■ 占 峰 付志歡 林 羽 周 萌* 吳國杰 舒緒剛 周新華 邱桂雄

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，廣東廣州510225；2.廣州天科生物科技有限公司，廣東廣州510627)

硒具有抗氧化、抗腫瘤等多種生理功能，是動物的重要營養(yǎng)元素之一，廣泛用于飼料添加劑中，硒的主要添加形式有無機亞硒酸鈉鹽和有機酵母硒，亞硒酸鈉毒性高、不易被動物吸收利用，易造成浪費和環(huán)境污染，而酵母硒具有代謝周期長，生物利用率高，毒性低等特點[1]。因此，了解酵母硒中無機硒和有機硒含量具有重要意義。

目前，酵母硒作為一種重要飼料添加劑，總硒的測定方法主要有二氨基聯(lián)苯紫外分光光度法[2]、原子熒光分光光度法[3-6]、電感耦合等離子法[7-8]，其中氫化物原子熒光光度法已引入國家標準法中；有機硒的測定方法目前還沒有唯一標準，報道較多的主要有質(zhì)譜-高效液相色譜法[9-10]、衍生-高效液相色譜法[11]等，但這些方法對儀器要求較高，測試周期較長，且成本較高不適合廣泛推廣。本研究以酸熱法提取硒酵母中無機硒并結(jié)合HG-AFS方法測定硒酵母中總硒、無機硒含量，并通過總硒含量減去無機硒含量的方法間接計算出有機硒含量，該法操作簡單，用時較短，期望能為酵母硒中有毒無機硒測定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

硼氫化鉀，鹽酸、硝酸、高氯酸（均為優(yōu)級純），高純水，硒標準溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

AFS-2000原子熒光分光光度計（北京科創(chuàng)海光有限公司），數(shù)顯恒溫浴鍋（上海申勝生物技術(shù)有限公司），超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司），恒溫電熱板（Lab-Tech EH20B），低速離心機（金壇鴻科儀器HDL-4）。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

混合酸：硝酸∶高氯酸=4∶1（配比與樣品有關(guān)）；硼氫化鉀溶液：稱取1 g氫氧化鈉加200 ml高純水使其充分溶解，再加入4 g硼氫化鉀混合均勻，現(xiàn)配先用。

1.3.2 總硒含量測定方法

按GB/T13883—2008《飼料中硒的測定》方法測定。

1.3.3 無機硒含量測定方法

準確稱取0.1 g硒酵母于100 ml三角瓶中加入10 ml 3 mol/l的鹽酸，超聲5 min，使酵母充分溶解，再置于沸水浴中10 min后迅速冷卻，4 000 r/min離心10 min，取上清液，酵母細胞沉淀重復(fù)利用鹽酸提取2次，合并上清液再置于電熱板上煮沸2 min，稀釋定容。

1.3.4 有機硒含量測定方法

有機硒含量通過差減法（總硒含量減去無機硒含量）測定。

2 結(jié)果分析

2.1 儀器最佳工作條件

儀器工作負高壓：280 V；空心陰極燈電流：80 mA；載氣流量：400 ml/min；屏蔽氣流量：900 ml/min；原子化爐高度：8 mm；讀數(shù)時間：15 s；延遲時間：3 s；載液：5%HCl；還原劑 ：2%KBH4+0.5%NaOH。

2.2 儀器精密度與檢出限(見表1)

表1 儀器精密度

按照儀器的最佳條件，確定硒的最佳線性范圍為 0～40 μg/l，曲線的相關(guān)系數(shù) R2=0.999 9。通過對10 μg/l標準硒測定5次，得到RSD=2.8%，該方法有較好的精密度。同時，將標準空白連續(xù)測定11次，按3倍標準偏差得到檢出限（3δ）為0.020 1 μg/l。

2.3 不同濃度鹽酸對無機硒提取效果的影響

由于酵母細胞壁較厚，在沸水浴中，鹽酸能有效的破壞酵母細胞璧的結(jié)構(gòu)，使其通透性發(fā)生變大或甚至破裂，胞內(nèi)小分子物質(zhì)溢出，而本試驗考察了不同濃度鹽酸對無機硒提取效果的影響，結(jié)果如圖1所示，當鹽酸濃度在3 mol/l時，提取量達到較大，并通過重復(fù)稱取5份酵母硒測定無機硒含量，如表2，其相對偏差在2.85%，方法較為穩(wěn)定。

圖1 鹽酸濃度對無機硒提取效果的影響

表2 無機硒的測定含量

2.4 無機硒回收率測定

通過測定3種不同市售的富硒酵母樣品中無機硒回收率（結(jié)果見表3）可知，分別在2.5、5、7.5 μg/l的加標量下，其無機硒回收率在83.4%～89.7%，其回收率大于80%，符合微量元素測定準確的方法，可以通過差減法進行后續(xù)的有機硒定量測定。

表3 無機硒回收率的測定

2.5 有機硒的測定

對市售的3種不同廠家的富硒酵母樣品進行分析測定結(jié)果如表4。如表4可知，3種不同的市售富硒酵母其有機硒占富硒酵母總硒含量分別為98.8%、98.3%、98.0%。

表4 酵母硒中有機硒和無機硒的測定

3 結(jié)論

本文采用HG-AFS與鹽酸破碎提取相結(jié)合的方法測定硒酵母中的總硒和無機硒含量，并通過差減法得到有機硒含量，結(jié)果表明樣品中有機硒含量占98%以上，這一結(jié)果符合《飼料添加劑安全使用規(guī)范》的規(guī)定，可以用于飼料添加劑，同時通過無機硒的加標回收試驗，該方法準確、穩(wěn)定，適于富硒酵母有機硒和無機硒的測定。