張言濤 成伯寧 劉殿雷 黃 海 沈肖曹*

大黃素（Emodin，6-甲基-1，3，8-三羥基蒽醌）是從大黃屬、蓼屬、鼠李屬和番瀉葉中分離出來(lái)的主要有效單體，是一種酪氨酸激酶Ⅱ抑制劑；其具有抗微生物活性、抗炎、免疫抑制、抗腫瘤、保護(hù)肝細(xì)胞等作用；據(jù)有關(guān)報(bào)道，大黃素作用于癌細(xì)胞中結(jié)構(gòu)性地激活和放大的癌基因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，因此大黃素的細(xì)胞毒作用主要對(duì)癌細(xì)胞有效，正常細(xì)胞則不敏感，因此大黃素對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用較小。最新報(bào)道顯示，低濃度大黃素可以增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇化療的敏感性［1］。本課題組先前已發(fā)現(xiàn)大黃素顯著增強(qiáng)吉西他濱對(duì)胰腺癌的促凋亡作用［2］；但大黃素是否具有逆轉(zhuǎn)胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱化療的耐藥作用尚不明確，因此本研究探討大黃素是否具有逆轉(zhuǎn)胰腺癌耐藥細(xì)胞株Bxpc-3/Gem的耐藥作用及其可能的逆轉(zhuǎn)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要藥品和試劑 大黃素（純度＞98%）、吉西他濱（美國(guó)禮來(lái)公司）；胎牛血清、含EDTA 胰酶、RPMI-1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司）；NF-κB抗體（美國(guó)Santa Cruz）。藥物配制：大黃素用DMSO配制成0.2mmol/L，-20℃冰箱保存，DMSO終濃度＜0.1%；吉西他濱用無(wú)菌生理鹽水配制成0.02mmol/L。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人胰腺癌細(xì)胞株Bxpc-3購(gòu)自ATCC，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)；Bxpc-3/GEM是采用濃度梯度倍增法誘導(dǎo)建立耐藥細(xì)胞株Bxpc-3/Gem。

1.3 不同濃度大黃素對(duì)Bxpc-3/Gem和Bxpc-3細(xì)胞增殖的抑制作用 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Bxpc-3/Gem和Bxpc-3細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基配制成單細(xì)胞懸液，以每孔4×103的細(xì)胞數(shù)接種至96孔板，放入CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)過(guò)夜后，分別給予不同濃度的大黃素（10、20、40、80、160μm）處理，并設(shè)正、負(fù)對(duì)照組。藥物處理48h后，棄上清液，每孔各加入180μl培養(yǎng)液和20μl MTT（5mg/ml）溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸棄培養(yǎng)液，每孔加入DMSO150μl，振蕩器震蕩10min，選擇波長(zhǎng)490nm用全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定每孔吸光度（A）。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%。

1.4 大黃素聯(lián)合吉西他濱對(duì)Bxpc-3/Gem和Bxpc-3細(xì)胞增殖的影響 Bxpc-3/Gem和Bxpc-3細(xì)胞以每孔4×103的細(xì)胞數(shù)接種至96孔板，過(guò)夜后，大黃素（40μm）與吉西他濱（20μm）單獨(dú)及聯(lián)合處理48h，棄上清液，加入MTT（5mg/ml）溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸棄培養(yǎng)液，加入DMSO150μl，震蕩10min，測(cè)定每孔吸光度（A）。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.5 RT-PCR法檢測(cè)大黃素及吉西他濱處理后Bxpc-3/Gem細(xì)胞中NF-κB基因的表達(dá) 大黃素（40μm）與吉西他濱（20μm）單獨(dú)及聯(lián)合處理Bxpc-3/Gem細(xì)胞48h后，用trizol裂解細(xì)胞，提取總RNA，紫外分光光度計(jì)260nm波長(zhǎng)測(cè)定RNA濃度；cDNA合成按照標(biāo)準(zhǔn)方案（Fermentas cDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明書）進(jìn)行，PCR反應(yīng)（TIANGEN2×Taq PCR MasterMix說(shuō)明書）NK-KB引物 上 游 ：5'-AGCACAGATACCACCAAGACCC-3'， 下游：5'-CCCACGCTGCTCTTCTATAGGAAC-3'，目的產(chǎn)物長(zhǎng)度300 bp；PCR擴(kuò)增條件為：NF-κB：94℃30s，54℃30s，72℃20s，30個(gè)循環(huán)。GAPDH作內(nèi)參照；PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6 EMSA 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大黃素及吉西他濱處理后Bxpc-3/Gem細(xì)胞中NF-κB基因的活性 大黃素與吉西他濱單獨(dú)及聯(lián)合處理Bxpc-3/Gem細(xì)胞48h后，提取核蛋白（按照PIERCE的核蛋白抽提試劑盒說(shuō)明書的步驟）。NF-κB探針序列：5'- AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3'；5'- GCC TGG GAA AGT CCC CTC AAC T-3'，3'端標(biāo)記生物素；配置6.5% 非變性聚丙烯酰胺凝膠；恒壓預(yù)電泳60min，電壓120 V；取核蛋白10μg加入已計(jì)量的超純水，室溫反應(yīng)20min，加入生物素標(biāo)記探針后室溫再反應(yīng)20min；恒壓電泳100min，電壓120 V，電泳結(jié)束后印跡轉(zhuǎn)移，用帶正電荷尼龍膜380mA 恒流電轉(zhuǎn)40min，轉(zhuǎn)移完后將尼龍膜置于波長(zhǎng)254nm紫外燈下交聯(lián)10min；封閉液20ml室溫封閉20min，將膜再用抗生物素蛋白鏈菌素-辣根過(guò)氧化酶結(jié)合物/封閉液（1∶300稀釋液）20ml于室溫孵育30min，1×洗滌液洗膜，5min/次，共20min，最后將膜放入平衡液20ml中平衡10min，化學(xué)發(fā)光數(shù)字成像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大黃素對(duì)Bxpc-3/Gem和Bxpc-3細(xì)胞增殖的抑制作用 不同濃度的大黃素（10、20、40、80、160μm）作用Bxpc-3/Gem和Bxpc-3細(xì)胞48h，MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖。大黃素對(duì)耐藥細(xì)胞株Bxpc-3/Gem具有明顯的增殖抑制作用，并且具有濃度依賴性。與親本株Bxpc-3比較，大黃素對(duì)耐藥株Bxpc-3/Gem的增殖抑制作用并未減弱。

