宋娜娜，柴志欣，胡 丹，向 超，鐘金城

(1.西南民族大學(xué) 動物遺傳育種學(xué)國家民委-教育部重點實驗室，四川 成都 610041；2.西南民族大學(xué) 青藏高原研究院，四川 成都 610041)

西藏牦牛POU1F1基因的多態(tài)性及其與生長性狀的相關(guān)性分析

宋娜娜1,2，柴志欣1,2，胡 丹1,2，向 超1,2，鐘金城1.2*

(1.西南民族大學(xué) 動物遺傳育種學(xué)國家民委-教育部重點實驗室，四川 成都 610041；2.西南民族大學(xué) 青藏高原研究院，四川 成都 610041)

本研究利用DNA池和測序技術(shù)，結(jié)合PCR-RFLP方法，篩查了POU1F1基因第2外顯子和第5內(nèi)含子的SNP位點，分析了西藏申扎(SZ)、類烏奇(LWQ)、斯布(SB) 和帕里(PL)4個牦牛類群(品種)共182個個體的POU1F1基因的多態(tài)性及其與體重、體高、體長等生長性狀指標之間的相關(guān)性。結(jié)果表明：①POU1F1基因第2外顯子高度保守，未發(fā)現(xiàn)任何突變，第5內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)2個突變位點，分別為T727C(BglII酶切)位點和T284C(StuI酶切)位點。② 申扎(SZ)、類烏奇(LWQ)、斯布(SB)和帕里(PLl)4個群體中StuI位點為中度多態(tài)性，其基因T/C頻率分別為：0.61/0.39、0.54/0.46、0.54/0.46和0.62/0.38，BglII位點為低度多態(tài)性；Hardy-Weinberg檢驗表明StuI位點和BglII位點均處于平衡狀態(tài)(P>0.05)。③StuI位點在4個群體中表現(xiàn)CC、CT和TT 3種基因型，BglII位點在4個群體中只表現(xiàn)CT和TT 2種基因型。④帕里牦牛StuI位點CC和CT基因型在生長性狀上存在顯著差異(P<0.05)，其中CC基因型的體高和體長均高于CT基因型，而其他幾個牦牛類群未發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。BglII位點基因型與生長指標的相關(guān)性不顯著。西藏牦牛POU1F1基因內(nèi)含子5內(nèi)T284C基因座表現(xiàn)的多態(tài)性可以作為改良其生長性狀的一個遺傳標記。

西藏牦牛；POU1F1基因；PCR-RFLP；多態(tài)性；生長性狀

牦牛是青藏高原的特有牛種，是典型的耐高寒、耐低氧動物，主要產(chǎn)于海拔3000 m以上的青藏高原地區(qū)[1]。西藏是我國牦牛的主產(chǎn)區(qū)之一，西藏牦牛因各地區(qū)氣候和生態(tài)環(huán)境條件的差異，形成了不同的品種或類群，是西藏農(nóng)牧業(yè)發(fā)展的重要支撐。與牦牛經(jīng)濟指標相關(guān)性狀的研究對牦牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有重要作用[2-3]，對促進牦牛產(chǎn)業(yè)快速、高效發(fā)展，提高牦牛的生長性狀尤為重要[4]。

