郭 輝，馮 銳，陳 燦，張曉麗，劉百龍，秦學(xué)毅

(廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所/廣西水稻遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007)

利用標(biāo)記輔助選擇培育抗褐飛虱水稻三系保持系和不育系

郭 輝，馮 銳，陳 燦，張曉麗，劉百龍，秦學(xué)毅*

(廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所/廣西水稻遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007)

以廣西普通野生稻的高抗褐飛虱滲入系HS204為抗源供體材料，采用雜交、回交，結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇的方法，選育抗性保持系和不育材料，以期為雜交稻抗性育種提供良好的材料基礎(chǔ)。結(jié)果表明，通過標(biāo)記輔助選擇獲得4份抗性基因純合的保持系中間材料(100B、101B、102B和103B)，2份抗性不育系材料(100A和103A)。與高抗不育系100A測交的10個(gè)組合均表現(xiàn)出較好的抗褐飛虱抗性水平，其中屬高抗水平的為100A/R2586、100A/KR838和100A/KR527，其余為抗至中抗水平；100A/KR527、100A/R2586、100A/明恢63、100A/輻恢838和100A/桂99等組合單株產(chǎn)量比對照(特優(yōu)7118)顯著增高，增幅為14.45 %～49.26 %。獲得的抗性保持系，可為雜交稻抗性不育系的育種提供更好的基因源；獲得的抗性不育系可直接應(yīng)用于三系雜交稻的配組選育。

水稻；抗褐飛虱品種；分子標(biāo)記輔助選擇；保持系；不育系

(Rice Research Institute/Guangxi Key Laboratory of Rice Genetics and Breeding, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Guangxi Nanning 530007，China)

稻褐飛虱[Nilaparvatalugens(St?l)]，屬于同翅目飛虱科(Homoptera:Delphacidae)，是我國南方稻作區(qū)及東南亞水稻生產(chǎn)國的主要害蟲之一[1]，由于褐飛虱繁殖力強(qiáng)、生長周期短、有很強(qiáng)的適應(yīng)力和遠(yuǎn)距離遷飛性等特點(diǎn)，同時(shí)還是水稻病毒如草狀矮縮病毒的傳播媒介，因此可對水稻正常生長產(chǎn)生極大危害[2]。2001-2010年，我國因褐飛虱危害，每年平均受災(zāi)稻田約2467×105hm2次，造成稻谷損失年均1.12億kg，分別比1990-2000年均值增加47.2 %和46.0 %[4]。目前，對褐飛虱防治仍以化學(xué)藥劑防治為主[5]，不僅增加稻米生產(chǎn)成本、污染環(huán)境，且部分殺蟲劑還可刺激褐飛虱產(chǎn)卵，誘導(dǎo)其產(chǎn)生抗藥性[6]。有關(guān)研究結(jié)果表明，挖掘和利用抗褐飛虱基因，選育和推廣抗褐飛虱水稻品種是控制褐飛虱種群最節(jié)約成本、安全、有效的途徑之一[7]。

抗性基因的鑒定與定位是抗性育種的基礎(chǔ)，迄今至少報(bào)道了34個(gè)褐飛虱抗性位點(diǎn)，其中28個(gè)主效抗性基因已被定位，其中顯性基因Bph3、Bph14、Bph26和隱性基因bph29已被成功克隆[8-9]，這些基因中的一小部分已應(yīng)用于抗褐飛虱遺傳改良。由于抗蟲鑒定受環(huán)境的影響較大，且耗時(shí)費(fèi)力。而分子標(biāo)記輔助選擇不受蟲源的影響，結(jié)合常規(guī)育種手段，已成為抗褐飛虱選育的重要途徑[10-11]。采用來源于廣西普通野生稻的高抗褐飛虱滲入系HS204為抗源，通過雜交、回交，結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇將抗性基因轉(zhuǎn)入保持系龍?zhí)馗中，再與龍?zhí)馗測交、回交，選育抗性不育系材料，以期為雜交稻抗性育種提供良好的材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供體親本為高抗褐飛虱材料HS204，其抗褐飛虱基因來源于廣西普通野生稻，為經(jīng)多年雜交選育而成的近等基因系。受體親本為水稻三系保持系龍?zhí)馗。Ptb33為抗蟲對照(CK-R)，TN1為感蟲對照(CK-S)。用于測交的恢復(fù)系：桂99、明恢63、中恢6號、鹽恢559、R7954和輻恢838，自育恢復(fù)系：R2586，自育抗褐飛虱恢復(fù)系KR838、KR527、KR30等。

