李上富, 向 麗, 蔡宗葦(香港浸會大學(xué)化學(xué)系, 環(huán)境與生物分析國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室伙伴實(shí)驗(yàn)室, 香港 999077)

鄒漢法研究員紀(jì)念專輯(下)·研究快報(bào)

基于非靶標(biāo)篩查的超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法檢測尿液樣品中的酰基肉堿

李上富, 向 麗, 蔡宗葦*
(香港浸會大學(xué)化學(xué)系, 環(huán)境與生物分析國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室伙伴實(shí)驗(yàn)室, 香港 999077)

建立了一種基于母離子掃描模式的超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜檢測尿液中?；鈮A的分析方法。對?；鈮A類化合物所共有的m/z為60、85和144的碎片離子進(jìn)行選擇性檢測，結(jié)合化合物母離子掃描的結(jié)果及其對應(yīng)的保留時間,選取一致性較好的化合物進(jìn)行篩選,再利用高分辨質(zhì)譜確認(rèn),最終檢測到37種?；鈮A化合物,其中有14種尚未被HMDB和LIPID MAPS數(shù)據(jù)庫收錄。該方法可應(yīng)用于其他生物樣本(如血液、組織)中?；鈮A的定性、定量分析,可作為檢測?；鈮A化合物的新選擇。

超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜;母離子掃描;質(zhì)譜特征;酰基肉堿

?；鈮A是一類由肉堿與?；Y(jié)合形成的、彼此結(jié)構(gòu)相似的代謝物。?；鈮A在細(xì)胞代謝過程中發(fā)揮著重要作用[1,2]，其可將長鏈脂肪酸從胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體，從而進(jìn)行β氧化和三羧酸循環(huán),為細(xì)胞活動提供能量[3]。在?；鈮A轉(zhuǎn)移酶的作用下，?；鈮A可以消除線粒體內(nèi)由酰基輔酶A的代謝中間產(chǎn)物積聚而引起的不良反應(yīng)[4,5]。酰基肉堿還涉及丙酮酸、支鏈氨基酸的氧化和利用[6,7]。研究發(fā)現(xiàn)，?；鈮A是診斷有機(jī)酸血癥的重要指標(biāo)[8]；血液中酰基肉堿的變化也與1型糖尿病和2型糖尿病顯著相關(guān)[9,10];而環(huán)境污染物如全氟辛酸的暴露也會影響?；鈮A的代謝[11]。這些現(xiàn)象表明,?；鈮A與細(xì)胞代謝有相當(dāng)密切的關(guān)系,通過檢測它們的含量,可以間接地了解細(xì)胞代謝活動的變化。

不同的脂肪酸及氨基酸氧化產(chǎn)物可形成不同鏈長的?；鈮A，其構(gòu)成了一個成員龐大的同系物家族，廣泛存在于各種組織和體液中[12]?；诖?lián)質(zhì)譜的定量方法已被廣泛地應(yīng)用于酰基肉堿的檢測[13],包括提取后直接檢測[14,15]和鹽酸正丁醇衍生化后檢測[16,17]。但是,由于缺乏足夠的標(biāo)準(zhǔn)品,采用現(xiàn)有方法檢測到的酰基肉堿的數(shù)目十分有限。因此,建立一種能夠盡可能多地檢測?；鈮A的方法,不僅有助于深入了解這類化合物的功能,而且對臨床疾病的診斷也有重要意義。本文開發(fā)了一種基于母離子掃描模式的超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜(UHPLC-QqQ MS)檢測尿液中?；鈮A的分析方法,以冀能為?；鈮A的測定提供一種新思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters ACQUITY超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀(美國Waters公司); Q ExactiveTMHybrid Quadrupole-Orbitrap質(zhì)譜儀(美國ThermoFisher Scientific公司); FD 5508冷凍干燥儀(韓國ilShin公司); DS-2510 DT超聲儀(上海生析超聲儀器有限公司); 5415R離心機(jī)(德國Eppendorf公司); TurboVap Ⅱ氮吹儀(美國Zymark公司)。

甲醇(HPLC級)購自美國Merck公司;甲酸(質(zhì)譜級)、7種酰基肉堿標(biāo)準(zhǔn)品(乙酰肉堿、丙酰肉堿、丁酰肉堿、3-甲基丁酰肉堿、辛酰肉堿、豆蔻酰肉堿和棕櫚酰肉堿)純度≥97.0%,均購自美國Sigma-Aldrich公司;實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q水。

