譚 艷，王 波，趙瑞琳

(1. 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，四川 成都 610066；2.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南 昆明 650224)

金針菇菌株農(nóng)藝性狀評價與遺傳差異分析

譚 艷1，2，王 波1*，趙瑞琳2

(1. 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，四川 成都 610066；2.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南 昆明 650224)

利用ISSR技術(shù)對29個金針菇菌株進行了遺傳多樣性和農(nóng)藝性狀分析，建立了遺傳相似性聚類圖和農(nóng)藝性狀指標(biāo)。結(jié)果表明，29個金針菇菌株遺傳相似性水平在0.67～0.89，在0.67水平上29個菌株被聚為一個類群，在遺傳相似性水平為0.70上，將29個金針菇菌株分為4個大類群；在農(nóng)藝性狀上存在較大差異，產(chǎn)量上分為高產(chǎn)類、中產(chǎn)類和低產(chǎn)類，生育期上分為早熟和晚熟兩類，子實體形態(tài)特征上分為黃色和白色、粗柄和細柄、基部絨毛分為有和無，建立了金針菇主要農(nóng)藝性狀指標(biāo)。

金針菇；遺傳多樣性；分子標(biāo)記；產(chǎn)量；形態(tài)特征

金針菇是中國主要栽培食用菌之一，年生產(chǎn)量達到240萬余t(2012)，居栽培食用菌中第4位，生產(chǎn)上使用的金針菇品種分為黃色和白色兩大類，工廠化栽培品種為白色、農(nóng)業(yè)栽培品種以黃色為主，因此，開展研究金針菇種質(zhì)資源遺傳背景在金針菇育種和生產(chǎn)上具有重要意義，在金針菇種質(zhì)資源遺傳分析上已開展了研究工作，對金針菇菌株的遺傳多樣性進行分析，分別開展了RAPD、SRAP、ISSR和酯酶同工酶等[1-5]，分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用在食用菌的遺傳多樣性分析上，其中利用較多的分子標(biāo)記為ISSR， ISSR是由Zietkiewicz et al.1994年創(chuàng)建的一種DNA標(biāo)記技術(shù)，與RFLP、RAPD等其它DNA檢測技術(shù)相比，該技術(shù)根據(jù)真核生物中廣泛存在簡單重復(fù)序列的特點，利用在真核生物基因組中常出現(xiàn)的簡單重復(fù)序列本身設(shè)計引物，無需預(yù)先克隆和測序。簡單重復(fù)序列通常為顯性標(biāo)記具有很好的穩(wěn)定性和多態(tài)性。ISSR標(biāo)記已應(yīng)用到食用菌種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性分析、特異標(biāo)記等方面[6-14]；金針菇菌株農(nóng)藝性狀也是反映其遺傳多樣性的重要指標(biāo)，特別是金針菇產(chǎn)量、生育期，以及子實體顏色、菌柄大小、菌柄基部有無絨毛等重要指標(biāo)是反映金針菇菌株是否優(yōu)良的標(biāo)準(zhǔn)，國內(nèi)外在金針菇菌株的農(nóng)藝性狀指標(biāo)建立上還不完善，為此，有必要開展金針菇菌株的遺傳多樣性和農(nóng)業(yè)性狀分析，從分子生物學(xué)和傳統(tǒng)農(nóng)藝性狀上綜合評價金針菇菌株，更能反映金針菇菌株間遺傳差異，對遺傳育種研究和生產(chǎn)應(yīng)用具有重要意義。

表1 供試金針菇菌株與來源

1 材料與方法

1.1 供試菌株與來源

供試菌株與來源見表1所示。

1.2 遺傳差異分析

1.2.1 菌種培養(yǎng)與DNA提取 不同菌株在液體培養(yǎng)基(配方：酵母粉5 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL，pH自然)中培養(yǎng)10 d后，收集菌絲體，加入液氮研磨成粉末后，采用CTAB法提取DNA。

1.2.2 ISSR-PCR擴增 試驗用ISSR引物見表2所示。20 μl PCR擴增反應(yīng)體系：1 μl DNA模板，1 μl Primer，10 μl 2×PCR Master Mix，8 μl ddH2O。PCR擴增反應(yīng)程序為：94 ℃充分變性2.5 min，然后進行10個循環(huán)；94 ℃變性45 s，57 ℃(溫度隨引物變化)退火50 s，72 ℃延伸2 min，接著進行35個循環(huán)；94 ℃變性45 s，47 ℃(溫度隨引物變化)退火50 s，72 ℃延伸2 min；最后72 ℃延伸5 min，10 ℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物在1.5 %的瓊脂糖凝膠上電泳， GoldView染色，以DNA Marker DL2000(大連寶生物工程有限公司)作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，用美國Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)照相。