POU1F1(POU domain, class 1, transcription factor 1,POU1F1)是第1個被鑒定為垂體釋放因子的組織特異性轉(zhuǎn)錄因子，具有高度保守的POU結(jié)構(gòu)域[5-6]，能夠識別POU1F1的啟動子激活基因轉(zhuǎn)錄，主要在垂體前葉腺中參與正向調(diào)控生長激素(Growth Hormone, GH)、催乳素(Prolactin, PRL)和促甲狀腺B激素(Thyroid-Stimulating Hormone B, TSHB)基因的表達[7-8]。當編碼基因發(fā)生變異時，導(dǎo)致垂體發(fā)育不全，致使三種基因表達受阻，多種垂體激素缺乏，嚴重影響生物的發(fā)育，導(dǎo)致個體矮小現(xiàn)象[9]。POU1F1還是垂體催乳素細胞、甲狀腺細胞、促生長激素細胞分化的重要轉(zhuǎn)錄因子，而且發(fā)現(xiàn)POU1F1在這些細胞中可能有其他作用，Herman等[10]通過對全基因組研究確定其為潛在的新靶點基因，并通過該因子調(diào)控下游網(wǎng)絡(luò)。牛的POU1F1基因位于1號染色體上，全長為15 945 bp，包含6個外顯子和5個內(nèi)含子[11]。限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)是在20世紀末提出的DNA標記方法，RFLP是指基因型之間限制性片段長度的差異，通過酶切后的圖譜能夠準確說明缺失或突變的位點[12-13]。近年來很多學(xué)者相繼對牦牛的多態(tài)性進行了研究[14-17]。鑒于POU1F1基因?qū)μ岣哧笈ＩL性狀的重要作用，且與其相關(guān)的報道較少，因此，本研究將通過對西藏牦牛POU1F1基因進行SNP檢測，并分析多態(tài)性與西藏牦牛生長性狀的相關(guān)性，以期篩選出有效的遺傳標記，為優(yōu)化西藏牦牛選育體系及新品系的選育提供初步的科學(xué)根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取西藏申扎(70頭)、類烏奇(48頭)、帕里(28頭)和斯布(36頭)4個牦牛品種(類群)共182個成年健康個體，采集耳組織樣品，75 %酒精保存，帶回實驗室，-80 ℃保存?zhèn)溆?。同時測定體重、體高、體長、胸圍、管圍等生長指標。

1.2 方法

構(gòu)建DNA池，以DNA池為模板對設(shè)計的引物進行PCR擴增，對擴增片段測序結(jié)果圖進行分析及綜合DNAMAN比對結(jié)果，得到突變位點。

1.3 試劑與總DNA的提取

DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；TaqDNA預(yù)混酶和限制性內(nèi)切酶BglII及StuI購自大連寶生物公司。用DNA提取試劑盒，提取總DNA，配制1 %的瓊脂糖凝膠，EB染色，紫外照射觀察，驗證總DNA，-20 ℃保存。

1.4 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank 上發(fā)表的牛POU1F1基因序列(Accession No:AC000158)，利用Primer 5.0軟件設(shè)計3對引物(表1)。對第2外顯子設(shè)計1對引物，對第5內(nèi)含子設(shè)計2對引物，引物由英濰捷基(上海)生物技術(shù)有限公司合成。

1.5 PCR擴增

PCR反應(yīng)體系(15 μl)：ddH2O 5.7 μl，上下游引物各0.6 μl，模板0.6 μl，2×longTaqDNA預(yù)混酶7.5 μl。PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠檢測。

PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，退火30 s(退火溫度為50.5和59.1 ℃)，72 ℃延伸1 min 40 s，共30個循環(huán)；72 ℃后延伸6 min。

將PCR擴增產(chǎn)物用BglII和StuI進行酶切，20 μl酶切反應(yīng)體系：ddH2O 8.8 μl，PCR產(chǎn)物8 μl，內(nèi)切酶1.2 μl，緩沖液2 μl，金屬浴37 ℃ 11 h，酶切產(chǎn)物經(jīng)2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，通過凝膠成像系統(tǒng)拍照來確定酶切圖譜的基因型。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因SNPs位點的篩查和檢測

將以DNA池為模板PCR產(chǎn)物進行直接測序，獲得了3個片段，從圖1可知，其中第2外顯子片段高度保守未發(fā)現(xiàn)突變，第5內(nèi)含子POU1F1-5-1片段發(fā)現(xiàn)T284C位點，POU1F1-5-2片段發(fā)現(xiàn)T727C位點。經(jīng)酶切在線分析工具分析得到T284C和T727C兩位點分別使用StuI和BglII內(nèi)切酶。

表1 牦牛POU1F1基因的引物序列

圖1 POU1F1-5-1 和POU1F1-5-2片段測序Fig.1 The sequencing of POU1F1-5-1 and POU1F1-5-2 fragment

2.2 PCR-RFLP分析

第5內(nèi)含子的兩對引物PCR擴增后的長度分別為534和1 519 bp，POU1F1-5-1擴增片段經(jīng)StuI酶切后表現(xiàn)出多態(tài)性(圖1)，表現(xiàn)534、250和284 bp條帶，泳道1為CT基因型；泳道2、5、7為CC基因型；泳道3、4、6、8為TT基因型。POU1F1-5-2擴增片段經(jīng)BglII酶切后表現(xiàn)出多態(tài)性(圖2)，表現(xiàn)727和792 bp條帶，泳道1～6和8～12為TT基因型；泳道7為CT基因型，未見CC基因型。