1.2 樣品前處理

取100 μL健康成人的尿液,于-20 ℃冷凍干燥8 h,除去水分。加入300 μL甲醇和3 μL甲酸,充分混勻,超聲1 min后,于-20 ℃靜置30 min,使固體顆粒物充分沉淀,再于4 ℃以13 000 g離心15 min,取上清液,用氮?dú)獯蹈?殘余物用50 μL 5%(v/v)甲醇水溶液復(fù)溶,溶液于4 ℃以13 000 g離心15 min,取上清液,待進(jìn)樣分析。

1.3 色譜條件

色譜柱:AcquityTMBEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm,美國Waters公司);柱溫:30 ℃;樣品室溫度:6 ℃;流動相:A為0.1%(v/v)甲酸水溶液,B為甲醇;流速:0.25 mL/min。梯度洗脫條件:0～10.0 min, 5%B～100%B; 10.0～11.0 min, 100%B; 11.0～11.3 min, 100%B～5%B; 11.3 min～15.0 min, 5%B。進(jìn)樣量:10 μL。

1.4 質(zhì)譜條件

利用Waters公司的三重四極桿質(zhì)譜儀進(jìn)行?；鈮A的檢測。離子源:電噴霧離子(ESI)源;正離子模式;離子源溫度:130 ℃;錐孔電壓:30 V;毛細(xì)管電壓:3 200 V;脫溶劑氣流量:10 L/min;錐孔氣流量:2.5 L/min;脫溶劑氣溫度:350 ℃。數(shù)據(jù)采集選用母離子掃描模式,掃描的母離子分別為m/z60、85和144;掃描范圍:m/z200～500;掃描時間:0.1 s;碰撞電壓:25 eV。

利用Q Exactive質(zhì)譜儀對酰基肉堿進(jìn)行鑒定。電離方式:正離子模式;鞘氣流速:40 L/min;輔助氣流:10 L/min;噴霧電壓:3 000 V; S-透鏡反射頻率(S-lens RF): 55 Hz;毛細(xì)管溫度:350 ℃;輔助氣溫度:320 ℃。一級質(zhì)譜(MS)、二級質(zhì)譜(MS/MS)掃描分辨率(R)分別為70 000和35 000。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用MarkerLynx軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,通過色譜圖和質(zhì)譜圖,獲得化合物的保留時間(retention time, RT)和質(zhì)荷比信息。利用Q Exactive MS采集目標(biāo)化合物的精確相對分子質(zhì)量(Mr)和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù),并依據(jù)精確Mr檢索人類代謝組數(shù)據(jù)庫(Human Metabolome Database,HMDB)[18]和脂質(zhì)代謝物和代謝通路數(shù)據(jù)庫(LIPID Metabolites and Pathways Strategy,LIPID MAPS)[19],獲得目標(biāo)化合物可能的結(jié)構(gòu)。再利用高分辨的MS/MS質(zhì)譜圖對化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步鑒定和確認(rèn)。對于有標(biāo)準(zhǔn)品的物質(zhì),利用標(biāo)準(zhǔn)品做最后的比對和確認(rèn)。

圖1 (a)肉堿、酰基肉堿、?；慕Y(jié)構(gòu)式，(b)丁酰肉堿標(biāo)準(zhǔn)品的二級質(zhì)譜圖及(c)其碎片離子可能的質(zhì)譜斷裂規(guī)律Fig. 1 (a) Structures of the carnitine, acylcarnitineand acyl group, (b) MS/MS spectrum of the butyryl-carnitine standard sample and (c) the fragmentation schematic of the butyryl-carnitine

2 結(jié)果與討論

2.1 ?；鈮A的MS/MS特征

?；鈮A是一類含有肉堿基團(tuán)(見圖1a)的物質(zhì),其二級質(zhì)譜圖具有相同的碎片離子。丁酰肉堿標(biāo)準(zhǔn)品的二級質(zhì)譜圖見圖1b。該物質(zhì)的主要碎片離子的m/z為60、85、144和173。通過推斷其可能的質(zhì)譜斷裂規(guī)律,發(fā)現(xiàn)m/z為60、85和144的離子碎片均來源于肉堿基團(tuán)(見圖1c)。分析7種?；鈮A標(biāo)準(zhǔn)品及HMDB數(shù)據(jù)庫中收錄的其他?；鈮A的二級質(zhì)譜圖，發(fā)現(xiàn)這類化合物均含有這3種碎片離子。說明同時包含m/z為60、85和144的離子碎片是酰基肉堿的二級質(zhì)譜特征。根據(jù)此特征,可以利用母離子掃描方式檢測樣品中?；鈮A的質(zhì)譜信號。