1.2.3 電泳檢測 取6 μl ISSR擴增產(chǎn)物和1 μl

表2 ISSR擴增所用引物

0.25 %的溴酚藍上樣緩沖液混勻，進行1.6 %瓊脂糖凝膠電泳(含DNAGoldViewTM DNA染料)電泳，4～5 v/cm恒壓電泳40 min，然后通過紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察并照像。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 將ISSR擴增片段進行統(tǒng)計，有ISSR譜帶計為1，無ISSR譜帶計為0，構(gòu)建初始數(shù)據(jù)矩陣，用NTSYSpc2. 1專業(yè)版軟件計算遺傳相似系數(shù)(Nei& Li系數(shù))，以平均連鎖法(UPGMA)進行聚類分析，得出聚類圖譜。

1.3 農(nóng)藝性狀測試

用22 cm×33 cm規(guī)格的聚丙烯塑料袋裝培養(yǎng)基(棉籽殼40 %，棉渣35 %，麩皮15 %，玉米粉8 %，石灰2 %。)，常壓滅菌后，無菌接入栽培種，每個菌株栽培30袋，設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)10袋，22～25 ℃下培養(yǎng)，待菌絲體生長滿袋后，按常規(guī)方法進行出菇管理，出菇溫度為10～15 ℃，以采收2潮菇的產(chǎn)量進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 電泳圖譜

用8個引物分析了29個金針菇菌株，共擴增出991個片段，大小在100～2 000 bp，其中多態(tài)性片段為788個，多態(tài)性比率為79.52 %，其中引物18擴增片段如圖1所示，說明不同金針菇菌株間存在豐富的遺傳多樣性，遺傳變異水平高。

2.2 聚類分析與遺傳多樣性分析

從ISSR聚類樹狀圖可知，29個金針菇菌株遺傳相似性水平在0.67～0.89，在0.67水平上29個菌株聚為一個類群，在遺傳相似性水平為0.70上，將29個金針菇菌株分為4個大類群，類群Ⅰ包括1個菌株，類群Ⅱ包括2個菌株，類群Ⅲ包括24個菌株，類群Ⅳ包括2個菌株；29個金針菇菌株中明金1號與其它菌株雜交遺傳差異較大，遺傳相似系數(shù)為0.67水平，聚為1類群；遺傳相似性水平最高的為0.89，為川金6號與F212；5個野生菌株分別在類群Ⅱ和類群Ⅲ，位于類群Ⅱ的野生菌株與栽培菌株遺傳差異最大(圖2)。

M:引物 M:Marker圖1 引物18對金針菇供試菌株擴增的ISSR 電泳圖譜Fig.1 Electrophoretogram of Flammulina velutipes strains amplified with 18# ISSR primer

圖2 用8個ISSR引物擴增的29個金針菇菌株聚類圖Fig.2 Dendrogram on 29 strains of Flammulina velutipes with 8 ISSR primers

2.3 農(nóng)藝性狀評價

2.3.1 生育期與產(chǎn)量分析 對29個菌株進行分析，結(jié)果表明，生育期在54～67 d，相差13 d，可將29個金針菇菌株分為早熟和晚熟2類，早熟的生育期在54～57 d，晚熟的生育期為65～67 d，平均產(chǎn)量在346.56～533.38 g/袋，生物學(xué)效率在59.72 %～88.90 %(表2)，根據(jù)產(chǎn)量可將金針菇29個菌株分為高產(chǎn)類、中產(chǎn)類和低產(chǎn)類，生物學(xué)效率85 %以上的為高產(chǎn)類、71 %～84 %為中產(chǎn)類， 70 %以下的為低產(chǎn)類，29個菌株中高產(chǎn)類占17.2 %，中產(chǎn)類占65.6 % %，低產(chǎn)類占17.2 %。

表2 金針菇29個菌株生育期與產(chǎn)量比較

續(xù)表2 Continued table 2

菌株Strains生育期(d)Growthperiod平均產(chǎn)量(g/袋)Averageyield生物學(xué)效率(%)Biologicalefficiency顯著差異Significantlydifferentlevels0.050.01F6124957438.5673.09efghDEFG江山白菇65436.5072.75efghDEFG川金4號54436.4472.74efghDEFG金雜1957432.0072.00efghDEFGF215357431.9371.99efghDEFGF710157427.8571.31fghEFGFNK130266415.7469.29ghFGHF61154412.3168.72hGH金白F467406.7567.79hGHIFKS120265358.3059.72iHIF90254346.5657.76iI

2.3.2 子實體主要性狀 29個金針菇菌株子實體顏色分為黃色和白色2大類，其中前者有22個，后者有 7個，黃色金針菇菌株中菌蓋顏色分為黃色和淺黃色2類，其中前者有22個，后者有7個；子實體菌柄大小分為粗柄型和細柄型2大類，其中前者有24個，后者有5個；黃色金針菇菌株中菌柄顏色分為淺黃色和黃白色2大類，其中前者有16個，后者有5個，白色金針菇菌株的菌蓋和菌柄均為白色，并且不受光照影響(表3)。

