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唐山地區(qū)一種新發(fā)番茄病害的病原菌分離與鑒定

2017-01-09 07:09張運(yùn)峰
關(guān)鍵詞:莖段青枯病潰瘍病

張運(yùn)峰

(唐山師范學(xué)院生命科學(xué)系,河北 唐山 063000)

唐山地區(qū)一種新發(fā)番茄病害的病原菌分離與鑒定

張運(yùn)峰

(唐山師范學(xué)院生命科學(xué)系,河北 唐山 063000)

在唐山地區(qū)發(fā)現(xiàn)一種危害越來(lái)越嚴(yán)重的番茄病害,該病害與文獻(xiàn)報(bào)道的潰瘍病和青枯病類似。對(duì)其病原進(jìn)行分離和鑒定,關(guān)系到對(duì)該病害的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)和防治。從該病害的典型病株上分離獲得2種細(xì)菌TSK-1和TSK-2,分別接種健康植株,TSK-1能夠產(chǎn)生典型癥狀,TSK-2沒(méi)有產(chǎn)生致病性。通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定和16S rDNA測(cè)序鑒定表明,該病菌為密執(zhí)安棒形桿菌密執(zhí)安亞種(Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis)。因此,唐山地區(qū)的種新發(fā)番茄病害為番茄潰瘍病,而不是番茄青枯病。該研究結(jié)果將為控制該病害的發(fā)生起到?jīng)Q定性作用。

番茄潰瘍?。徊≡蛛x;形態(tài)學(xué)鑒定;16S rDNA測(cè)序鑒定

在唐山地區(qū)新發(fā)生一種病害,該病害危害嚴(yán)重,發(fā)病速度快,其癥狀表現(xiàn)為蒸騰作用較強(qiáng)時(shí)植株萎蔫,夜間蒸騰作用較弱時(shí)又和正常植株沒(méi)有明顯區(qū)別,錯(cuò)過(guò)最佳防治時(shí)期后,造成大面積枯萎,明顯減產(chǎn)甚至絕收,病原細(xì)菌可經(jīng)病殘?bào)w和病土壤帶菌傳染,這些癥狀類似番茄潰瘍病和青枯病[1-4]。據(jù)報(bào)道,番茄潰瘍病和番茄青枯病是番茄生產(chǎn)上最為嚴(yán)重的病害,二者最佳防治時(shí)期和技術(shù)手段不同[5],因此,明確其該病害種類是控制該病害危害的前提。

近年來(lái),分子生物學(xué)技術(shù)成為快速、準(zhǔn)確鑒定微生物的重要方法。16S rDNA 普遍存在于原核生物細(xì)胞內(nèi), 其序列具有保守性和特異性相結(jié)合的特點(diǎn), 保守區(qū)為所有細(xì)菌所共有, 細(xì)菌間無(wú)差異; 可變區(qū)在不同細(xì)菌之間存在有不同程度的差異, 具有屬或種的特異性[6],因此,利用16SrDNA進(jìn)行未知微生物的鑒定已得到廣泛的認(rèn)可,成為微生物鑒定的一種有效手段。該技術(shù)已在放線菌[7]、布魯氏菌[8]和假單胞菌[9]等微生物鑒定中得到成功的應(yīng)用,但是單純的16S rDNA技術(shù)存在一定的缺陷,由于進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA PCR 的引物通常為細(xì)菌通用引物,因此需要致病微生物的純培養(yǎng)物,在分離菌株初期不能直接進(jìn)行鑒定。

本試驗(yàn)將在病原菌分離、純化的基礎(chǔ)上,通過(guò)回接試驗(yàn)獲得符合柯赫法則的病菌菌株,然后利用形態(tài)學(xué)鑒定和16S rDNA測(cè)序鑒定,明確其病害種類,為控制該病害的危害提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

番茄病例植株樣本取自河北唐山市番茄種植區(qū)。

1.2 試劑

齊氏石碳酸復(fù)紅染液:A 液:堿性復(fù)紅0.3 g 溶于10 mL 95 %酒精中;B 液:石碳酸5 g 溶于95 mL 蒸餾水中。以上兩液混合,搖勻。