2.2 基于特征碎片的UHPLC-QqQ MS檢測

利用UHPLC-QqQ MS檢測尿液樣品中的酰基肉堿。首先,通過母離子掃描模式分別采集所有包含m/z為60、85和144碎片離子的信號,得到對應(yīng)的色譜圖(見圖2)。比較得到的色譜圖,發(fā)現(xiàn)包含m/z為85的碎片離子的信號強(qiáng)度最高,這是因?yàn)槠湓诙壻|(zhì)譜圖中的相對豐度最高;另外,3個色譜圖中均出現(xiàn)保留時間相同的色譜峰,這意味著其對應(yīng)的化合物同時包含了m/z為60、85和144的碎片離子。

分別提取這3個色譜圖對應(yīng)的一級質(zhì)譜圖(見圖2),選取相對豐度大于10%的質(zhì)譜峰進(jìn)行分析。比較發(fā)現(xiàn),同時存在于這3個質(zhì)譜圖中且含有相同m/z的質(zhì)譜峰共有35個，每個共同出現(xiàn)的質(zhì)譜峰都可能對應(yīng)著同一個化合物或多個同分異構(gòu)體。于m/z為60、85和144的3個總離子流色譜圖中分別提取每個共同質(zhì)譜峰對應(yīng)的選擇離子色譜圖，并比較其保留時間。如果保留時間一致,說明它們代表的是同一個化合物;反之,則說明它們來源于不同的化合物,為假陽性信號,需排除。

2.3 ?；鈮A信號的辨別及假陽性信號的排除

以m/z為246的碎片離子為例，說明如何辨別?；鈮A信號及如何排除假陽性信號。如圖3所示,m/z為246的選擇離子色譜圖中均出現(xiàn)保留時間約為4.30 min的色譜峰,說明這組峰同時包含了m/z為60、85和144的碎片離子,代表同一個化合物。保留時間約為3.60 min的色譜峰只在圖3b和圖3c中出現(xiàn),也就是說,其對應(yīng)的化合物不包含m/z為85的碎片離子。根據(jù)?；鈮A的二級質(zhì)譜裂解特征,可以確定它是假陽性信號,應(yīng)排除;同樣,在圖3c中，3.80 min的色譜峰也是假陽性信號,應(yīng)排除。依據(jù)這樣的策略,通過查找保留時間一致的色譜峰,可以識別出同時包含m/z為60、85和144的碎片離子的信號,并將其列入可能的?；鈮A化合物的候選名單中。

圖2 尿液樣品中?；鈮A的總離子流色譜圖及對應(yīng)的一級質(zhì)譜圖Fig. 2 Total ion chromatograms (TICs) of acylcarnitines in the urine samples and their first order mass spectra

圖3 m/z為246的質(zhì)譜峰對應(yīng)的選擇離子色譜圖Fig. 3 Selected ion chromatograms of the mass spectral peak for m/z 246

2.4 酰基肉堿化合物的鑒定

為確定候選?；鈮A化合物的結(jié)構(gòu),在相同的色譜條件下,利用高分辨質(zhì)譜得到精確Mr并采集二級質(zhì)譜圖,并利用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對。同樣以m/z為246的化合物為例,介紹結(jié)構(gòu)確認(rèn)的流程。首先,利用高分辨質(zhì)譜得到其精確Mr為246.170 0,通過檢索HMDB數(shù)據(jù)庫，可知偏差在5×10-6(5 ppm)內(nèi)的?；鈮A化合物共有4種,分別是2-甲基丁酰肉堿、戊酰肉堿、3-甲基丁酰肉堿和新戊酰肉堿。比較樣品和這4種酰基肉堿標(biāo)準(zhǔn)品的二級質(zhì)譜圖,發(fā)現(xiàn)雖然主要的碎片離子及其相對豐度分布一致,但只有3-甲基丁酰肉堿的保留時間與樣品化合物完全相同。說明m/z為246.170 0的化合物為3-甲基丁酰肉堿。利用這種方法,還鑒定出其他4種?；鈮A,包括乙酰肉堿、丙酰肉堿、丁酰肉堿和辛酰肉堿。