供試蟲源為廣西南寧田間采集混合生物型，在網(wǎng)室用TN1飼養(yǎng)繁殖備用，以褐飛虱生物型Ⅱ?yàn)橹鳎c部分越南九龍江型、孟加拉型和生物型Ⅰ構(gòu)成混合生物型。

1.2 檢測分子標(biāo)記

將抗源HS204的抗褐飛虱基因定位在第4號染色體分子標(biāo)記M4-10與M4-68間，其中SSR標(biāo)記M4-10在2個(gè)親本間表現(xiàn)多態(tài)，參照CTAB提取法從水稻葉片中提取DNA樣品，利用與抗褐飛虱基因緊密連鎖的分子標(biāo)記M4-10(F：5′-GTGTAGCTGCTAGGCCGAAC-3′；R：5′-TTCCTTTCGCTACGTTGGAC-3′)，對分離群體中的抗性基因Bph(t)進(jìn)行跟蹤檢測，選擇攜帶目標(biāo)基因的株系。

分子標(biāo)記引物由北京三博遠(yuǎn)志公司合成，DNA聚合酶、dNTPs等試劑購自上海生工生物工程技術(shù)公司。水稻PCR擴(kuò)增，電泳及銀染檢測參考李進(jìn)波等[10]的方法，PCR擴(kuò)增總體積為10 μl，反應(yīng)體系含有10×PCR Buffer(含Mg2+)1 μl，10 mM dNTP 0.2 μl，5 U/μlTaqDNA polymerase 0.1 μl，10 μM上游、下游引物各0.2 μl， DNA模板1 μl，ddH2O調(diào)至總體積10 μl。

1.3 鑒定褐飛虱抗性

參照苗期集團(tuán)篩選法[12]，將待鑒定品系每份取適量種子，催芽后條播于盤內(nèi)，每行播20～25粒，當(dāng)苗長至2～3葉時(shí)去除小苗、弱苗，保留健壯一致的苗，按每株5～8頭接入2～3齡若蟲，在感蟲對照品種TN1死亡7 d后進(jìn)行調(diào)查?？瓜x級別按國際水稻所標(biāo)準(zhǔn)逐株評定：1級，不受損害或第1葉梢變黃；3級，第1、2葉黃；5級，第1～3葉變黃或植株呈矮化；7級，植株開始凋萎；9級，植株死亡。最后計(jì)算各品系平均抗性級別，公式如下：平均抗級=∑(各抗級株數(shù)×對應(yīng)抗性級別)/總株數(shù)。平均抗性級別分為：1.0～1.9為高抗(HR)，2.0～3.9為抗(R)，4.0～5.9為中抗(MR)，6.0～7.9為中感(MS)，8.0～9.0為高感(HS)。

1.4 測定測交組合農(nóng)藝性狀

用轉(zhuǎn)育得到的抗性不育系與恢復(fù)系分別測交，特優(yōu)7118作為對照，每個(gè)小區(qū)1個(gè)組合按5行×10株規(guī)格種植，3次重復(fù)，田間數(shù)據(jù)對每小區(qū)第3行3～8株進(jìn)行采集，主要指標(biāo)有株高、有效穗數(shù)、穗長、每穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重等產(chǎn)量相關(guān)性狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 改良選育抗褐飛虱保持系

于2011年早造采用龍?zhí)馗作母本，抗褐飛虱HS204作父本進(jìn)行雜交，同年晚造再利用龍?zhí)馗作輪回親本進(jìn)行回交。于2012年早造利用與抗性基因緊密連鎖的標(biāo)記M4-10和M4-68進(jìn)行檢測，選擇含目的基因的單株再次回交，之后結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇、苗期抗性鑒定和田間農(nóng)藝性狀觀測，選擇符合育種目標(biāo)的單株自交，目前已獲得4份抗性基因純合的保持系中間材料，分別為100B、101B、102B與103B。圖1顯示的是利用標(biāo)記檢測改良龍?zhí)馗分離群體中隨機(jī)選取的28個(gè)單株。