表3 金針菇子實體形態(tài)特征

續(xù)表3 Continued table 3

菌株Strains形態(tài)特征 Morphologicalcharacteristics菌蓋顏色Colorofcap菌柄類型Typeofstipe菌柄顏色Colorofstipe絨毛Fluff川金4號淺黃色粗柄型淺黃色無金雜19淺黃色細柄型黃白色有F2153淺黃色細柄型黃白色有F7101黃色粗柄型淺黃色有FNK1302白色細柄型白色有F611黃色粗柄型淺黃色有金白F4白色粗柄型白色有FKS1202白色粗柄型白色有F902黃色粗柄型淺黃色有

3 討 論

3.1 金針菇菌株遺傳多樣性

利用ISSR分子標(biāo)記對金針菇29個菌株的遺傳多樣性進行分析，能顯示其菌種間遺傳差異，除白色金針菇FKS1202與供試的其它菌株遺傳差異較大外，其余白色金針菇菌株與黃色金針菇菌株還不能區(qū)別開來，如果要建立金針菇農(nóng)藝性狀與分子標(biāo)記的相關(guān)性，需要進一步開發(fā)分子標(biāo)記。建立農(nóng)藝性狀與分子標(biāo)記的相關(guān)性，對開展金針菇遺傳育種具有重要作用。有關(guān)農(nóng)藝性狀的標(biāo)記，只在白色金針菇的白色性狀上建立了SCAR特異性標(biāo)記，利用該標(biāo)記能鑒定出黃色和白色性狀[15]。

3.2 金針菇菌株農(nóng)藝性狀

29個金針菇菌株在農(nóng)藝性狀上存在多樣性，顏色上分為黃色和白色兩大類，黃色金針菇菌株又可分為黃色和淺黃色兩類，淺黃色金針菇菌株可能是黃色金針菇菌株與白色金針菇菌株間雜交選育的，如川金菇3號和川金6號是以黃色金針菇與白色金針菇雜交選育的品種，子實體顏色為淺黃色；金針菇菌株在生育期上存在較大差異，可分為早熟和晚熟兩大類，黃色金針菇菌株均為早熟類型，白色金針菇有早熟和晚熟兩類，早熟白色金針菇菌株川金5號和F3W4為早熟黃色金針菇菌株與晚熟白色金針菇菌株雜交選育的，具有早熟黃色金針菇的特性，但子實體顏色為白色[16]；金針菇子實體菌柄性狀是重要的商品性狀之一，生產(chǎn)上使用的優(yōu)良金針菇菌株菌柄粗壯、顏色近白色或者白色、基部無絨毛。建立金針菇菌株子實體性狀指標(biāo)對開展金針菇品種選育具有重要作用。金針菇栽培模式多種多樣，分為農(nóng)業(yè)栽培模式、人工控制溫度下的設(shè)施栽培模式和工廠化栽培模式等，不同栽培模式適宜不同的栽培品種。供試的29個金針菇菌株還需在不同栽培模式下進行試驗，對其產(chǎn)量、生育期和子實體形態(tài)特征進行測試，以確定其適宜的栽培模式，為選育適宜不同栽培模式下的金針菇菌株提供育種材料。

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(責(zé)任編輯 陳 虹)

Evaluation of Agronomic Traits and Analysis of Genetic Diversity forFlammulinavelutipes

TAN Yan1,2,WANG Bo2*,ZHAO Rui-lin1

(1. Soil and Fertilizer Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Sichuan Chengdu 610066, China； 2.College of Forestry, Southwest Forestry University, Yunnan Kunming 650224, China)

We had established genetic comparability dendrogram and agronomic traits index by means of analyzing the genetic diversity and agronomic traits of 29Flammulinavelutipesstrains by ISSR, the results showed that the genetic comparability coefficient was between 0.67 and 0.89. They were clustered one group at comparability coefficient 0.67 while four groups at 0.89. There ware conspicuous differences in agronomic traits, high, middle and low in the yield, early maturing and late maturing in the growth period, some traits of the fruit body, such as yellow or white on the color, thick or thin of the stipe, with the fluff or not on the stem base, which helped to establish the major agronomic traits index ofFlammulinavelutipes.

Flammulinavelutipes; Genetic diversity; Gonocular marker; Yield; Morphological characteristics

1001-4829(2016)12-2965-06

10.16213/j.cnki.scjas.2016.12.035

2014-09-02

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金(CARS-24)

譚 艷(1988-)，女，在讀碩士研究生，從事食用菌遺傳育種研究，E-mali:snjtanyan@yeah.net，*為通訊作者，E-mail:4504292@163.com。

S646.1+5

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