楊偉克，唐芬芬，劉增虎，鐘 健，董占鵬

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101)

饑餓對家蠶DefensinA和DefensinB表達(dá)水平的影響

楊偉克，唐芬芬，劉增虎，鐘 健，董占鵬*

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101)

通過不同時(shí)間饑餓處理5齡3 d家蠶，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測脂肪體DefensinA和DefensinB表達(dá)情況。結(jié)果顯示，家蠶饑餓處理8，16，24 h后，DefensinB表達(dá)量均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，其中饑餓16 h時(shí)DefensinB表達(dá)量上調(diào)最為明顯，而DefensinA幾乎無上調(diào)表達(dá)趨勢。結(jié)果說明饑餓脅迫能誘導(dǎo)抗菌肽基因DefensinB的表達(dá)。

家蠶；饑餓；DefensinA和DefensinB； 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

抗菌肽(Antibacterial pepetides，AMPs)是一類普遍存在的防御性蛋白質(zhì)，具有分子量小、理化性能穩(wěn)定和廣譜抗菌等特點(diǎn)，在昆蟲先天免疫防御系統(tǒng)(體液免疫和腸道免疫)中發(fā)揮著重要的作用[1-2]。目前對家蠶抗菌肽基因表達(dá)調(diào)控的研究大多集中在生物因素(喂食或注射微生物)或特定化學(xué)因素(脂多糖LPS和肽聚糖PGN等)誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)模式[3-5]，物理和環(huán)境脅迫等因素誘導(dǎo)家蠶抗菌肽基因表達(dá)的研究相對較少。

昆蟲防御素(Insect defensins)是一類富含半胱氨酸的陽離子抗菌肽，通常含有6個(gè)保守的半胱氨酸(Cys)殘基，形成3個(gè)分子內(nèi)二硫鍵(Cys-Cys)，呈反向平行折疊結(jié)構(gòu)[6-7]。最近在對家蠶抗菌肽基因的研究中發(fā)現(xiàn)2個(gè)defensin成員，即DefensinA和DefensinB[8-9]。

眾所周知，昆蟲不但生活在充滿各種微生物的環(huán)境中，隨時(shí)隨地受到細(xì)菌、真菌、病毒的挑戰(zhàn)，同時(shí)也受到多種環(huán)境脅迫的影響，比如饑餓的威脅、溫度和濕度的變化等[10-11]。環(huán)境脅迫可能對昆蟲造成2方面的不良影響：一是影響昆蟲的生長、發(fā)育、生殖，二是影響昆蟲的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致昆蟲防御外源異物侵襲能力的下降。

本研究對鱗翅目昆蟲家蠶進(jìn)行饑餓處理，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對家蠶脂肪體2個(gè)抗菌肽基因DefensinA和DefensinB的表達(dá)進(jìn)行定量檢測和分析，探討?zhàn)囸I對DefensinA和DefensinB表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

供試家蠶為932品系，人工孵化，在恒溫培養(yǎng)箱于25 ℃桑葉飼養(yǎng)至5齡3 d的幼蟲。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

1.2 試驗(yàn)主要儀器和試劑

主要儀器：PCR擴(kuò)增儀，瓊脂糖凝膠電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)，低溫高速離心機(jī)，恒溫培養(yǎng)箱。主要試劑：Trizol Reagents(Invitrongen公司)，ReverTra Ace和Real-Time PCR Master Mix(TOYOBO公司)等。

1.3 方法

1.3.1 饑餓處理及樣品采集 取發(fā)育良好、體重和大小相當(dāng)?shù)募倚Q5齡3 d幼蟲，分成2組：一組進(jìn)行饑餓處理，另一組為對照。饑餓組從5齡3 d上午9:00時(shí)開始停止喂食，對照組正常進(jìn)食，在饑餓處理8、16和24 h后，分別從對照組和饑餓組取10頭家蠶幼蟲，用脫脂棉蘸取75 %的酒精進(jìn)行體表消毒、晾干，將家蠶表皮剪開，用鑷子刮取脂肪體，每次取樣均設(shè)3次重復(fù)，樣品收集后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 總RNA的提取及檢測 按照TRIzol Reagent RNA試劑盒操作說明提取脂肪體RNA，將得到的總RNA用試劑盒純化，并用DNase I處理以去除基因組DNA。通過上述方法制備的RNA，用1 %瓊脂糖TBE凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，UVP凝膠成像系統(tǒng)紫外燈下觀察并記錄RNA樣品的抽提效果。用無RNase水稀釋2 μl總RNA樣品至100 μl，在核酸蛋白分析儀上分別測出OD260、OD280、OD260/OD280的值，取OD260/OD280比值在1.70～2.0的樣品，用于下一步實(shí)驗(yàn)。并根據(jù)RNA的OD260值算出總RNA樣品的濃度。

RNA濃度(μg/mL)=(△A260nm/0.024×L)×稀釋倍數(shù)