對于沒有標(biāo)準(zhǔn)品的?；鈮A,則根據(jù)得到的精確Mr和二級質(zhì)譜圖進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,并利用HMDB和LIPID MAPS數(shù)據(jù)庫搜索并推測其可能的結(jié)構(gòu)。如表1所示，最終共鑒定得到37種?；鈮A,包括9種短鏈(C2～C5)、26種中鏈(C6～C12)和2種長鏈(C13～C21)?；鈮A,其中有14種尚未被HMDB和LIPID MAPS數(shù)據(jù)庫收錄。實(shí)驗(yàn)中只檢測到2種長鏈?；鈮A,可能是因?yàn)殚L鏈?；鈮A的極性較小，在尿液中的含量較低;也可能是因?yàn)椴捎眉状甲鳛闃悠诽崛∪軇?而長鏈?；鈮A在甲醇溶液中的溶解度較小。

表1 尿液樣品中鑒定到的37種?；鈮A的具體信息Table 1 Information of the 37 identified acylcarnitines in the urine samples

RT: retention time. * The structure information of acyl (C5∶1: five carbon atoms and one double bond (C=C); DC: the carboxyl group; OH: the hydroxyl group); # mass error of observedm/zcomparing with truem/zvalue, ppm: 10-6. 1) Identification with standard samples; 2) identification based on mass match, MS/MS interpretation and databases searching; 3) isomers.

3 結(jié)論

本文介紹了一種利用UHPLC-QqQ MS檢測尿液樣品中?；鈮A的分析方法?；谀鸽x子的掃描模式選擇性地發(fā)現(xiàn)了37種?；鈮A,包括9種短鏈、26種中鏈和2種長鏈?；鈮A。該方法操作簡單,除可用于測定已知結(jié)構(gòu)的?；鈮A,還可用于鑒定未知結(jié)構(gòu)的?；鈮A。該方法可應(yīng)用于其他生物樣本(如血液、組織)中?；鈮A的定性、定量分析,可作為檢測?；鈮A化合物的新選擇。

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Untargeted screening of acylcarnitines in urine by ultra-highperformance liquid chromatography coupled withtriple quadrupole mass spectrometry

LI Shangfu, XIANG Li, CAI Zongwei*
(PartnerStateKeyLaboratoryofEnvironmentalandBiologicalAnalysis,DepartmentofChemistry,HongKongBaptistUniversity,HongKong999077,China)

A parent ion scan driven untargeted method was developed for the determination of acylcarnitines in the urine samples by ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry (UHPLC-QqQ MS). The acylcarnitines were extracted with methanol and 1% (v/v) formic acid aqueous solution. After pretreatment, the samples were analyzed without derivatization. The data were acquired by scanning parent ions of three common fragment ions of acylcarnitines, which werem/z60, 85 and 144. The three obtained chromatograms and their corresponding mass spectra were compared with the recognized acylcarnitine signals. Each parent ion that presented in all the three mass spectra was selected. The chromatograms of these ions were extracted. The generated peaks that had the same retention times in the three chromatograms were considered as candidate acylcarnitines. The structures of these candidates were identified by high resolution MS and MS/MS combined with searching against databases. Authentic standards were employed to confirm the results if they were available. A total of 37 acylcarnitines were identified in the urine samples by the method, including nine short-, 26 medium- and two long-chain acylcarnitines. A number of 14 acylcarnitines of them were unknown compounds which had not been included in the databases. This method could be extended to detect other biological samples, such as blood and tissues, for qualitative or quantitative analysis of acylcarnitines.

ultra-high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry (UHPLC-QqQ MS); parent ion scan; mass spectral characteristics; acylcarnitines

10.3724/SP.J.1123.2016.09008

2016-09-02

國家自然科學(xué)基金(NSFC21437002).

Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No. NSFC21437002).

O658

:A

:1000-8713(2017)01-0080-06

*通訊聯(lián)系人.Tel:(852)34117070,E-mail:zwcai@hkbu.edu.hk.