2.3 基因型頻率、等位基因頻率及χ2檢驗

POU1F1基因中T284C和T727C這2個SNP位點等位基因及基因型在4個類群中的分布頻率(表2)。T284C位點中，雜合基因型TC在申扎、類烏齊、斯布3個類群中的分布頻率為0.51、0.54和0.64，均表現(xiàn)為優(yōu)勢基因型；而等位基因T在申扎和帕里2個類群中的分布頻率分別為0.61和 0.62，為優(yōu)勢等位基因。而在T727C位點中，未發(fā)現(xiàn)CC基因型個體，TT基因型個體的的分布頻率分別為0.91、0.96、0.94、0.92，是明顯的優(yōu)勢基因型，同時得出T為優(yōu)勢等位基因。

1：CT型；2，5、7是CC型；3、4、6、8是TT型；M:Marker1:Genotype CT; 2, 5, 7:Genotype CC; 3, 4, 6, 8:Genotype TT; M:Marker圖2 申扎牦牛POU1F1-5-1片段PCR產(chǎn)物StuI酶切電泳圖Fig.2 Electrophoresis patterns of digesting PCR products of POU1F1-5-1 fragment with StuI

1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、12：TT型；7：CT型；M：Marker1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12:Genotype TT; 7:Genotype CT; M:Marker圖3 申扎牦牛POU1F1-5-2片段PCR產(chǎn)物BglII酶切電泳圖Fig.3 Electrophoresis patterns of digesting PCR products of POU1F1-5-2 fragment with BglII

對POU1F1基因的T284C位點和T727C位點進行Hardy-Weinberg平衡的χ2檢驗(表3)。結(jié)果表明，4個群體在T284C、T727C2個位點均處于遺傳平衡狀態(tài)(P>0.05)，χ2值均未達到顯著水平，推測可能是經(jīng)過長期自然選擇、人工選擇，達到了遺傳平衡狀態(tài)。

表2 4個牦牛類群POU1F1基因2個SNP位點等位基因及基因型頻率

續(xù)表2 Continued table 2

牦牛類群Yakgroups基因和基因型Geneandgenotype突變位點(Loci)T284CT727C數(shù)量Quantity頻率Frequency數(shù)量Quantity頻率FrequencyCC90.1900T-0.54-0.98C-0.46-0.02斯布(SB)TT50.22340.94TC230.6420.06CC80.1400T-0.54-0.97C-0.46-0.03帕里(PL)TT120.43250.92TC110.3920.07CC50.1800T-0.62-0.96C-0.38-0.04

表3 4個牦牛類群POU1F1基因2個SNP位點的Hardy-Weinberg平衡的χ2 檢驗

2.4 遺傳多態(tài)性指標

由表4可知，T284C位點在4個類群中均處于中度多態(tài)(0.25

表4 4個牦牛類群POU1F1基因2個SNP位點的遺傳多態(tài)性指標

表5 帕里牦牛POU1F1基因StuI位點對體尺性狀的影響(平均數(shù)±標準誤)

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:The different scripts(a,b) mean difference significantly(P<0.05).

2.5 帕里牦牛POU1F1基因StuI位點多態(tài)性和生長性狀相關(guān)性

通過SPSS分析4個群體兩個酶切位點與體尺性狀的相關(guān)性(表5)，結(jié)果得出帕里牦牛CC和CT基因型個體存在顯著差異(P<0.05)。3種基因型與體高和體長之間有相關(guān)性，CT型個體體長為133.64 cm，CC型個體為124.50 cm，前者比后者高出9.14 cm，差異顯著，說明西藏牦牛POU1F1基因第5內(nèi)含子的StuI位點可能是影響體尺性狀的重要功能基因座。