1.3.3 cDNA第一鏈的合成 按照TOYOBO公司 ReverTra Ace試劑使用說明書進(jìn)行，在無RNAase的離心管中加入下列各物質(zhì)：RNA 0.4 μg，Oligo(dT) 25 pmoles，5×Buffer 4 μl，dNTPs (10 mM) 2 μl, ReverTra Ace (100 U/μl) 1 μl，RNase Inhibitor 20 U，DEPC水補(bǔ)足體積，反應(yīng)總體積20 μl，置42 ℃下反應(yīng)30 min，反應(yīng)產(chǎn)物作為普通PCR擴(kuò)增和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的模板。

1.3.4 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GeneBank中收錄的DefensinA(登錄號：AB367525)、DefensinB(登錄號AB428671)和內(nèi)參基因Ribosomal protein 49(RP49，登錄號：NM_001098282)序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier5.0設(shè)計(jì)引物。實(shí)驗(yàn)所用的引物序列及擴(kuò)增片段長度見表1。

1.3.5 目的基因的PCR擴(kuò)增 利用表1中的特異性引物，以反轉(zhuǎn)錄得到的家蠶cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。按照TaKaRa公司 TaKaRaTaqTM試劑盒使用說明書進(jìn)行。PCR反應(yīng)程序：94 ℃，5 min → (94 ℃，30 s → 55～65 ℃，30 s→72 ℃，30 s)× 33 cycles → 72 ℃，10 min → 4 ℃，∞。用2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。在5 v/cm的電壓下進(jìn)行電泳，25～30 min后在UVP凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄結(jié)果。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 熒光定量PCR方法參照Real-time PCR Master Mix 試劑盒(日本TOYOBO公司產(chǎn)品)操作說明進(jìn)行。PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃，1 min → [95 ℃，15 s→ 55～65 ℃，30 s→ 72 ℃，45 s(data collection)]×40 cycles → dissociation curve。

由美國ABI實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)儀記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，每個(gè)樣本中靶基因A 3個(gè)重復(fù)的值分別為CtA1、CtA2、CtA3，平均值CtA=(CtA1+CtA2+CtA3)/3。每個(gè)樣本中靶基因A 的CtA值與內(nèi)參Ctrp49的差以△CtA表示，則△CtA=CtA-Ctrp49。處理后樣品中靶基因A的△Ct值以△CtA’表示，未處理樣品中靶基因A的△Ct值以△CtA表示。處理后相對于處理前的△△Ct值以△△CtA’,A表示，則△△CtA’,A=△CtA’-△CtA。根據(jù)Livak(2001)等報(bào)道的方法，基因A在處理后樣品中相對于未處理樣品中的相對轉(zhuǎn)錄水平變化則可用2-△△CtA’,A表示[12]。

圖1 抽提RNA的瓊脂糖電泳檢測Fig.1 Agarose gel electrophoresis for extracted RNA

電泳圖a和b中各點(diǎn)樣孔的樣品為M:DL2000 Marker；1～3為饑餓組的擴(kuò)增樣品；4～6為正常對照組的擴(kuò)增樣品；7是未加模板的陰性對照The sample in each hole of figure a and b were those M shows DL2000 DNA Marker; 1-3 showed the amplification of starvation sample respectively;4-6 showed the amplification of contral sample respectively;7 showed the amplification of negative control template圖2 DefensinA和DefensinB基因的普通PCR 擴(kuò)增Fig.2 The PCR amplification of DefensinA and DefensinB

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA質(zhì)量檢測與濃度計(jì)算

抽提的各樣品總RNA的 OD260/OD280值在1.7～2.0，RNA電泳顯示2條清晰的28SrRNA和18SrRNA泳帶(圖1)，說明總RNA樣品符合實(shí)驗(yàn)要求，同時(shí)測算樣品中的RNA濃度，用于反轉(zhuǎn)錄。

2.2 目的基因的PCR擴(kuò)增及檢測

進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)之前，先以饑餓組和對照組的脂肪體cDNA為模板，進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增和檢測，其目的一是明確家蠶DefensinA和DefensinB基因引物的特異性，以及是否有明顯的引物二聚體產(chǎn)生；二是初步檢測饑餓處理后基因在家蠶脂肪體中的大概轉(zhuǎn)錄情況，為實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測提供定性參考。

圖2表明，基因(DefensinA，DefensinB)的引物都能從cDNA中檢測到轉(zhuǎn)錄，沒有明顯的引物二聚體條帶出現(xiàn)，說明這些設(shè)計(jì)的引物可以用于熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測。