革蘭氏染色液:①草酸銨結(jié)晶紫染液。A 液:結(jié)晶紫2 g 溶于20 mL 95 %酒精中;B 液:草酸銨0.8 g 溶于80 mL 蒸餾水中。以上2種液體混合,搖勻。②95 %乙醇;③盧戈氏碘液:將2 g 碘化鉀溶解在少量水中,再將1 g 碘片溶解在碘化鉀溶液中,待碘全溶后,加水至300 mL。

番紅復(fù)染液:將配好的10 mL 番紅乙醇溶液(2.5 g 番紅溶于100 mL 蒸餾水中)與80 mL 蒸餾水混合均勻。

硝酸銀鞭毛染色液。A 液:?jiǎn)螌幩? g;FeCl31.5 g;蒸餾水100 mL;15 %福爾馬林1 mL;1 % NaOH 1 mL。B 液:2 g AgNO3溶于100 mL 蒸餾水中;TE 緩沖液(pH8.0):10 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA。

細(xì)菌DNA提取試劑盒和TA克隆試劑盒購(gòu)自艾萊德試劑公司。PMD-18 T vector 試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司。16S rDNA序列測(cè)定由上海生工(BBI)完成,選用的16S rDNA通用引物為16S rDNA-F(5′-GCGAATAAGCCCATATCAA3′)和16S rDNA-R(5′CGTCAGGAGG TCGCTAATA-3′[10]),M13通用引物為M13-R(5′-A GAGTTTGATCCT GGCTCAG3′)和M13-F(5′A AGGAGGTGAT CCAGAAGC-3′)。SDS、乙醇、甘油、蛋白酶K、葡萄糖、MgCl2、平衡酚、氯仿、乙醇、異戊醇等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 番茄發(fā)病樣本的采集和病原菌分離[11]

取一段約3 cm長(zhǎng)的病枝,用無(wú)菌超純水沖洗3次,再用75 %的酒精浸泡消毒30 s,然后用無(wú)菌水沖1次;剝?nèi)ネ獗砥ぃ瑢⒔M織團(tuán)塊周邊組織切掉,然后將組織置于LB平板上;每個(gè)平板放置3塊,最后置于30 ℃培養(yǎng)。將病株組織周圍出現(xiàn)的菌落進(jìn)行連續(xù)劃線和稀釋涂布,直到出現(xiàn)單個(gè)菌落,挑取單個(gè)菌落即得病菌純培養(yǎng)物。

1.4 病原菌的形態(tài)觀察

用呂氏美藍(lán)染液對(duì)菌體進(jìn)行簡(jiǎn)單染色[12];然后用革蘭氏染色[13],最后進(jìn)行鞭毛銀染[14]。生物顯微鏡下觀察,Motic images plus2.0軟件下拍照。

1.5 致病菌的回接試驗(yàn)鑒定[15]

在花盆中栽種番茄10株,生長(zhǎng)株高30 cm。將分離獲得的純培養(yǎng)物接種于LB培養(yǎng)基中,37 ℃震蕩培養(yǎng)至OD600=0.5,利用微量注射法將10 μl病原菌液處理植株地面以上3 cm的植株頸部,35 ℃、濕度60 %以上培養(yǎng)。

1.6 細(xì)菌DNA的提取和16S rDNA測(cè)序

按照細(xì)菌DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取純培養(yǎng)物的基因組DNA,使用16S rDNA通用引物擴(kuò)增16S rDNA片段[16],連接到PMD-18T載體中,將30 μl(50 ng/μl)質(zhì)粒PMD-18T-16SrDNA送生工(上海)有限公司測(cè)序。

1.7 TSK-1菌株16S rDNA序列比對(duì)

將TSK-1菌株測(cè)序獲得的16S rDNA序列在GenBank中進(jìn)行檢索和比對(duì),將相似度最高的序列和TSK-116S rDNA序列通過(guò)DANMAN軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄發(fā)病植株樣本的觀察

