李寧，楊生保，楊濤，王柏柯，唐亞萍，王強(qiáng)，帕提古麗·艾斯木托拉，余慶輝

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所，烏魯木齊 830091)

辣椒Ty3-gypsy逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列的克隆及分析

李寧，楊生保，楊濤，王柏柯，唐亞萍，王強(qiáng)，帕提古麗·艾斯木托拉，余慶輝

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所，烏魯木齊 830091)

【目的】從辣椒基因組中克隆Ty3-gypsy逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列，分析其家族特性及進(jìn)化關(guān)系?！痉椒ā扛鶕?jù)Ty3-gypsy逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡并引物，通過PCR擴(kuò)增、回收、克隆、測序得到的目的基因序列。【結(jié)果】克隆從辣椒基因組14條逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列，序列大小均為340 bp左右。生物信息學(xué)分析表明，序列長度變化范圍為310～345 bp，同源性范圍為60.2%～99.1%。這些核苷酸序列具有較高的異質(zhì)性，主要表現(xiàn)為終止密碼子突變。聚類分析可將所得序列分為5大類，基于逆轉(zhuǎn)錄酶序列進(jìn)行的不同物種進(jìn)化樹分析顯示，第Ⅳ、Ⅴ類序列與荸薺、潘那利番茄等組成一大類，可能是逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子橫向傳遞的結(jié)果?！窘Y(jié)論】辣椒Ty3-gypsy逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列具有普遍性、異質(zhì)性等特點(diǎn)，與荸薺、潘那利番茄等物種的同類型逆轉(zhuǎn)座子可能有相同的起源。

辣椒；Ty3-gypsy逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子；逆轉(zhuǎn)錄酶

0 引 言

【研究意義】逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是刺激寄主細(xì)胞基因組發(fā)生多種形式的遺傳重排，促進(jìn)基因組的流動，引發(fā)植物性狀突變，有利于生物遺傳多樣性及基因組遺傳進(jìn)化的關(guān)鍵因子，作為一種可移動的遺傳因子分散在真核基因組中[1]。這種特殊的轉(zhuǎn)座方式使其在基因組中具有高拷貝性，通過克隆與分析其序列，對解析植物基因組突變、進(jìn)化及遺傳多樣性具有重要意義[2-3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是構(gòu)成植物基因組的主要成分，種類多，分布廣，它以RNA為中間體，借助逆轉(zhuǎn)錄酶/RNaseH反轉(zhuǎn)錄成DNA，再插入到基因組中。轉(zhuǎn)座子以轉(zhuǎn)座方式分為以DNA-DNA轉(zhuǎn)座和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座；逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子又以其5′端和3′末端重復(fù)序列的缺失劃分為兩種：長末端重復(fù)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和非長末端重復(fù)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。長末端重復(fù)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子按結(jié)構(gòu)差異又分為Tyl-copia與Ty3-gypsy兩個(gè)亞類[3]，5′端和3′端末端重復(fù)序列長度從幾百bp到5 Kb不等，在多數(shù)情況下以5′-TG-3′為起始，以5′-CA-3′為終止，這兩段標(biāo)識序列稱為TG-CA盒(TG-CA box)。在植物基因組中都具有存在普遍、拷貝數(shù)密集、特異位點(diǎn)插入等特點(diǎn)，在真核基因組的突變，基因功能分析和系統(tǒng)發(fā)育，基因組進(jìn)化及生物多樣性檢測等研究中均具有重要意義[3]。Ty3-gypsy類逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在葡萄果皮顏色的變化[4]，菜豆花色的形成[5]等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】迄今為止Ty1-copia逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子已在大多數(shù)重要植物中研究分析[6]，但關(guān)于Ty3-gypsy逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，目前的研究還相對較少[7]。因此，開展辣椒Ty3-gypsy逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子研究極其必要。研究通過克隆Ty3-gypsy逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列，為揭示辣椒遺傳進(jìn)化特性提供新信息，為進(jìn)一步解析其色素功能奠定基礎(chǔ)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究對辣椒(CapsicumannuumL.)基因組DNA中Ty3-gypsy逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列提取、克隆和序列的特性分析，為辣椒基因組進(jìn)化和種質(zhì)資源多樣性研究提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所辣椒課題組提供辣椒品種IL60，以其葉片為試材，于2015年6月在新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所蔬菜分子實(shí)驗(yàn)室液氮保存。