2.3 Real-time PCR檢測DefensinA和DefensinB對饑餓誘導(dǎo)的響應(yīng)

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)技術(shù)，對不同時(shí)間(8、16和24 h)饑餓處理的家蠶DefensinA和DefensinB進(jìn)行定量分析，結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，饑餓處理家蠶8、16和24 h，DefensinB的轉(zhuǎn)錄活性都明顯被上調(diào)，其中饑餓16 h時(shí)DefensinB相對轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)最為明顯；而DefensinA轉(zhuǎn)錄活性變化不明顯，僅在饑餓24 h時(shí)有微小上調(diào)。

3 討 論

家蠶抗菌肽的產(chǎn)生主要由Toll和IMD 2條信號通路介導(dǎo)產(chǎn)生，其中Toll信號通路主要由真菌和革蘭氏陽性菌激活，IMD信號途徑主要由革蘭氏陽性菌激活[13]。Toll途徑和IMD途徑都有相應(yīng)的模式識別蛋白以對外源微生物進(jìn)行識別。細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜上的肽聚糖(PGN)、脂多糖(LPS)和甘露聚糖(Mannan)等被稱為病原相關(guān)的模式分子(Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)，這些模式分子能被相應(yīng)的受體識別，而識別它們的相應(yīng)受體被稱為模式識別受體(Pattern recognition receptors, PRRs)，PRRs識別PAMP分別激活Toll和IMD途徑，最后激活NF-κB樣蛋白(Rel蛋白超家族成員：在Toll通路中為Dorsal/Dif蛋白；在IMD通路中為Relish蛋白)，NF-κB樣蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子與AMPs基因上游的NF-κB位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)抗菌肽基因的表達(dá)[14-16]。

圖3 Real-time PCR檢測DefensinA和DefensinB的相對轉(zhuǎn)錄水平Fig.3 The relative transcription of DefensinA and DefensinB detected by real-time PCR

由本試驗(yàn)結(jié)果看，對家蠶5齡幼蟲給予適當(dāng)饑餓處理，抗菌肽基因DefensinB被誘導(dǎo)表達(dá)。但是家蠶脂肪體細(xì)胞對饑餓信號的識別，顯然不是通過PRRs機(jī)制的Toll和IMD信號通路實(shí)現(xiàn)NF-κB樣蛋白轉(zhuǎn)錄因子與NF-κB位點(diǎn)結(jié)合啟動(dòng)抗菌肽的表達(dá)。當(dāng)食物缺乏或是遭受饑餓的脅迫時(shí)，生物體自身代謝變慢，相應(yīng)的免疫力會有所下降或減弱，這時(shí)機(jī)體為了預(yù)防外來病原微生物的入侵，很有可能會通過其他途徑主動(dòng)提高或增強(qiáng)自身免疫[17-18]。Becker等人的研究發(fā)現(xiàn)，雙翅目昆蟲果蠅類胰島素水平的變化能影響AMPs基因的表達(dá)，即在果蠅處于非感染條件下，給予饑餓處理，其類胰島素(Insulin-like signaling, ILS)信號水平下降，從而介導(dǎo) FoxO 轉(zhuǎn)錄因子(fork-head transcript factor)調(diào)控果蠅抗菌肽Drosomycin基因的表達(dá)，并且已證實(shí)饑餓誘導(dǎo)Drosomycin的表達(dá)不依賴于NF-κB因子[19]。家蠶DefensinB與果蠅Drosomycin同屬于陽離子抗菌肽，饑餓是否也通過影響家蠶的胰島素水平進(jìn)而介導(dǎo)FoxO轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控家蠶DefensinB的表達(dá)，有待進(jìn)一步后續(xù)研究。

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(責(zé)任編輯 王家銀)

Effects of Starvation onDefensinAandDefensinBExpression in Silkworm,Bombyxmori

YANG Wei-ke，TANG Fen-fen，LIU Zeng-hu，ZHONG Jian，DONG Zhan-peng*

(Institute of Sericulture and Apiculture，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Yunnan Mengzi 661101，China)

In this study，the real-time fluorescent quantitative PCR was applied to analyze the expression ofDefensinAandDefensinBin fat body ofBombyxmoriwhich were treated with starvation at different time after fed to fifth instar and third days.The results revealed that the expression ofDefensinBin the fat body ofBombyxmoriwith starvation-treated for 8,16 and 24 h present a trend of increase, moreover the expression quantity increase was most obvious at 16 h，whereas the expression ofDefensinAdisplayed weekly response. These suggested that the expression of Antibacterial pepetides geneDefensinBmight be induced by starvation in silkworm.

Bombyxmori; Starvation;DefensinAandDefensinB; Real-time fluorescent quantitative PCR

1001-4829(2016)12-3019-04

10.16213/j.cnki.scjas.2016.12.044

2015-02-06

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360586)；云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所青年創(chuàng)新基金項(xiàng)目(QC2015002)

楊偉克(1985-)，男，助理研究員，碩士，主要從事野蠶資源搜集與利用研究工作，E-mail：WKSUN1985@163.com,*為通訊作者，E-mail：scsdong@163.com。

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