番茄發(fā)病植株初期表現(xiàn)為白天蒸騰作用較強(qiáng)時(shí)植株萎蔫,夜間蒸騰作用較弱時(shí)植株表現(xiàn)為正常,與正常番茄植株沒(méi)有明顯區(qū)別,且番茄植株莖段局部位置出現(xiàn)干皮現(xiàn)象,腋芽位置出現(xiàn)干燥點(diǎn),腋芽消失;隨著病情的發(fā)展,番茄植株整株緩慢枯萎,莖段部分維管束部位中空(圖 1),初步判斷為潰瘍病或青枯病菌。

圖2 TSK-1菌落(a)、TSK-2菌落(b)形態(tài)Fig.2 TSK-1 colony (a), TSK-2 colonies (b)

a: TSK-1侵染植株結(jié)果;b: TSK-2侵染植株形態(tài)圖3 TSK-1(a)和TSK-2(b)分別侵染番茄莖的植株形態(tài) Fig.3 Tomato plant morphology infected by TSK-1 (a) and TSK-2 (b)

2.2 番茄潰瘍病病原菌的分離及純化培養(yǎng)

樣本組織接種在LB培養(yǎng)基上,經(jīng)過(guò)培養(yǎng)以后,圍繞組織周圍出現(xiàn)細(xì)菌菌苔,然后將菌苔進(jìn)行純化培養(yǎng),獲得2個(gè)細(xì)菌菌株,TSK-1和TSK-2。,菌落形態(tài)特征分別為黃色菌落TSK-1和小型、濕潤(rùn)、粘稠、圓形乳白色菌落TSK-2(圖2)。

2.3 病原菌的回接鑒定

利用微量注射法分別在番茄植株上接種TSK-1和TSK-2,然后將接種菌株放置于30 ℃的溫室中,濕度控制在80 %以上,接種5 d以后。TSK-1接種的番茄植株接種部位(圖4a)和葉柄基部(圖4b)均出現(xiàn)明顯病斑,并且莖段橫向解剖結(jié)構(gòu)顯示植株莖段為中空(圖4c),縱切面解剖結(jié)構(gòu)顯示植株莖段內(nèi)維管系統(tǒng)變?yōu)槟z水狀(圖4d)。而TSK-2接種植株表現(xiàn)為正常,莖段堅(jiān)挺; TSK-1接種的番茄植株表現(xiàn)為明顯的潰瘍病癥狀(圖3),因此,確定TSK-1為致病病原菌。由于TSK-1菌株在LB培養(yǎng)基上呈淺黃色,初步推斷為潰瘍病菌。

a:侵染莖段接種部位;b: 侵染莖段葉芽位置;c:侵染莖段的橫切;d:侵染莖段的縱切圖4 TSK-1侵染番茄莖的解剖結(jié)果Fig.4 Tomato stem growth of canker infection after TSK-1 strain

2.4 TSK-1潰瘍病病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

TSK-1菌株石炭酸復(fù)紅染色后為無(wú)芽孢的彎曲形桿狀細(xì)菌;經(jīng)革蘭氏染色后呈藍(lán)紫色,鑒定為革蘭氏陽(yáng)性菌。經(jīng)硝酸銀鞭毛染色后不具有鞭毛(圖5),這與青枯病菌的具有鞭毛、產(chǎn)芽孢等特征不相符合[17],而符合潰瘍病菌的基本態(tài)特征。

2.5 TSK-1病原菌的16S rDNA鑒定

利用16SrDNA通用引物,病菌DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得1500 bp左右的片段,把該片段連接到載體PMD-18T vector 上,將測(cè)得的序列登陸NCBI(http:/ /www. ncbi. nlm. nih. gov/blast)進(jìn)行Blast比對(duì),其中有1471 bp與Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis菌株DSM46364(Access AM410696)的16S rDNA 序列的相似度達(dá)99.80 %(圖6),由此進(jìn)一步確定,該病菌為番茄潰瘍病病原菌,其病原為密執(zhí)安棒形桿菌密執(zhí)安亞種(Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis)。