不同濃度的大黃素（10、20、40、80、160μm）作用Bxpc-3/Gem和Bxpc-3細(xì)胞48h，MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖；設(shè)正、負(fù)對(duì)照組，正對(duì)照組（空白對(duì)照組）為加入等量生理鹽水，負(fù)對(duì)照組為加入等量DMSO。Bxpc-3/Gem細(xì)胞各組細(xì)胞增殖率分別為：對(duì)照組（98.23±2.76）%；10μm組（92.56±2.85）%；20μm 組（84.72±3.07）%；40μm 組（68.83±2.27）%；80μm 組（59.20±2.94）%；160μm 組（46.74±1.64）%；Bxpc-3細(xì)胞各組細(xì)胞增殖率分別為：對(duì)照組（96.53±2.96）%；10μm 組（90.44±1.52）%；20μm 組（85.37±2.62）%；40μm 組（66.36±1.81）%；80μm 組（58.54±2.28）%；160μm 組（48.46±2.55）%。

2.2 大黃素可顯著提高耐藥細(xì)胞株Bxpc-3/Gem對(duì)吉西他濱的增殖抑制作用 大黃素（40μm）與吉西他濱（20μm）單獨(dú)及聯(lián)合處理Bxpc-3/Gem和Bxpc-3細(xì)胞48h；MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖，吉西他濱單獨(dú)作用時(shí)，對(duì)Bxpc-3/Gem與Bxpc-3細(xì)胞的抑制率分別為11.24%與34.53%（P＜0.01）；吉西他濱聯(lián)合大黃素時(shí)，對(duì)兩種細(xì)胞的抑制率分別是50.74%與54.72%（P＞0.05）。由此推測(cè)大黃素能夠提高胰腺癌耐藥細(xì)胞株Bxpc-3/Gem對(duì)吉西他濱的敏感性。

大黃素（40μm）與吉西他濱（20μm）單獨(dú)及聯(lián)合處理Bxpc-3/Gem與Bxpc-3細(xì)胞48h。MTT檢測(cè)細(xì)胞凋亡。Bxpc-3/Gem細(xì)胞各組細(xì)胞增殖率分別為：對(duì)照組（99.25±3.15）%；大黃素組（70.76±2.43）%；吉西他濱組（88.76±2.72）%；聯(lián)合組（49.26±1.77）%；Bxpc-3細(xì)胞各組細(xì)胞增殖率分別為：對(duì)照組（97.64±3.15）%；大黃素組（68.76±2.96）%；吉西他濱組（65.47±1.85）%；聯(lián)合組（45.28±2.53）%。

2.3 大黃素對(duì)Bxpc-3/Gem細(xì)胞中NF-κB mRNA基因的影響 大黃素（40μm）與吉西他濱（20μm）單獨(dú)及聯(lián)合處理Bxpc-3/Gem細(xì)胞48h，采用RT-PCR法檢測(cè)基因的表達(dá)。大黃素單藥不僅可下調(diào)Bxpc-3/Gem細(xì)胞中NF-κB的基因表達(dá)，而且大黃素與吉西他濱聯(lián)合處理Bxpc-3/Gem細(xì)胞具有明顯的協(xié)調(diào)作用（P＜0.05）。