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取及逆轉(zhuǎn)錄酶擴(kuò)增

辣椒基因組DNA采用植物基因組DNA提取試劑盒(QIAGEN公司)提取，用瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量及完整性。根據(jù)檢測結(jié)果將DNA濃度稀釋至20 mg/L后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶的引物設(shè)計(jì)參照Kumekawa方法[8]。TY3-F：5′-AGMGRATGTGSGTYGASTAT-3′；TY3-R：5′-GTWGGKSTTMKGTGTRAA-3′。其中R=A+G，M=A+C，Y=C+T，S=C+G，K=G+T，W=A+T。

逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶的擴(kuò)增程序?yàn)椋?/p>

94℃ 3 min

72℃ 12 min

PCR反應(yīng)體系為：體系20.0 μL，含有10×Buffer 2.0 μL，30 ng的模板DNA，Mg2+2.0 mmol/L，引物(TY3-F和TY3-R)1.0 μmol/L，TaqDNA聚合酶1 U，dNTPs 0.25 mmol/L，ddH2O補(bǔ)充至20 μL。

1.2.2 PCR產(chǎn)物的回收、克隆及轉(zhuǎn)化

PCR產(chǎn)物通過1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用瓊脂糖回收試劑盒回收產(chǎn)物(北京QIAGEN)?；厥债a(chǎn)物與TransGen Biotech的pEASY-T5 Zero Cloning Kit載體連接，連接產(chǎn)物直接用大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化菌液涂布于固體LB培養(yǎng)基(含有Amp)上，靜置過夜培養(yǎng)(37℃)。挑取單菌落，加入到液體LB培養(yǎng)基(含有Amp)中搖菌。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄酶序列的測序及分析

采用菌液PCR鑒定，結(jié)果為陽性克隆的菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序結(jié)果采用NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST程序檢測、多重比對最終獲得逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶基因片段的氨基酸序列，最終將得到的Ty3-gypsy逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列命名為CATY。使用DNAMAN和MEGA 5.0等生物軟件對辣椒逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶的氨基酸序列組成成分機(jī)同源分析等，并且構(gòu)建其不同系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(N-J法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ty3-gypsy逆轉(zhuǎn)錄酶序列的PCR擴(kuò)增

采用天根試劑盒提取辣椒葉片的基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，基因組DNA條帶單一明亮，無拖尾現(xiàn)象，質(zhì)量較好。通過借鑒Kumekawa方法設(shè)計(jì)辣椒逆轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶的PCR引物，最終在辣椒基因組DNA中PCR擴(kuò)增出一條330 bp左右的基因片段，表明在辣椒中Ty3-gypsy逆轉(zhuǎn)座子普遍存在。 圖1～2

2.2 Ty3-gypsy逆轉(zhuǎn)錄酶序列的組成與同源性

克隆測序后，共得到24條序列信息。通過采用BLAST程序推導(dǎo)、比對，去除重復(fù)與過短序列，最終獲得14條不同序列，比對結(jié)果這14條序列與已知其他植物Ty3-gypsy逆轉(zhuǎn)錄酶序列有很高的相似性，說明PCR擴(kuò)增辣椒Ty3-gypsy類逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列克隆成功。采用DNAMAN與DNAstar軟件分析序列，堿基AT在整個(gè)序列的比例范圍為1.48～1.92，核苷酸序列變化范圍為318～342 bp，依次命名為CATY1～CATY14，其中序列長度CATY8和CATY14最小為318 bp、CATY6為327 bp、最大是CATY9為342 bp，其余均為339 bp。表1

圖1 辣椒組織DNA 1 %瓊脂糖凝膠電泳

Fig.1 Pepper tissue DNA 1% agarose

M：DL 2000 marker；A、B：IL60

圖2 辣椒逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列PCR擴(kuò)增

Fig.2 PCR amplification of reverse transcriptase sequence from Pepper

表1 辣椒逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列組成

Table 1 Base composition of retrotransposon reverse transcriptase in pepper

序列號Sequence大小/bpSize/bpAT比例ATcontent(%)序列號Sequence大小/bpSize/bpAT比例ATcontent(%)CATY13391.58CATY83181.69CATY23391.56CATY93421.56CATY33391.55CATY103391.65CATY43391.48CATY113391.70CATY53391.99CATY123391.92CATY63271.77CATY133331.85CATY73391.78CATY143181.59

表2 辣椒中逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶的序列差異百分率(左下方)和同源性(右上方)

Table 2 Pepper retrotransposon reverse transcriptase sequence difference percentage (bottom left) and homology (right)