圖5 TSK-1齊氏石炭酸復(fù)紅簡(jiǎn)單染色制片(a)、革蘭氏染色制片(b)和硝酸銀鞭毛染色制片(c)Fig.5 TSK-1 Sarkozy′s carbolfuchsin simple staining producer (a) , Gram Films (b) and flagella producer of silver nitrate (c)

圖6 試驗(yàn)分離菌株與潰瘍病菌DMS46364的16S rDNA序列比對(duì)結(jié)果Fig.6 The 16S RDNA sequence alignment results between pathogens strains isolated and DMS 46364

3 討論與結(jié)論

傳統(tǒng)微生物形態(tài)鑒定技術(shù)具有設(shè)備和技術(shù)要求較低,但是存在實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣、實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)的缺點(diǎn)。16SrDNA技術(shù)用于微生物的菌菌株鑒定具有快速、簡(jiǎn)便、精確的優(yōu)點(diǎn),但單一的16SrDNA技術(shù)存在樣本純度要求高等缺陷。隨著技術(shù)的發(fā)展,近年來(lái),研究人員發(fā)展形成了免疫血清學(xué)[17]、熒光定量PCR技術(shù)[18]、質(zhì)譜PCR[19]技術(shù)和EMA-real-time PCR[20],但這些試驗(yàn)手段多用于已知微生物的檢測(cè),且設(shè)備和試驗(yàn)技術(shù)條件要求較高。本試驗(yàn)通過(guò)采用微生物傳統(tǒng)鑒定手段和16SrDNA結(jié)合的方法對(duì)致病菌進(jìn)行了準(zhǔn)確鑒定,確定了該病菌為潰瘍病病菌,表明了該技術(shù)可以用于潰瘍病病原菌的鑒定,該技術(shù)與傳統(tǒng)鑒定方法相比具有操作簡(jiǎn)單、鑒定周期短和準(zhǔn)確度高等特點(diǎn),且設(shè)備和人員技術(shù)的要求低、費(fèi)用較少。

經(jīng)過(guò)與GenBanK中的序列比對(duì),與密執(zhí)安棒形桿菌密執(zhí)安亞種同源性高達(dá)99.80 %,從唐山地區(qū)分離得到得TSK-1是一株番茄潰瘍病菌菌株,該病菌16SrDNA與模型菌株潰瘍病菌DMS46364沒(méi)有形成明顯的差異,推測(cè)該病菌屬于引入型,雖然引起了大面積病害的發(fā)生,但應(yīng)該是初期在唐山地區(qū)形成番茄病害,這一特點(diǎn)與本地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)該病害相契合。進(jìn)一步在本地區(qū)開(kāi)展該類病害的防治研究奠定了基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯 李 潔)

Isolation and Identification of Novel Tomato Disease in Tangshan

ZHANG Yun-feng

(Department of Tangshan Normal University, Hebei Tangshan 063000, China)

A novel tomato disease similar to tomato canker or bacterial wilt has been found more and more serious in the Tangshan area. The isolation and identification of its pathogen is the first thing for the forecast and control of the disease. From typical symptom of the disease, the two kinds of bacteria were isolated:TSK-1 and TSK-2. However, only TSK-1 could produce typical symptoms after inoculated into healthy tomato plants. TSK-2 did not have any pathogenicity. By morphological identification and 16s rDNA sequencing identification, we found that the bacteria isolate TSK-1 wasClavibactermichiganensissubsp.michiganensis. Therefore, the novel tomato disease is tomato canker other than tomato bacterial wilt, which will be helpful to control the disease in Tangshan area.

Tomato canker; Pathogen isolation; Morphological identification; 16S rDNA sequencing identification

1001-4829(2016)12-2854-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.12.016

2015-08-06

河北省自然科學(xué)基金(C2014105067);唐山市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(14120208a);唐山師范學(xué)院科學(xué)研究基金(2015C07)

張運(yùn)峰(1982-),男,石家莊人,講師,碩士,主要從事植物病理學(xué)研究。

S436.412

A

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