2.4 DNA-binding activity of NF-kB by EMSA 大黃素（40μm）與吉西他濱（20μm）單獨(dú)及聯(lián)合處理Bxpc-3/Gem細(xì)胞48h，提取核蛋白后，EMSA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NF-kB的活性表達(dá)；與對(duì)照組比較，大黃素顯著降低NF-kB活性的表達(dá)，吉西他濱增加NF-kB活性的表達(dá)，大黃素聯(lián)合吉西他濱也明顯降低NF-kB活性的表達(dá)（P＜0.05）。

3 討論

胰腺癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。外科手術(shù)是目前治療胰腺癌最好的手段，但由于早期診斷困難，90%的患者確診時(shí)已是晚期，手術(shù)切除率較低，且易復(fù)發(fā)?；熓侵委熞认侔┯绕涫峭砥谝认侔┑闹匾侄危魉麨I是晚期胰腺癌化療的首選藥物，但在臨床應(yīng)用中療效有限，根治術(shù)后輔助用藥的中位生存時(shí)間僅為22.1個(gè)月；且近些年臨床研究顯示吉西他濱僅對(duì)12%的進(jìn)展期胰腺癌患者有效［3］。聯(lián)合治療在一定程度上改善了晚期胰腺癌的療效，但仍不夠理想，晚期胰腺癌患者的中位生存時(shí)間仍僅有6.5～9.4個(gè)月［4］，其主要原因是化療耐藥性的產(chǎn)生，吉西他濱可使多數(shù)胰腺癌逐步耐藥。

大黃素作為天然的化療輔助藥物，其能抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，也可以協(xié)同增強(qiáng)紫杉醇、吉西他濱等化療藥物的抗腫瘤作用；據(jù)有關(guān)報(bào)道，大黃素可以增強(qiáng)Her-2/neu過(guò)表達(dá)肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑、阿霉素以及依托泊苷的敏感性［5］；還可以增強(qiáng)人食管癌細(xì)胞EC/CUHK1、人髓樣白血病細(xì)胞NB4、U937對(duì)三氧化二砷的敏感性［6］。但大黃素是否有逆轉(zhuǎn)胰腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物耐藥作用的相關(guān)報(bào)道較少。本研究首先通過(guò)采用濃度梯度倍增法誘導(dǎo)建立耐藥細(xì)胞株Bxpc-3/Gem。MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示：不同濃度的大黃素對(duì)Bxpc-3/Gem和Bxpc-3細(xì)胞進(jìn)行處理，結(jié)果表明大黃素對(duì)耐藥細(xì)胞株Bxpc-3/Gem同樣有抑制細(xì)胞增殖的作用，且具有濃度依賴性，與敏感株比較無(wú)明顯差異；大黃素（40μm）聯(lián)合吉西他濱處理Bxpc-3/Gem和Bxpc-3細(xì)胞，可以顯著增強(qiáng)耐藥細(xì)胞株對(duì)吉西他濱的敏感性，提高吉西他濱對(duì)Bxpc-3/Gem的增殖抑制作用。在此基礎(chǔ)上，本課題進(jìn)一步探討了大黃素逆轉(zhuǎn)胰腺癌耐藥細(xì)胞株Bxpc-3/Gem耐藥的可能分子機(jī)制。

NF-κB是一種普遍存在的核轉(zhuǎn)錄因子，與機(jī)體免疫、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、腫瘤轉(zhuǎn)移等有關(guān)。近些年報(bào)道，NF-κB與腫瘤化療耐藥的產(chǎn)生關(guān)系密切［7］。另有報(bào)道，可通過(guò)下調(diào)NF-κB的表達(dá)量和抑制其轉(zhuǎn)錄活性來(lái)抑制MDR1基因的表達(dá)，最終使P-gp的表達(dá)量和功能下降，從而達(dá)到逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的化療耐藥［8］。NF-κB除了可通過(guò)MDR1參與耐藥的產(chǎn)生與進(jìn)展外，還可以通過(guò)其它途徑參與［9］。因此，NF-κB在腫瘤化療耐藥的形成中起著重要的作用，其可以通過(guò)多種機(jī)制參與腫瘤化療耐藥的形成。本研究運(yùn)用RT-PCR方法從基因水平檢測(cè)NF-κB，并用EMSA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NF-κB的活性，發(fā)現(xiàn)大黃素組及聯(lián)合吉西他濱組NF-κB的表達(dá)及活性明顯降低。由此推測(cè)大黃素可通過(guò)下調(diào)NF-κB的表達(dá)及抑制其活性，參與逆轉(zhuǎn)胰腺癌耐藥細(xì)胞株對(duì)吉西他濱的耐藥作用。

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