3 討 論

3.1 西藏牦牛POU1F1基因的多態(tài)性

POU1F1基因能正向調(diào)控生長激素、催乳素和垂體釋放激素，對動物早期胚胎及整個生長期生長發(fā)育起到重要的調(diào)控作用。因此，很早以前POU1F1基因就已作為生長性狀主要的候選基因。宋成義等[18]通過對豬POU1F1基因啟動子多態(tài)性分析闡明其與生長性狀的關(guān)聯(lián)性，其AA 基因型個體的體長、體重、體高、胸圍和顯著高于其他2個基因型個體。邱國宇等[19]利用PCR-RFLP方法在郟縣紅牛POU1F1基因第6外顯子發(fā)現(xiàn)HinfI、AluI、PstI 3個酶切位點，且BB基因型對郟縣紅牛生長發(fā)育性狀有顯著影響。牛志剛等[20]對新疆褐牛POU1F1基因進行多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)部分基因型與體重有顯著相關(guān)。Sadeg等[21]研究發(fā)現(xiàn)，伊朗地方綿羊POU1F1基因多態(tài)性與體重顯著相關(guān)。

本文通過對西藏4個牦牛類群POU1F1基因外顯子2及內(nèi)含子5上酶切突變位點與體尺性狀的研究，探尋與生長性狀相關(guān)的候選基因，從分子角度來提高牦牛的經(jīng)濟性狀。4個類群中T為優(yōu)勢等位基因，CT基因型為優(yōu)勢基因型。χ2和Hardy-Weinberg 平衡性檢測可知西藏牦牛4種群均處于平衡狀態(tài)(P>0.05)，受選擇、基因突變等影響較小，可能是4個群體在人工選育過程中對BglII和StuI座位選擇壓力不強，兩座位在人工選育、遷徙和遺傳漂變下處于動態(tài)平衡中。由多態(tài)信息含量(PIC)、純合度(Ho)、雜合度(He)檢測結(jié)果可知T284C位點在4個種群均屬于中度多態(tài)位點，可以作為該群體遺傳資源評價的建議性指標，T727C的低度多態(tài)可能是遺傳分化程度較低，缺乏與其他種群的基因交流，可能在該位點的遺傳變異程度較小，突變少，使得基因的純合型得以積累。T284C位點雜合度相對較大，遺傳變異程度越高，利用前景較大。T727C位點的純合度均達到90 %以上，說明該位點遺傳變異程度低，基因交流少。

在T727C位點位發(fā)現(xiàn)CC型個體，原因可能：①CT、TT型優(yōu)勢個體在自然選擇過程中中已趨于穩(wěn)定，是群體固有的遺傳特性；②由CT、TT型到CC型轉(zhuǎn)變的個體較少，可能存在不利突變，使得突變后的個體母牛難產(chǎn)率增大；③也可能因?qū)嶒灅颖緮?shù)較少，基因型在群體中分布不均。本研究結(jié)果與魏伍川等[22]在對雷州黃牛GAD1和GHR基因的多態(tài)性分析時，只發(fā)現(xiàn)BB、AB型個體未發(fā)現(xiàn)AA型個體的研究結(jié)果一致，推測可能是AA 型個體在生長過程因采食量偏少、生長慢而被較早淘汰。馬彥男等[23]在對中國荷斯坦牛FASN基因多態(tài)性對泌乳的影響的研究中也未發(fā)現(xiàn)BB型個體。

3.2 POU1F1 基因多態(tài)性與生長性狀的關(guān)系

通過不同基因型和生長指標的關(guān)聯(lián)分析，4個群體中，T284C 位點在帕里牦牛中CC/CT之間有顯著差異(P<0.05)，其他幾個牦牛類群卻未見相同結(jié)果。而T727C位點與牦牛體尺無相關(guān)性。

本研究對POU1F1第5內(nèi)含子的多態(tài)性和生長指標進行相關(guān)性分析，結(jié)果第5內(nèi)含子的BglII多態(tài)位點對生長指標無顯著影響。與Curi等[24]研究不同品種牛POU1F1基因與生長性狀的關(guān)聯(lián)性，得出未對生長和胴體性狀產(chǎn)生任何影響的結(jié)果一致，與劉波等[25]通過對秦川牛及其雜種牛POU1F1基因多態(tài)性研究得出第5內(nèi)含子的HinfI 多態(tài)位點對其胸圍、體高，十字部高有顯著影響的的結(jié)果存在差異。薛愷等[26]對POU1F1基因?qū)δ详柵ＩL發(fā)育性狀的影響，得出POU1F1-HinfI位點BB型為優(yōu)勢基因型與生長指標有相關(guān)性(P<0.05)，闡述了不同的基因型是南陽牛生長多樣性主要的原因。通過以上結(jié)果對比表明雖然同屬牛種但是受遺傳因素、環(huán)境因素等影響仍存在較大差異。近些年來越來越多的研究表明，POU1F1基因不僅可以作為牛生長性狀和其他物種生長性狀的候選基因，還可以作為肉質(zhì)、產(chǎn)奶等經(jīng)濟性狀的候選基因。Stasio等[27]研究表明POU1F1基因與牛的肉質(zhì)相關(guān)。Zakizadeh等[28]得出POU1F1基因與牛的產(chǎn)奶相關(guān)。Mura等[29]得出POU1F1基因與奶薩爾達綿羊產(chǎn)奶相關(guān)。lin[30]研究還發(fā)現(xiàn)POU1F1復(fù)合型基因的多態(tài)性對生產(chǎn)性狀有重要影響。