2.2 選育抗褐飛虱不育系

為了縮短育種時(shí)間，從2013年晚造開始對BC2F3代改良的保持系株系進(jìn)行不育性保持能力的測配篩選。利用待改良保持系對應(yīng)的龍?zhí)馗測交，下一造選擇不育率達(dá)99.99 %以上的株系，從中進(jìn)行分子標(biāo)記檢測，選擇農(nóng)藝性狀良好的抗性株系連續(xù)回交，至2016年早造獲得BC5F1代的抗性不育系材料100A、103A，同時(shí)獲得BC2F8代的抗性保持系100B、103B。

2.3 改良保持系及測交組合的抗褐飛虱抗性鑒定

經(jīng)過連續(xù)多年選育，至2015年改良抗性保持系已到BC2F7世代，農(nóng)藝性狀基本穩(wěn)定。在2014和2015年連續(xù)2年的苗期抗性鑒定中(表1和圖2)，改良保持系100B、103B的抗級都小于2級，達(dá)高抗水平。這表明所選育的改良保持系100B、103B對褐飛虱具有穩(wěn)定的抗性，并且經(jīng)多代自交后農(nóng)藝性狀也基本穩(wěn)定。

M：DL500 DNA Marker；P1：供體親本HS204；P2：受體親本龍?zhí)馗；1～28：BC2F2分離世代圖1 分子標(biāo)記M4-10檢測BC2F2代單株部分結(jié)果Fig.1 Detection of molecular marker M4-10 in partial individuals of BC2F2 population

年份Year品系Lines苗數(shù)Seedlingnumbers抗性級別Resistancegrades13579平均抗級Averageresistantgrades2014100B382980011.63103B4023170001.85CK-R201421032.60CK-S180000189.002015100B372890001.49103B4328150001.70CK-R211421132.81CK-S200000209.00

由改良的抗性保持系回交轉(zhuǎn)育的抗性不育系100A，與恢復(fù)系測交組合的苗期抗性鑒定結(jié)果可知(表2)，不育系100A對褐飛虱已接近高抗水平，其測交組合均表現(xiàn)出不同的抗性水平，其中與恢復(fù)系桂99、明恢63、中恢6號、鹽恢559、R7954(序號1～5)的測交雜種均達(dá)到抗性水平，與恢復(fù)系R2586(自育)的測交種接近高抗水平，與輻恢838的測交種為中抗水平。與自育的抗性恢復(fù)系KR838、KR527、KR30(序號8～10)的測交雜種的抗性級別均小于3，且2個(gè)抗級達(dá)高抗水平。而自育的不育系創(chuàng)ⅠA(對褐飛虱高感)與明恢63、中恢6號(序號11～12)的測交雜種對褐飛虱均表現(xiàn)為高感。這些組合不同的抗性水平說明該抗性基因在不同的雜交稻背景下都能有效表達(dá)，而抗性水平不同說明在不同背景下，抗性的表達(dá)存在差異，另外親本雙方都含有抗性，能有效提高雜交組合的抗性水平。

圖2 改良保持系材料抗褐飛虱鑒定Fig.2 BPH resistance identificationof improved maintainer lines

2.4 測配組合的農(nóng)藝性狀比較

從改良抗性不育系100A與10個(gè)恢復(fù)系測交組合的農(nóng)藝性狀(表3)可以看出，10個(gè)組合中僅組合100A/桂99單株有效穗數(shù)顯著超過對照；除100A/鹽恢559與對照差異不顯著外，其余組合每穗實(shí)粒數(shù)均顯著或極顯著高于對照；除100A/中恢6號、100A/鹽恢559和100A/輻恢838與對照差異不顯著外，其余組合千粒重均顯著或極顯著小于對照；100A/KR527、100A/R2586、100A/明恢63、100A/輻恢838和100A/桂99等組合單株產(chǎn)量顯著高于對照，增幅為14.45 %～49.26 %；說明在同樣的種植條件下，多數(shù)組合具有較好的產(chǎn)量水平。

表2 測配組合的苗期褐飛虱抗性鑒定結(jié)果

表3 測配組合農(nóng)藝性狀表現(xiàn)

注：*表示0.05水平差異顯著；**表示0.01水平差異顯著。

Note:*represented significant difference at 0.05 level, ** represented significant difference at 0.01 level.