CATY1CATY2CATY3CATY4CATY5CATY6CATY7CATY8CATY9CATY10CATY11CATY12CATY13CATY14CATY199.177.063.771.768.869.070.866.476.168.175.269.470.8CATY20.0176.163.772.667.968.169.866.477.067.374.368.569.8CATY30.260.2668.189.484.467.383.082.399.184.198.283.884.9CATY40.460.460.3965.565.161.959.460.268.164.668.165.860.4CATY50.340.320.110.4377.160.273.675.290.377.087.676.675.5CATY60.380.390.170.430.2664.270.671.683.599.184.499.172.5CATY70.380.390.400.490.520.4562.356.666.463.767.364.063.2CATY80.350.360.190.530.310.350.4867.082.170.882.170.298.1CATY90.420.420.200.520.290.340.580.4182.371.780.571.268.9CATY100.260.260.010.390.100.180.420.200.2083.297.382.984.0CATY110.390.400.170.440.260.010.460.350.340.1984.198.272.6CATY120.290.300.020.390.130.170.400.200.220.030.1783.884.0CATY130.370.380.180.430.270.010.450.360.340.190.020.1872.1CATY140.350.360.160.510.280.320.470.020.380.180.320.180.33

將序列導(dǎo)入DNAstar軟件運(yùn)用Clustal W方法計(jì)算序列間的異質(zhì)性。結(jié)果表明，同源性范圍為60.2%～99.1%，其中序列CATY1與CATY2的同源性最高，為99.1%，序列CATY5與CATY7的同源性最低，僅為60.2%；辣椒逆轉(zhuǎn)錄酶序列間差異性范圍為1%～58%，其中序列CATY7與CATY9的差異性為58%，CATY1與CATY2的差異性最低，為1%。由此推論，用同一簡并引物PCR擴(kuò)增出單一條帶的前提下，但克隆得到的辣椒Ty3-gypsy逆轉(zhuǎn)錄酶序列并非相同，并且序列之間的堿基同源性、序列長度和堿基變化上都有著豐富的多態(tài)性，說明辣椒基因組中Ty3-gypsy逆轉(zhuǎn)錄酶存在一定的異質(zhì)性。表2

注：.為終止密碼子

Note: *: Stop code

圖3 辣椒中逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列比較

Fig.3 Reverse transcriptase amino acid sequence comparisons in pepper

2.2 辣椒Ty3-gypsy逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT氨基酸序列比對

使用NCBI軟件將克隆得到的14條逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列翻譯成氨基酸序列，并通過DNAMAN軟件進(jìn)行比對分析。結(jié)果顯示，大部分辣椒Ty3-gypsy逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子氨基酸序列上游和下游均含有DDLLDEL和VFFDDIL這兩個(gè)保守序列，與已報(bào)道其他植物的Ty3-gypsy逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子區(qū)域相吻合。將這14條Ty3-gypsy類逆轉(zhuǎn)錄酶的氨基酸序列比對分析，結(jié)果得到CATY4(第12個(gè)氨基酸處)、CATY7(第76個(gè)氨基酸處)、CATY9(第22和73個(gè)氨基酸處)和CATY12(第95個(gè)氨基酸處)4條序列都發(fā)生了移碼突變；14條序列有11條發(fā)生1～8個(gè)終止密碼子突變，大部分序列的終止密碼子突變都是2個(gè)。其中發(fā)生突變最少的是CATY2，在第52個(gè)氨基酸處發(fā)生1個(gè)終止密碼子突變，最多的是CATY4，在第7、12、33、49、60、75、84和96個(gè)氨基酸處發(fā)生了8個(gè)終止密碼子突變， CATY8在第41、51和57個(gè)氨基酸處，CATY13在第19、69和83個(gè)氨基酸處均發(fā)生了3個(gè)終止密碼子突變。由此推論，導(dǎo)致辣椒Ty3-gypsy逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子異質(zhì)性的重要原因就是移碼突變和終止密碼子突變。圖3

