛋白酶。

圖7 隨發(fā)酵時間的延長蛋白酶酶活變化

Wang等[7]采用米曲霉固態(tài)發(fā)酵豬血和麥麩的混合物，120 h后，肽的含量顯著增加，俞煒洋等[8]采用產(chǎn)朊假絲酵母、枯草芽孢桿菌和乳酸菌等多種蛋白酶使發(fā)酵產(chǎn)品具有醇香味，適口性得到改善，發(fā)酵后產(chǎn)生小肽和氨基酸。這些研究與本文得到的結論是一致的。方俊等[9]篩選到高產(chǎn)蛋白酶的菌株，通過米曲霉、釀酒酵母和芽孢桿菌使蛋白酶活力達到2 991.4 U/g，經(jīng)血粉發(fā)酵檢測，該混合菌有較強的蛋白分解能力，能降解血粉和羽毛粉中難以分解的大分子蛋白。張濱等[10]采用蠟樣芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌進行多菌種混合發(fā)酵血粉，顯著提高了蛋白酶活力（5 113.4 U/g）。但是以上研究顯然酶活低于本試驗的結果，這與選擇的菌種和發(fā)酵工藝條件有關。與單菌株單獨發(fā)酵相比，多個菌株協(xié)同生長更快，發(fā)酵周期更短，多菌種混合發(fā)酵玉米蛋白粉能產(chǎn)生大量的發(fā)酵副產(chǎn)物，大大改善了血粉的氣味，提高了血粉的適口性。

3 結論

酶解血粉最佳的發(fā)酵工藝條件為最優(yōu)的物料是麥麩，血粉和麥麩比例是5∶5，料水比是1∶3.5，發(fā)酵溫度是36℃，發(fā)酵時間是72 h，達到最高酶活是6 122.08 U/g。