3 討論與小結(jié)

如今，分子標(biāo)記輔助選擇已廣泛應(yīng)用于水稻抗性育種，且成功培育了一大批優(yōu)良抗病蟲品系，如劉開雨等[13-14]通過回交、分子標(biāo)記輔助選擇和接蟲鑒定三者相結(jié)合的辦法，將抗稻褐飛虱基因Bph3和Bph24(t)分別導(dǎo)入主栽雜交水稻恢復(fù)系廣恢998、9311、R15、明恢63、R29中；另外采用同樣的方法獲得抗稻白葉枯病和稻褐飛虱的抗性基因Xa21Xa23Bph24(t)聚合系2個(gè)和Xa23Bph24(t)聚合系4個(gè)，雙抗性聚合系對稻白葉枯病達(dá)到高抗水平，對稻褐飛虱的抗性接近高抗水平；胡杰等[15]利用分子標(biāo)記輔助選擇把抗褐飛虱基因Bph14、Bph15同時(shí)導(dǎo)入到汕優(yōu)63的親本明恢63和珍汕97B中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)組合雙親都含抗性基因時(shí)，比只有組合單親一方含有抗性基因的抗性水平高，本研究結(jié)果與其相類似。

野生稻中含有豐富的優(yōu)良基因，而廣西普通野生稻遺傳多樣性無論在居群還是種內(nèi)水平上都十分豐富[16]，在白葉枯、稻瘟病、細(xì)菌性條斑病、褐飛虱、白背飛虱等病蟲害抗性方面擁有豐富的資源[17-20]，同時(shí)一些重要基因如Xa23、Bph14、Bph15等已在生產(chǎn)上發(fā)揮重要作用。選擇好的抗源是抗性育種中首先要解決的問題，本研究的抗源是來自于廣西普通野生稻的高抗?jié)B入系HS204，本研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)利用該抗源對多個(gè)恢復(fù)系進(jìn)行了抗性改良[21]，表現(xiàn)良好，經(jīng)多年連續(xù)鑒定和分析，確定該抗源含有遺傳穩(wěn)定的顯性高抗褐飛虱基因。本研究用此抗源做供體，與保持系龍?zhí)馗雜交和回交，采用分子標(biāo)記輔助選育并結(jié)合苗期鑒定的方法快速篩選出抗性純合的改良株系，在改良后代的低世代即開始選擇農(nóng)藝性較好的株系與不育系龍?zhí)馗測配，選擇對不育系具有保持能力的株系繼續(xù)回交，再結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇及苗期鑒定，連續(xù)多代回交后獲得抗性穩(wěn)定的改良不育系。本研究獲得的抗性保持系和改良中間材料，可為雜交稻抗性不育系的育種提供更好的基因源；獲得的抗性不育系可直接應(yīng)用于三系雜交稻的配組選育，對雜交稻抗褐飛虱育種具有重要應(yīng)用價(jià)值。

[1]程遐年，吳進(jìn)才，馬 飛.褐飛虱研究與防治[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003：1-6.

[2]Jena K K，Jeung J U，Lee J H，et al. High-resolution mapping of a new brown planthopper (BPH) resistance gene，Bph18(t)，and marker-assisted selection for BPH resistance in rice(OryzasativaL.) [J]. Theoretical and Applied Genetics，2006，112(2)：288-297.

[3]羅世友，陳紅萍，吳小燕，等. 應(yīng)用分子標(biāo)記輔助選育抗褐飛虱水稻恢復(fù)系[J]. 分子植物育種，2015，13(11)：2404-2415.

[4]蔣春先.廣西興安地區(qū)稻縱卷葉螟和稻飛虱發(fā)生規(guī)律及遷飛規(guī)律的研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2012.

[5]束兆林，孫庭東，張 芳，等. 烯啶蟲胺對水稻褐飛虱田間控制效果[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，22(9)：89-90.

[6]王蔭長，范加勤，田學(xué)志，等.溴氰菊酯和甲胺磷引起稻飛虱再猖獗問題的研究[J]. 昆蟲知識，1994，31(5)：257-262.

[7]蘇昌潮，程遐年，翟虎渠，等. 水稻抗褐飛虱遺傳和育種研究. 雜交水稻，2003，18(4)：1-6.

[8]王 慧，嚴(yán) 志，陳金節(jié)，等. 水稻抗褐飛虱基因研究進(jìn)展與展望[J]. 雜交水稻，2016，31(4)：1-5.

[9]Wang Y，Cao L，Zhang Y，et al. Map-based cloning and characterization ofBPH29，a B3 domain-containing recessive gene conferring brown planthopper resistance in rice[J]. Journal of Experimental Botany，2015，66(19)：6035-6045.