2.2.3 辣椒Ty3-gypsy逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RT系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過軟件MEGA 5.0分析14條辣椒Ty3-gypsy類逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的氨基酸序列，以這14個(gè)蛋白質(zhì)序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(使用N-J法)。結(jié)果表明，辣椒Ty3-gypsy類逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子被N-J法進(jìn)化樹分為5類，其中Ⅰ類包含CATY3、CATY5、CATY9、CATY10、CATY12，Ⅱ類包含2條序列分別是CATY8和CATY14，Ⅲ類包含3條序列，Ⅳ只有單獨(dú)一條序列CATY4，推斷由于其含有終止密碼子突變較多，導(dǎo)致與其他序列差異較大，進(jìn)化樹將其分為一類。Ⅴ類中也包含3條序列。這14條辣椒Ty3-gypsy類逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的氨基酸序列相似度都很高，最高都到99%，但由于序列間受到一定程度移碼突變和終止密碼子突變，導(dǎo)致分類不同。由此可見同一家族的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子產(chǎn)生異質(zhì)性的原因之一是氨基酸序列受到堿基插入、替換或缺失突變[10]。圖4將NCBI上已登錄的其他植物Ty3-gypsy類逆轉(zhuǎn)錄酶的氨基酸序列與14條辣椒逆轉(zhuǎn)錄酶的氨基酸序列采用N-J法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，這些序列間的遺傳距離范圍為0～0.649。這5類的氨基酸序列相似性較高，只和荸薺(Eleocharisquinqueflora)ADF46081遺傳距離較近，與其它植物差異較大；Ⅳ類中CATY4氨基酸序列與荸薺在進(jìn)化關(guān)系上相對較近，遺傳距離分別為0.230。Ⅳ、Ⅴ類氨基酸序列與多花黑麥草(Loliummultiflorum)、列當(dāng)(Orobancheowerinii)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、野黃瓜(Cucumishystrix)和潘那利番茄(Solanumpennellii)組成一大類，與薔薇科植物親緣關(guān)系比較近，這與植物分類學(xué)基本一致。圖4～5辣椒逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶的氨基酸基本上序列之間進(jìn)化距離較近，推斷其被轉(zhuǎn)座復(fù)制的時(shí)間不長。辣椒逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶在生物進(jìn)化過程中有可能發(fā)生了橫向傳遞作用。

圖4 辣椒逆轉(zhuǎn)錄酶序列進(jìn)化樹

Fig.4 Reverse transcriptase sequence phylogenetic tree in pepper

圖5 辣椒與其它植物Ty3-gypsy逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶的氨基酸序列進(jìn)化樹

Fig.5 Phylogenic tree of amino sequences of reverse transcriptase of Ty3-gypsy retrotransposons in pepper undatus and other plants

3 討 論

近年來辣椒的基因組研究主要分為分子標(biāo)記和基因克隆兩方面[11-12]，而對于Ty3-gypsy逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶構(gòu)成植物基因組重要部分的研究報(bào)道寥寥可數(shù)。研究通過PCR克隆技術(shù)利用Ty3-gypsy逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶的簡并引物從辣椒品種IL60中克隆到辣椒Ty3-gypsy逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶，PCR結(jié)果顯示辣椒IL60逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列長度變化范圍在310～345 bp，覺得大多數(shù)基因序列為345 bp，這與前人的研究結(jié)果大同小異[9,13]，由此可以推斷此次克隆辣椒Ty3-gyspy逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄酶基因片段真實(shí)可靠，并且Ty3-gyspy逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在辣椒中應(yīng)當(dāng)是普遍存在。DNAMAN軟件比對結(jié)果顯示，不同物種Ty3-gypsy逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列不僅在基因序列長度方面比較相似，而且在不同程度上有著必然的保守性，綜上所述，實(shí)驗(yàn)通過引物PCR克隆得到的Ty3-gypsy類逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄酶的方法是行之有效的。

逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是導(dǎo)致植物突變及基因組遺傳和進(jìn)化的重要原因[14,15]，研究中分離克隆了14條辣椒Ty3-gypsy逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列，其中有4條序列發(fā)生了移碼突變，分別是CATY4、CATY7、CATY9和CATY12；14條序列中有11條發(fā)生1～8個(gè)終止密碼子突變，在11條辣椒Ty3-gypsy逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列中普遍都為2個(gè)終止密碼子突變。這里面發(fā)生最多的是CATY4，在第7、12、33、49、60、75、84和96個(gè)氨基酸處發(fā)生了8個(gè)終止密碼子突變，突變最少的是CATY2，在第52個(gè)氨基酸處發(fā)生1個(gè)終止密碼子突變；發(fā)生了3個(gè)終止密碼子突變的分別是CATY8和CATY13。結(jié)果顯示辣椒Ty3-gypsy逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列在不管在序列長度還是在堿基同源性和堿基變化上都存在極大地異質(zhì)性，因而能夠推斷，導(dǎo)致辣椒Ty3-gypsy逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶的異質(zhì)性的重要原因是移碼突變和終止密碼子突變[16]，此結(jié)果與周鵬[17]和石鳳敏等[18]的研究結(jié)論相仿。辣椒逆轉(zhuǎn)錄酶序列間差異性范圍為1%～58%；最高同源性范圍為60.2%～99.1%，結(jié)果分析辣椒逆轉(zhuǎn)錄酶序列之間存在一定的異質(zhì)性，這與其它植物Ty3-gypsy逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶研究結(jié)果近似[19]。主要原因由于逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶沒有錯(cuò)讀校對功能，使得逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子發(fā)生轉(zhuǎn)座過程中易發(fā)生高頻突變；在向日葵逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子研究中的也認(rèn)為在同一物種中克隆的同一類逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子仍表現(xiàn)為極度異質(zhì)性[20]。另外，逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子間同源序列重組和寄主的防御機(jī)制也會促使逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子變異[21]。