本研究POU1F1-StuI多態(tài)位點對帕里牦牛體高、體長指標存在顯著性影響的結(jié)果可為今后研究提供一定的參考依據(jù)，因樣本數(shù)量的制約，因此進一步的研究將加大樣本容量，以得出更詳細的試驗結(jié)論，為POU1F1基因作為與生長性狀候選基因提供依據(jù)。

4 結(jié) 論

西藏牦牛POU1F1基因存在一定的遺傳多態(tài)性，在POU1F1基因第5內(nèi)含子處篩選出兩個SNP位點，分別為T284C和T727C位點，且POU1F1基因內(nèi)含子5上T284C基因座對帕里牦牛的體高和體長有較為顯著的影響，可以用來作為優(yōu)化選育體系的一種遺傳標記。

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(責任編輯 李 潔)

Association of Polymorphism ofPOU1F1 Gene with Growth Traits in Tibetan Yak

SONG Na-na1,2, CHAI Zhi-xin1,2, HU Dan1,2, XIANG Chao1,2, ZHONG Jin-cheng1,2*

(1.Key Laboratory of Animal Genetics and Breeding of State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education，Southwest University for Nationalities，Sichuan Chengdu 610041，China；2. Institute of Tibetan Plateau Research，Southwest University for Nationalities，Sichuan Chengdu 610041，China)

This research on the use of DNA pool and sequencing technology, the PCR-RFLP method, was conducted to study the correlation of polymorphisms ofPOU1F1 gene and growth traits of Shenzha Yak, Leiwuqi Yak, Sibu Yak, Pali Yak by screening the SNP locus of gene exons 2 and intron 5 with three pairs of primer, a total of 182 yaks. The results showed that(i) no polymorphism was found atPOU1F1 gene exon 2,which was highly conserved, two polymorphisms were found in intron 5, they were respectively T727C locus(BglII) and T284C locus(StuI).(ii) In four populations of SZ, LWQ, PL, SB,StuI locus belonged to the middle polymorphic index, moreover, the frequencies of T/C alleles were respectively 0.61/0.39, 0.54/0.46, 0.54/0.46 and 0.62/0.38, CT was a predominant genotype and T was a predominant allele.StuI locus belonged to the low polypeptide.StuI andBglII locus were under Hardy-Weinberg equilibrium(P>0.05).(iii)StuI locus of four groups were found three genotype with CC, CT and TT. Only two genotypes(CT and TT) were found atBglII locus.(iv)The correlation of polymorphisms betweenPOU1F1 gene and growth traits among the four populations was analyzed. In Pali Yak,the results showed that Genotype CC and TT were highly associated with body length and body height(P<0.05), genotype CC was higher than that genotype CT, the same result did not appear in the left three population. The correlation betweenBglII locus and growth index was not significant. T284C locus polymorphism atPOU1F1 intron 5 of Tibetan yak can be as a genetic marker for improved growth traits.

Tibetan Yak;POU1F1gene; PCR-RFLP; Gene polymorphism; Growth traits

1001-4829(2016)12-2904-07

10.16213/j.cnki.scjas.2016.12.040

2015-12-24

西南民族大學(xué)研究生創(chuàng)新型科研項目(CX2015S Z103)；國家支撐計劃課題(2012BAD03B02)

宋娜娜(1990-)，女，黑龍江綏化人，碩士生，主要從事基因組與分子生物學(xué)研究，E-mail：songnana28@126.com；*為通訊作者：鐘金城(1963-)，教授，E-mail：zhongjincheng518@126.com。

S823

A