[10]李玉營，李聲春，李曉方. 分子標(biāo)記輔助選擇聚合水稻抗蟲抗病基因育種研究進(jìn)展[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43(6)：119-126.

[11]李進(jìn)波，夏明元，戚華雄，等. 水稻抗褐飛虱基因Bph14和Bph15的分子標(biāo)記輔助選擇[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，10：2132-2137.

[12]黃所生，黃鳳寬，吳碧球，等. 水稻新品種(組合)對褐飛虱的抗性評價(jià)[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，27(5)：1919-1923.

[13]劉開雨，盧雙楠，裘俊麗，等.培育水稻恢復(fù)系抗稻褐飛虱基因?qū)胂岛途酆舷礫J].分子植物育種，2011，9(4)：410-417.

[14]劉開雨，張?jiān)滦郏瑒?芳，等.水稻抗稻白葉枯病和稻褐飛虱基因聚合系的抗性表現(xiàn)[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，26(5)：1852-1857.

[15]胡 杰，李 信，吳昌軍，等. 利用分子標(biāo)記輔助選擇改良雜交水稻的褐飛虱和稻瘟病抗性[J]. 分子植物育種，2010，8(6)：1180-1187.

[16]黃 娟，楊慶文，陳成斌，等. 廣西普通野生稻的遺傳多樣性及分布特征[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42(8)：2633-2642.

[17]孫恢鴻，農(nóng)秀美，黃福新，等. 廣西野生稻資源抗白葉枯病研究[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，1992，19(3)：237-241.

[18]韋燕萍，黃大輝，陳英之，等. 廣西野生稻資源抗稻瘟病材料的鑒定與評價(jià)[J]. 中國水稻科學(xué)，2009，23(4)：433-436.

[19]黃大輝，岑貞陸，劉 馳，等. 野生稻細(xì)菌性條斑病抗性資源篩選及遺傳分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2008，9(1)：11-14.

[20]李容柏，秦學(xué)毅，韋素美，等. 普通野生稻稻褐飛虱抗性在水稻改良中的利用研究[J]. 廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué)，2003，22(2)：75-83.

[21]郭 輝，馮 銳，張曉麗，等.利用普通野生稻褐飛虱抗性改良水稻恢復(fù)系的研究[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2012，13(3)：492-496.

(責(zé)任編輯 溫國泉)

Development of Three-line Maintainer and Sterile Lines with Resistance to

Brown Planthopper Using Marker Assisted Selection in Rice (OryzasativaL.)

GUO Hui, FENG Rui, CHEN Can, ZHANG Xiao-li, LIU Bai-long, QIN Xue-yi*

Using a high BPH resistance introgression line ‘HS204’ derived from Guangxi wild rice (OryzarufipogonGriff) as donor parent, high resistant maintainer line and sterile materials were bred by hybridization，backcross breeding and molecular marker-assisted selection, in order to provide good material basis for resistance breeding of hybrid rice. The results reflected that four maintainer intermediate materials(100B, 101B, 102B and 103B) and two resistant sterile lines(100A,103A) that homozygous resistant genes were obtained by marker selection, ten hybridized combinations that testcrossed with high resistant sterile line 100A displayed resistance well, 100A/R2586, 100A/KR838 and 100A/KR527 high resistance, and the rest for resistance to medium resistance. The yield per plant of 100A/KR527, 100A/R2586, 100A/MingHui63, 100A/FuHui838 and 100A/Gui99 were significantly higher than that of CK (TeYou7118), an increase range was 14.45 %-49.26 %. These resistant maintainer obtained would provide source gene better for hybrid rice, and sterile line would directlybe applied to three line hybrid rice.

Rice；BPH resistant varieties; Marker-assisted selection (MAS); Maintainer line; Sterile line

1001-4829(2016)12-2769-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.12.001

2016-09-01

國家自然科學(xué)基金地區(qū)基金項(xiàng)目(31560385)；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2012GXNSFDA053008，2014GXNSFB A118066，2015GXNSFAA139060)；廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(桂科AB16380138)；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技發(fā)展基金項(xiàng)目(2015JM06)

郭 輝(1982-)，男，山西臨汾人，碩士，助理研究員，主要從事水稻抗逆資源評價(jià)與遺傳育種研究，E-mail：gh8207@163.com,*為通訊作者，E-mail：qxueyi@gxaas.net。

S511

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