將辣椒中14條逆轉(zhuǎn)錄酶序列通過MEGA 5.0聚類分析，結(jié)果分為5類，其中每一類逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列數(shù)量千差萬別，更確切的表明同一類逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在轉(zhuǎn)錄過程存在一定微乎其微的差異，推斷其存在的歷史地位也可能全然不同[22]，對辣椒基因組進(jìn)化的作用也是千差萬別。通過MEGA 5.0采用N-J法對辣椒逆轉(zhuǎn)錄酶序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中其他植物Ty3-gypsy逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明辣椒與荸薺，潘娜利番茄，擬南芥和列當(dāng)?shù)南嚓P(guān)序列同源性較高，這種相似性不僅與植物學(xué)分類結(jié)果相吻合，進(jìn)一步推論可能是Ty3-gypsy逆轉(zhuǎn)錄酶對應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在生物進(jìn)化歷程上橫向傳遞的結(jié)果[23-24]，這在一定程度上為研究辣椒的起源提供了依據(jù)，為辣椒育種中奠定了良好的理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

研究從辣椒基因組中成功利用簡并引物克隆了Ty3-gypsy逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列。經(jīng)過生物信息學(xué)對其分析顯示，逆轉(zhuǎn)錄酶序列都具有拷貝數(shù)密集和異質(zhì)性的特點(diǎn)，主要是由于終止子突變與移碼突變所致。根據(jù)進(jìn)化樹分析可知，與荸薺，潘娜利番茄等植物具有很近的遺傳距離，這種相似性與植物學(xué)分類結(jié)果相吻合，可能是反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子橫向傳遞的結(jié)果。

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Fund project:Supported by the special funds for public welfare industry in China (agriculture) (201303115), staple vegetable industry technology system project of the Experiment Station in Urumqi (CARS-25-G-51) and science and technology achievements transformation project of Xinjiang Uygur Autonomous Region (201554114)

Cloning and Analysis of Reverse Trancriptase of Ty3-gypsyRetrotransposons in Pepper (CapsicumannuumL.)

LI Ning, YANG Sheng-bao, YANG Tao, WANG Bai-ke, TANG Ya-ping,WANG Qiang, Patiguli·Asimutola, YU Qing-hui

(ResearchInstituteofHorticulturalCrops,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China)

【Objective】 To clone Reverse Transcriptase of Ty3-gypsyRetrotransposons in pepper (CapsicumannuumL.)genome and analyze its characteristics and evolution of family relationships.【Method】According to the conserved regions of Ty3-gypsyreverse transcription and reverse transcription enzyme, degenerate primers were designed. The sequences were recovered, cloned and sequenced by PCR amplification, cloning and sequencing.【Result】The reverse transcriptase sequences were obtained from genome of pepper 14 reverse transcription. The sequences were about the size of 340 bp. Bioinformatics analysis showed that the sequence length varied from 310-345 bp, and homologies were in the range of 60.2%-99.1%. Phylogenetic tree analysis of different species based on reverse transcriptase sequences showed that IV, V series and Eleocharis quinqueflora, Solanum pennellii formed a large class, which might be the result of lateral transfer of the reverse transcriptase.【Conclusion】Pepper Ty3-gypsyretrotransposon reverse transcriptase sequence has universality, heterogeneity, etc., andEleocharisquinqueflora,Solanumpennelliiand other species of the same type of retrotransposons may have the same origin.

pepper; Ty3-gypsyclass retrotransposons; reverse transcriptase

2016-05-12

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)項(xiàng)目(201303115)；大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系烏魯木齊試驗(yàn)站項(xiàng)目(CARS-25-G-51)；自治區(qū)農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(201554114)

李寧(1985-)，男，新疆人，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)槭卟诉z傳育種與生物技術(shù)，(E-mail)liningbio@163.com

余慶輝(1970-)，男，廣東人，研究員，博士，研究方向?yàn)榧庸し堰z傳育種與栽培，(E-mail)yuqinghui98@sina.com

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.12.002

S641.3；S188

：A

：1001-4330(2016)12-2166-09